石榴花水提物調節AHR/BNIP3 改善糖尿病小鼠肝臟胰島素信號

葉雨萌，榮 雨，李包娟，周克春，張?之

（新疆醫科大學藥學院，新疆烏魯木齊 830000）

糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）是由胰島素分泌缺陷或胰島素抵抗導致的，以長期高血糖為特征的代謝紊亂性疾病，主要分為1 型糖尿病和2 型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM），其中T2DM 占整個糖尿病比例的 90% 左右。T2DM 是一種以胰島素抵抗（insulin resistance，IR）為特征的非傳染性疾病，目前全球患病率呈逐年上升，嚴重影響人們的身心健康，已成為世界性公共衛生難題[1-2]。長期營養過剩會引起全身脂質代謝失衡，促進肝臟對血脂的攝取，肝臟脂肪積累增加可能損害胰島素信號傳導和誘導IR[3]。研究表明，肝臟內芳香烴受體（aromatic hydrocarbon receptor，AhR）和磷脂酰乙醇胺N-甲基轉移酶（ phosphatidylethanolamine N-methyltransferase，PEMT）的過表達會引起脂質沉積，進一步阻斷肝臟胰島素信號通路轉導[4-6]。Bcl-2/腺病毒E1B-19kDa相互作用蛋白3（Bcl-2/adenovirus E1B19-kDa interacting protein 3，BNIP3）與慢性肝損傷和代謝紊亂密切相關，缺失BNIP3 會加劇胰島素抵抗及代謝綜合征[7]。已有研究發現，AhR 能夠通過調節BNIP3 減輕線粒體活性氧的產生，恢復肝臟功能性有絲分裂[8]。本研究提出AHR 有望通過調節BNIP3 進而改善高脂飲食引發的胰島素抵抗。目前糖尿病治療藥物包括雙胍類、格列奈類、磺脲類等，盡管可以較好地控制血糖水平，但伴隨刺激胃腸道及損害肝腎器官等副作用。傳統中藥在預防和改善T2DM 方面表現出刺激性小、多靶點、多途徑的優勢[9]，因此，開發藥食同源的天然活性物質在T2DM 治療上具有重要意義。

石榴是新疆特色藥食兩用植物，石榴花是石榴的干燥花瓣，民間常吃石榴花用于美容養顏、潤肺止咳，養陰生津等[10-11]；現代研究表明石榴花具有降血糖、抗炎、保護肝臟等藥理作用[12]，能治療肺結核、中耳炎等多種疾病[13]。李彤等[14-15]研究發現，石榴花水提物能夠改善3T3-L1 前脂肪細胞胰島素抵抗。但石榴花水提物改善T2DM 小鼠肝臟胰島素信號通路與調節肝臟脂質代謝靶點的關系尚待深入研究，本研究旨從AhR/BNIP3 途徑調節肝臟脂質代謝探究石榴花水提物改善胰島素信號通路的機制，以期為石榴花防治糖尿病提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

50 只SPF 級雄性C57BL /6J 小鼠，體重范圍（18～22）g 由新疆醫科大學動物中心提供，動物許可證號SCXK（新）2018-0003；二甲雙胍片Met 批號170921，規格0.25 g/片，北京京豐制藥有限公司；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ） 純度≥98%， 批號S0130， 默克Sigma 公司；高脂飼料 南通特洛菲飼料科技有限公司；石榴花水提取物（批號 QA 20210822） 西安瑞爾麗生物工程有限公司；總膽固醇試劑盒 TC Lot 20220412、甘油三酯試劑盒 TG Lot 20220412 南京建成生物工程研究所；ELISA胰島素試劑盒Mouse INS ELISA KIT Lot 202207上海SinoBest；兔抗小鼠PEMT（批號 55000167 34）、兔抗小鼠 AhR（批號 5500016015） ABclonal公司；PVDF 膜（批號 48659900） Roche 公司；兔抗小鼠 p-IRS1（Ser307）（批號 #35j4174） 優寧維生物公司；BCA 蛋白定量試劑盒（批號 15A022）、超敏ECL 化學發光試劑盒（批號 09A062）、兔抗小鼠AKT（批號 N12150003）、兔抗小鼠 p-AKT（Ser473）（批號 R01044074）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶 GAPDH（批號 N0607114）、IRS1（批號 M11303123）、兔抗小鼠 GSK3β（批號 N12301456）、兔抗小鼠 p-GSK3β（S9）（批號 N09213518）、兔抗小鼠 BNIP3（批號 R0116 1139）、HRP 標記山羊抗兔IgG（H+L）（批號 04A 032）、磷酸酶抑制劑（批號 18A112） 沈陽萬類公司。

KZ-III-FP 型研磨儀 武漢賽維爾生物科技有限公司；AB106-N 型XS205DU 分析天平 梅特勒-托利多儀器公司；Multiskan GO 1.01.12 酶標儀 賽默飛世爾上海儀器有限公司；MULITIFUGE X3R 型低溫冷凍離心機 德國Eppendorf 公司；血糖儀 羅氏診斷產品有限公司；電泳儀 美國BIORAD 公司；Eclipse Ni-U 型光學顯微鏡 尼康儀器有限公司；Azure 600 多功能分子成像系統 美國Azure Biosystems 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型制備及分組干預 C57BL/6J 小鼠50 只，本實驗經過新疆醫科大學實驗動物中心倫審委員會批準，倫審號：IACUC-20220308-14，適應性3 d，按體重隨機分10 只為正常組（Normal）喂普通飼料，其余給予60%高脂飼料喂養6 周后，禁食不禁水12 h后按85 mg/kg 劑量腹腔注射2 次STZ，每次間隔3 d，正常組腹腔注射同體積檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。72 h 后，小鼠禁食不禁水8 h，尾尖采血測空腹血糖（fasting blood glucose，FBG），以FBG＞11.1 mmol/L為造模成功，按空腹血糖值排序，每組均勻分配每區間血糖值對應小鼠，按血糖平行可比原則進行分組，最后每組8 只。分別為模型組（Model）、陽性對照二甲雙胍組（Met）、石榴花水提物低劑量組（PFWL）和石榴花水提物高劑量組（PFWH）。正常組與模型組給予等劑量飲用水，陽性對照二甲雙胍組給予劑量為150 mg/kg 進行干預，石榴花水提物低劑量組和石榴花水提物高劑量組給予劑量分別為200、400 mg/kg進行干預，所有組每天上午10:00 灌胃給藥1 次，連續干預11 周。

1.2.2 血漿及組織樣本的收集 藥物干預 11 周后，小鼠禁食不禁水 8 h，稱小鼠體重，測小鼠空腹血糖FBG，腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉麻醉，眼眶取血，4 ℃、3000 r/min 離心15 min，吸取上層血漿。頸部脫臼，摘取肝臟組織拍照并稱重，一部分肝臟組織4%多聚甲醛固定，剩余肝臟組織于-80 ℃保存。

1.2.3 肝臟指數計算 根據1.2.2 中得到的小鼠體重及肝臟組織重量計算肝臟指數：

1.2.4 血清生化指標測定 取1.2.2 方法所得血漿，按試劑盒步驟檢測TG、TC、INS 指標，并根據說明書方法操作及計算公式測定小鼠血清中TC、TG、INS 的含量。

1.2.5 蘇木素-伊紅（HE）染色 取4%多聚甲醛溶液固定的肝臟組織進行石蠟包埋，切片，按試劑盒步驟HE 染色，在顯微鏡下觀察并進行圖像采集。

1.2.6 Western blotting 法檢測 取肝臟組織，按比例加入RIPA 蛋白裂解液并研磨，12000 r/min 離心15 min 取上清，按BCA 說明書法測濃度，制備SDSPAGE 凝膠進行電泳，結束后冰浴轉至PVDF 膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，配制磷酸化胰島素受體底物1（p-IRS1 Ser307）（1:2000）、胰島素受體底物1（IRS1）（1:500）、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt Ser473）（1:1000）、蛋白激酶B（Akt）（1:1000）、糖原合成酶激酶-3β（Gsk3β）（1:500）、磷酸化糖原合成酶激酶-3β（p-Gsk3βS9）（1:1500）、芳香烴受體（AhR）（1:1000）、Bcl-2/腺病毒E1B-19kDa 相互作用蛋白3（BNIP3）（1:500）、磷脂酰乙醇胺N-甲基轉移酶（PEMT）（1:3000）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）（1:1000）一抗4 ℃孵育過夜，0.1%TBST 洗膜，二抗lg G-HRP（1:5000）室溫孵育120 min，0.1%TBST 洗膜，化學發光液顯影成像。采用Image J 分析，以GAPDH 為內參，計算各目的蛋白相對表達量。

1.3 數據處理

所有數據采用SPSS 22.0 軟件進行統計分析。符合正態分布的方差齊性采用單因素方差分析（One way ANOVA）和方差齊性采用最小顯著差數（LSD）法檢測組間差異比較；不符合正態分布和方差齊性采用秩和檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。圖像數據處理與分析采用Image J 和Prism GraphPad 8.3軟件。

2 結果與分析

2.1 PFW 對T2DM 小鼠體重、肝重、肝臟指數的影響

如表1 所示，與正常小鼠肝臟比較，糖尿病模型小鼠肝重、肝臟指數極顯著增加（P＜0.01）；與糖尿病模型小鼠比較，石榴花水提物高劑量組肝重、肝臟指數均顯著降低（P＜0.01，P＜0.05），二甲雙胍組肝重、肝臟指數極顯著降低（P＜0.01）；與二甲雙胍組比較，石榴花水提物低劑量組和石榴花高劑量組沒有統計學差異（P＞0.05）。石榴花水提物能夠減輕因高脂飲食引起的肝臟組織重量增加，且劑量相對越高，效果越好，且石榴花水提物高劑量組作用效果與二甲雙胍組更相近，提示石榴花水提物高劑量改善肝臟指數具有顯著效果。

表1 PFW 對T2DM 小鼠體重、肝重、肝臟指數的影響（±s）Table 1 Effects of pomegranate flower water extract on body weight, liver weight and liver index of type 2 diabetes mice ( ±S)

表1 PFW 對T2DM 小鼠體重、肝重、肝臟指數的影響（±s）Table 1 Effects of pomegranate flower water extract on body weight, liver weight and liver index of type 2 diabetes mice ( ±S)

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；表2同。

組別 體重（g） 肝重（g） 肝臟指數（%）正常組 27.66±3.39 1.18±0.07 4.29±0.41模型組 29.58±4.10 1.59±0.36** 5.33±0.59**二甲雙胍組 30.63±4.76 1.29±0.41## 4.20±0.67##石榴花水提物低劑量組 29.15±2.07 1.3±0.21 4.44±0.83石榴花水提物高劑量組 29.18±2.44 1.26±0.17# 4.31±0.52##

2.2 PFW 對小鼠血漿生化指標的影響

各組小鼠血漿生化指標變化如表2 所示，與正常小鼠血漿比較，糖尿病模型組小鼠血漿FBG、INS、HOMA-IR、TG 和TC 極顯著增加（P＜0.01）；與糖尿病模型小鼠組血漿比較，石榴花水提物低劑量組INS 和TG 顯著降低（P＜0.01，P＜0.05），石榴花水提物高劑量組FBG、INS、HOMA-IR、TG 和TC 均極顯著降低（P＜0.01），二甲雙胍組FBG、INS、HOMA-IR、TG 和TC 極顯著降低（P＜0.01）；與二甲雙胍組比較，石榴花水提物高劑量組沒有統計學差異（P＞0.05），石榴花水提物高劑量組與二甲雙胍組藥效數據相接近。

表2 PFW 對T2DM 小鼠FBG、INS、HOMA-IR、TG、TC 的影響（ ±S）Table 2 Effects of pomegranate flower water extract on FBG, INS, HOMA-IR, TG, TC in type 2 diabetes mice ( ±S)

表2 PFW 對T2DM 小鼠FBG、INS、HOMA-IR、TG、TC 的影響（ ±S）Table 2 Effects of pomegranate flower water extract on FBG, INS, HOMA-IR, TG, TC in type 2 diabetes mice ( ±S)

組別 FBG（mmol·L-1） INS（mIU·L-1） HOMA-IR TG（mmol/L） TC（mmol/L）正常組 6.4±0.77 5.22±1.02 1.50±0.45 0.65±0.033 3.79±0.32模型組 24.67±3.68** 13.54±1.20** 14.88±2.77** 1.37±0.10** 7.74±0.64**二甲雙胍組 12.91±2.15## 7.78±1.02## 4.42±0.64## 0.84±0.093## 4.44±0.11##石榴花水提物低劑量組 23.03±3.88 10.99±0.95## 13.11±2.23 1.14±0.11# 7.09±0.36石榴花水提物高劑量組 16.57±3.48## 9.87±0.17## 7.27±1.48## 0.90±0.057## 5.23±0.35##

2.3 PFW 對T2DM 小鼠肝臟外觀形態與肝臟組織病理結構的影響

各組小鼠肝臟外觀形態變化如圖1 所示，與正常組小鼠肝臟比較，高脂誘導的糖尿病模型小鼠肝臟顏色呈土黃色、體積較大、質地較軟、表面油膩顆粒感較重；與模型組小鼠肝臟比較，二甲雙胍組、石榴花水提物低劑量組和石榴花水提物高劑量組肝臟顏色較紅，邊緣較銳化，體積減小，表面油膩感減輕，提示石榴花水提物能夠減輕T2DM 小鼠的肝臟油膩顆粒感，可能減少了肝臟脂質堆積。各組小鼠肝臟組織病理結構變化如圖2 所示，正常小鼠肝臟組織內細胞結構正常完整，肝小葉、肝索、肝竇整齊，門區三管結構清晰，未見脂滴和病變；與正常小鼠肝臟組織比較，糖尿病模型小鼠肝組織中觀察到嚴重的脂肪變性，肝細胞內含有大量的脂肪滴，且有部分淤血這表明該模型成功建立；與糖尿病模型小鼠肝組織比較，二甲雙胍組、石榴花水提物低劑量組和石榴花水提物高劑量組肝組織輕度脂肪變性，脂肪滴明顯數量減少且體積變小，肝組織病理學觀察結果與肝臟外觀結果一致；與二甲雙胍組比較，石榴花水提物高劑量組脂肪滴明顯減少，進一步證實了石榴花水提物有改善肝臟脂質沉積的作用。

圖1 PFW 對T2DM 小鼠肝臟外觀形態的影響Fig.1 Effect of pomegranate flower water extract on liver appearance and morphology of type 2 diabetes mice

圖2 PFW 對T2DM 小鼠肝臟組織病理結構的影響（HE， 400×）Fig.2 Effect of pomegranate flower water extract on liver histopathological structure in type 2 diabetes mice (HE，400×)

2.4 PFW 對T2DM 小鼠肝臟胰島素信號通路蛋白的影響

與正常小鼠肝臟比較，糖尿病模型小鼠肝臟IRS1、p-Akt（Ser473）/Akt、p-GSK3β（S9）/GSK3β蛋白表達量極顯著降低（P＜0.01），p-IRS1（Ser307）/IRS1 蛋白表達量極顯著升高（P＜0.01）；與糖尿病模型小鼠比較，二甲雙胍組、石榴花水提物低劑量組和石榴花水提物高劑量組IRS1、p-Akt（Ser473）/Akt、p-GSK3β（S9）/GSK3β蛋白表達量顯著升高（P＜0.01，P＜0.05），二甲雙胍組、石榴花水提物低劑量組和石榴花水提物高劑量組p-IRS1（Ser307）/IRS1 蛋白表達量顯著降低（P＜0.01，P＜0.05）；與二甲雙胍組比較，石榴花水提物低劑量組和石榴花水提物高劑量組未見統計學差異（P＞0.05）。結果說明石榴花水提物可以使p-IRS1（Ser307）/p-AKT（Ser473）/p-GSK3β（S9）胰島素通路信號轉導通暢（圖3～圖4）。

圖3 PFW 對T2DM 小鼠肝臟胰島素信號通路相關蛋白條帶圖的影響（ ±S）Fig.3 Effect of pomegranate flower water extract on protein banding of insulin signal pathway in liver of type 2 diabetes mice ( ±S)

圖4 PFW 對T2DM 小鼠肝臟胰島素信號通路相關蛋白表達的影響（ ±S）Fig.4 Effect of pomegranate flower water extract on the expression of insulin signal pathway related proteins in liver of type 2 diabetes mice ( ±S)

2.5 PFW 對T2DM 小鼠肝臟AhR、BNIP3、PEMT蛋白的影響

如圖5 所示，與正常小鼠肝臟比較，糖尿病模型小鼠肝臟AhR、PEMT 蛋白表達量極顯著升高（P＜0.01），BNIP3 蛋白表達量極顯著降低（P＜0.01）；與糖尿病模型小鼠肝臟比較，二甲雙胍組和石榴花水提物高劑量組AhR、PEMT 蛋白表達量顯著降低（P＜0.01，P＜0.05），BNIP3 蛋白表達量極顯著升高（P＜0.01）；與二甲雙胍組比較，石榴花水提物高劑量組未見統計學差異（P＞0.05）。結果表明，石榴花水提物可以降低AhR 和PEMT 蛋白的表達，升高BNIP3 的表達，石榴花水提物可能通過抑制AhR 的表達，來激活BNIP3 的表達，從而改善肝臟脂質。

圖5 PFW 對T2DM 小鼠肝臟AhR、BNIP3、PEMT 蛋白的影響（ ±S）Fig.5 Effects of pomegranate flower water extract on AhR, BNIP3 and PEMT protein in liver of type 2 diabetes mice ( ±S)

3 討論與結論

糖尿病作為一種普遍的慢性代謝性疾病，其發病原因與胰島素抵抗（IR）、肝臟脂質代謝紊亂等密切相關，目前發病率與致死率呈逐年上升的趨勢，嚴重影響著人們的身體健康[16-17]。

胰島素信號轉導受阻是導致2 型糖尿?。═2DM）發病的重要原因之一。已有研究發現，胰島素能與肝臟靶細胞膜上胰島素受體結合并啟動信號傳導通路，激活胰島素受體自身磷酸化，導致其底物磷酸化，進而產生生物學效應[18-19]。IRS1 是胰島素受體酪氨酸激酶的關鍵靶點，是胰島素信號通路連接細胞內外的信號蛋白[20-21]。既往研究發現，IRS1 絲氨酸（Ser307）磷酸化位點會阻礙IRS1 酪氨酸位點磷酸化，IRS1（Ser307）負反饋調節胰島素信號轉導通路[22-23]。本研究發現，石榴花水提物能夠顯著升高IRS1 的表達并抑制IRS1 絲氨酸307 位點的磷酸化（IRSI Ser307），從而促進IRS1 酪氨酸磷酸化，進而促進胰島素信號的下游傳導。AKT 作為胰島素信號傳導中重要的下游分子，通常以p-AKT（Ser473）形式被活化，活化的AKT 在調節脂質代謝、提高胰島素敏感性、降低血糖水平方面發揮重要作用[24-25]。本研究顯示石榴花水提物激活Akt 473 絲氨酸磷酸化位點從而活化Akt，進而調節脂質代謝、改善肝臟胰島素敏感性。GSK-3β作為AKT 的下游信號因子[26]，正常情況下，活化的AKT 會使GSK-3β的Ser9位點磷酸化，從而使GSK-3β失活，促進肝糖原合成，增加葡萄糖的利用率，從而降低血糖[27]。GSK-3β過度表達或激活可導致胰島素缺乏和IR 的發生[28]。本研究發現，石榴花水提物能抑制T2DM 小鼠肝臟GSK3β表達并升高GSK-3βSer9 位點的磷酸化，提示石榴花水提物提高肝臟胰島素敏感性與調控胰島素信號關鍵靶點的磷酸化有關。

脂質代謝與胰島素信號密切相關。已有研究表明活化的AKT 在調節脂質代謝方面發揮重要作用[29-30]，GSK-3β也可調控甘油三酯、膽固醇等含量，在調節脂質沉積中起關鍵作用[31]。本研究顯示石榴花水提物（400 mg/kg）降低甘油三酯、膽固醇、減少肝臟脂質陳沉積的作用與二甲雙胍（150 mg/kg）藥效相近，提示石榴花水提物提高肝臟胰島素敏感性、調控胰島素信號通路與脂質代謝相關的靶點有關。本團隊進一步研究了石榴花水提物對芳香烴受體（AhR）一種介導脂質沉積和胰島素信號傳導功能障礙的關鍵調節蛋白的影響[32]。已知活化的AhR 會誘導以甘油三酯積聚為特征的自發性肝脂肪變性[33]。另外，肝臟中過量的膽固醇積累會進而導致β細胞功能障礙[34]。以往研究發現，小鼠肝臟缺乏AhR 及PEMT 能夠提高胰島素敏感性，肝內AhR 和PEMT的過表達會影響肝臟脂質代謝并導致肝臟IR 的發生[35-36]。此外，BNIP3 可以作為AhR 靶基因介導禁食誘導的肝臟有絲分裂，肝細胞內缺失BNIP3 會導致脂肪生成增加，在高脂肪飲食期間增加有絲分裂活性或BNIP3 的表達對肝臟和線粒體具有保護作用[8,37]。本研究發現石榴花水提物降低肝臟AhR 和PEMT的表達，升高肝臟中BNIP3 表達，因此推測石榴花水提物可能通過抑制AhR 進而促進BNIP3 的表達，從而抑制肝臟脂質生成和沉積，促進胰島素信號通路轉導通暢，已知BNIP3 也與自噬過程有關，推測石榴花水提物促進BNIP3 的表達可能也會有助于清除肝臟中受損的線粒體，從而改善肝臟脂質代謝和胰島素信號。另外，本研究發現二甲雙胍也降低肝臟AhR 和PEMT 的表達，升高肝臟中BNIP3 表達，因此也推測二甲雙胍可能通過抑制AhR 進而促進BNIP3 的表達，從而抑制肝臟脂質生成和沉積，促進胰島素信號通路轉導通暢。

綜上所述，本研究發現石榴花水提物能促進胰島素信號轉導通暢，可能與其調節AhR/BNIP3 途徑改善肝內脂質合成、減少異位脂質積聚，調控胰島素信號關鍵靶點的磷酸化有關。詳細機制值得進一步研究，以期石榴花可以通過調控脂質代謝途徑，防治糖尿病等代謝紊亂疾病提供應用依據。

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