2013—2022年某醫院肺泡灌洗液病原菌分布及耐藥性分析

許超 王笑塵 田磊

華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院檢驗科，武漢 430000

呼吸道的感染大都是多種細菌共同作用的結果，有較高的致死率和發病率，臨床上相關的診斷與治療需要病原學的支持［1］。由于上呼吸道存在很多正常菌群的感染，這使得傳統的痰培養很難得到臨床需要的診斷結果［2］。而在支氣管鏡協助下直接從下呼吸道深部取得的肺泡灌洗液避免了口腔等部位定植菌的污染和干擾，致病菌占比往往較高，能更好地指導臨床的診斷和治療［3］。在全球范圍內，細菌耐藥性已經引起了廣泛關注，細菌的獲得性耐藥往往與抗生素的過度使用有關［4］。若能首先明確病原菌，而后完善其藥敏試驗結果以進行精準治療，能有效減少細菌耐藥性的產生。本研究報道了華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院2013—2022年肺泡灌洗液中檢出的主要病原菌及其耐藥性。

材料與方法

1.菌株

收集2013年1月至2022年12月華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院肺泡灌洗液所培養出的病原菌。

2.菌株的鑒定和藥敏實驗

菌株鑒定采用質譜儀（型號：MALDI Biotyper，德國布魯克公司，型號：AUTOF MS1000，安圖公司），結合細菌自動鑒定系統（型號：VITEK-2 COMPACT，法國梅里埃公司）和吲哚實驗、奧普托辛敏感實驗進行綜合判定。藥敏實驗采用紙片擴散法，肺炎鏈球菌（streptococcus pneumoniae，SPN）體外藥敏實驗采用血水解酪蛋白平皿，肺炎克雷伯菌（klebsiella pneumoniae，KPN）、銅綠假單胞菌（pseudomonas aeruginosa，PAE）、鮑曼不動桿菌（acinetobacter baumanii，ABA）和金黃色葡萄球菌（staphylococcus aureus， SAU）采用水解酪蛋白平皿。頭孢他啶/阿維巴坦和多黏菌素B（Polymyxin B，PloyB）為BIO-KONT溫州市康泰生物科技有限公司產品，其余測試藥敏紙片、E試驗條及培養基均為英國OXOID公司產品。藥敏結果判斷采用2023年CLSI M100標準，PloyB采用國內專家共識，替加環素采用美國食品藥品監督管理局推薦的標準。本研究符合《赫爾辛基宣言》的原則。

3.質量控制

根據2023年CLSI M100標準選擇標準菌株ATCC25922、ATCC25923、ATCC27853、ATCC49619每周做1次室內質量控制，結果合格后開始檢測分析臨床分離病原菌的藥敏試驗。

4.分析方法

分離所得病原菌的分布及藥敏結果的分析采用WHONET5.6版軟件進行，對同一患者分離的相同病原菌，只對第1株菌做體外藥敏分析。

結果

2013年1月至2022年12月共送檢36 233例肺泡灌洗液標本，其中檢出非重復病原菌11 801株，陽性率32.57%。包括革蘭陰性菌8 231株，占比69.75%，革蘭陽性菌1 378株，占比11.68%，真菌2 192株，占比18.57%。其中革蘭陰性菌以KPN、PAE和ABA為主，且KPN在所有致病菌中占比最高，革蘭陽性菌以SAU和SPN為主，真菌以白色念珠菌和煙曲霉為主，所有肺泡灌洗液病原菌的檢出情況見表1。在所有檢出致病菌的患者中，男性均多于女性，且呼吸科和心臟大血管外科占比最多，見表2。

表1 肺泡灌洗液標本的主要病原菌檢出情況[株（%）]

表2 檢出致病菌的患者分布情況[例（%）]

在肺泡灌洗液檢出的革蘭陰性菌中，KPN對哌拉西林，氨芐西林/舒巴坦，頭孢唑啉，頭孢呋辛，頭孢噻肟和環丙沙星的耐藥率均超過40.00%，對阿米卡星，亞胺培南、美羅培南和替加環素敏感性超過70.00%；PAE則對復方新諾明和米諾環素的耐藥率超過50.00%，對其他常見抗生素的敏感性均超過40.00%；而ABA對除米諾環素外的所有抗生素耐藥率均超過75.00%。具體耐藥率和敏感率情況，見表3。

表3 主要革蘭陰性菌對抗菌藥物的耐藥率（%）

在最主要的致病菌KPN中耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistant to klebsiella pneumoniae，CRKPN）的占比整體呈上升趨勢，在2018年和2022年出現下降趨勢，華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院在2020開始對檢出的CRKPN加做頭孢他啶/阿維巴坦和PloyB體外藥敏實驗后，發現耐藥率在15.00%以下，但也出現了逐年上升的趨勢，見表4。

表4 2013—2022年CRKPN占比及其加做藥敏實驗的耐藥性

肺泡灌洗液中分離的SAU對萬古霉素、利奈唑胺和替考拉寧的敏感率均為100.0%。其中，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin resistant Staphylococcus aureus，MRSA）占52.20%，略高于甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌（methicillin-susceptible to staphylococcus aureus，MSSA），MRSA對除復方新諾明外的抗生素均相較于MSSA更加耐藥，具體耐藥率和敏感率情況，見表5。

表5 金黃色葡萄球菌對抗菌藥物的敏感率與耐藥率（%）

肺泡灌洗液中分離的SPN對萬古霉素和莫西沙星的敏感率均為100.0%，對紅霉素和克林霉素的耐藥率超過85.0%。其中，青霉素敏感肺炎鏈球菌（penicillin-susceptible to streptococcus pneumoniae，PSSP）占95.32%，遠高于青霉素中介肺炎鏈球菌（penicillin-mediated Streptococcus pneumoniae，PISP）和青霉素耐藥肺炎鏈球菌（penicillin-resistant Streptococcus pneumoniae，PRSP），具體耐藥率和敏感率情況，見表6。

表6 肺炎鏈球菌對抗菌藥物的敏感率與耐藥率（%）

討論

本研究顯示，在2013—2022年，華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院送檢的肺泡灌洗液培養結果中，致病菌以革蘭陰性菌為主，且革蘭陰性菌的占比呈逐年上升趨勢，與楊青等［5］結果相同，真菌次之，革蘭陽性菌占比最低。在革蘭陰性菌中，KPN、PAE和ABA的占比較高，與全國耐藥細菌監測網結果一致［6］。其中，KPN的占比在所有致病菌中最高，且呈整體上升趨勢。在革蘭陽性菌中以SAU和SPN占比較高，也與全國耐藥細菌監測網結果一致［6］。其中，SAU占比每一年均為最高。在真菌中每一年占比最高的均為白色念珠菌。

在主要的革蘭陰性致病菌中，KPN對青霉素類、第二代頭孢、第三代頭孢和喹諾酮類抗生素較為耐藥，而對氨基糖苷類、碳青霉烯類和四環素類抗生素較為敏感。這可能與臨床上長期大量使用第二代頭孢、第三代頭孢和喹諾酮類抗生素有關，長期使用可能造成耐藥的產生。所以，臨床上對于KPN可優先使用氨基糖胺類、碳青霉烯類和四環素類抗生素，以此節約治療時間。PAE的耐藥機制一般不是單個因素造成的，而是由多種機制相互協同的結果，耐藥機制非常復雜［7］。同一種抗生素的長時間使用有可能導致其耐藥情況的發生，對于PAE感染的患者應隨時根據其臨床癥狀以及藥敏結果適當調整藥物的使用，以此降低PAE產生耐藥的概率。本研究中發現PAE第三代頭孢、第四代頭孢和氨基糖苷類抗生素均較為敏感，臨床可以優先選擇使用。PAE可以在環境中長期存在并且形成生物被膜，在臨床工作中應嚴格執行接觸隔離和環境消毒。ABA對所有抗生素耐藥率均較高，相比之下米諾環素耐藥率較低。本研究結果發現，ABA對亞胺培南（86.8%）和美羅培南（82.5%）的耐藥率高于全國耐藥監測網的水平（80.4%）［6］。ABA等非發酵菌可以在環境中長期存在并定殖，且耐藥率高，在臨床中需要更加關注操作的規范性及抗生素應用的合理性。針對抗ABA治療，相關指南推薦舒巴坦復方制劑以及米諾環素等多種藥物聯合使用，或者以碳青霉烯類阿米卡星為基礎聯合替加環素和將PloyB作為基礎用藥的方案［8-9］。

在對CRPKN的逐年分析中發現CRKPN的占比越來越高，呈整體上升趨勢，這可能與抗生素的大量使用有關［10］。在2017年和2021年，華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院發現CRKPN的占比較高時，分別于2018年對手術科室新入院患者進行CRE的篩查工作，并對篩查陽性患者進行隔離措施，于2022年加強了臨床科室的衛生宣教和CRE的篩查力度。結果發現，在2018年和2022年CRKPN的占比明顯下降，說明對CRE的篩查隔離工作和臨床科室的衛生宣教能有效減少CRKPN的產生。在CRKPN的治療中，由于一線抗生素使用的失敗，CRKPN相關的細菌感染已經成為了威脅人類健康的重要因素［11-12］?！吨袊记嗝瓜┠退幠c桿菌科細菌感染診治與防控專家共識》［13］建議對將頭孢他啶/阿維巴坦作為CRKPN肺炎患者的首選治療方案，國外也有專家推薦將頭孢他啶/阿維巴坦作為碳青霉烯類抗生素的替代抗生素以及PloyB加替加環素作為CRKPN的一線治療抗生素［14-15］。CRKPN的主要耐藥機制是產碳青霉烯酶，有研究表明產肺炎克雷伯碳青霉烯酶和苯唑西林酶的KPN對頭孢他啶/阿維巴坦敏感，而產新德里金屬酶β-內酰胺酶的KPN對頭孢他啶/阿維巴坦耐藥［16-17］。PloyB由于腎毒性高，且有其他替代抗生素的存在，在上世紀70年代臨床上就使用較少了［18］。近年來，由于多重耐藥的廣泛存在和新型抗生素的開發周期長兩個因素，使得PloyB又重新被臨床上使用，并成為了革蘭陰性菌多重耐藥的主要抗菌藥物，有研究表明多黏菌素B的耐藥機制與脂多糖的修飾有關［19-20］。在2020年開始，本院對CRKPN加做頭孢他啶/阿維巴坦和PloyB的體外藥敏試驗，2020—2022年結果顯示，CRKPN對頭孢他啶/阿維巴坦和PloyB的耐藥率均在15.0%以下，但這3年耐藥率也呈上升趨勢，表明臨床須對此類更高級別抗生素的使用更加規范，以避免耐藥性的增長。

本研究中未發現對萬古霉素、利奈唑胺和替考拉寧耐藥的SAU，MRSA的占比高于MSSA的占比，MRSA對大部分抗生素的敏感性相較于MSSA更差，抗感染治療難度更大。在對SAU的治療方面，臨床可以優先使用復方新諾明、替加環素、萬古霉素、利奈唑胺和替考拉寧。本研究中所有SPN對萬古霉素和莫西沙星均敏感，且絕大多數為PSSP。SPN對紅霉素和克林霉素敏感性較差，其中PSSP比PISP、PRSP對左氧氟沙星和頭孢曲松的敏感性更好，抗感染治療時的難度更小。在SPN的治療中，可以盡量避免紅霉素和克林霉素的使用。同時，由于PISP和PRSP的發現較少，對PISP和PRSP的結果報告應更加謹慎。

真菌常常寄生在人體皮膚表面或呼吸道黏膜處，多為條件致病菌，正常情況下不致?。?1］。本次檢出的真菌中較多的是白色念珠菌和煙曲霉。念珠菌常常與人共生，其感染引起的肺炎發生概率較低，煙曲霉在通過呼吸道入侵到人體時多能被呼吸道黏膜處的免疫細胞所識別并及時清除，煙曲霉致病多發生在免疫功能低下的患者［22-23］。臨床上一般將在患者肺泡灌洗液中檢出的念珠菌等真菌考慮為呼吸道定植菌，認為其并沒有診斷意義，所以對于檢出的真菌并未常規做藥敏分析［24］。然而，從2020年以來，本院白色念珠菌和曲霉屬真菌等真菌的檢出較之前有較大增長，且近年來真菌感染及產生耐藥的案例時有發生，故臨床應提高對真菌感染的重視［25］。新型隱球菌是一種條件致病菌，可存在于人體表與腸道等處，致病時可引起下呼吸道或中樞神經系統感染，其在腦脊液檢出時往往更具有臨床意義［26］。本次研究肺泡灌洗液中共檢出3例新型隱球菌感染，且患者均肺部癥狀不明顯，故未作相關藥敏分析。本研究存在一定的局限性，由于每年的收樣數量并不一致，近幾年的收樣數量高于之前，故最后統計的結論并不能很準確地反映這十年的整體情況。

綜上所述，華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院2013年1月至2022年12月送檢的所有肺泡灌洗液中，檢出病原菌主要為KPN、PAE、ABA和SAU等，以革蘭陰性菌居多，且CRKPN的占比和耐藥率呈逐年上升趨勢。提示臨床應合理應用藥物，以防范更加廣泛的耐藥細菌產生。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明許超：研究設計與實施、數據采集與分析、文章撰寫、對文章的知識性內容作批評性審閱；王笑塵：文章修改、研究設計、統計分析、對文章的知識性內容作批評性審閱；田磊：文章修改、研究設計和實施、指導