凝結芽孢桿菌培養液及其離心上清液、菌懸液的抑菌性能研究

■ 王雪艷 王乙茹 黃遵錫 陳德近 周安樹 何 雪 安清聰 程志斌*

(1.云南農業大學動物科學技術學院，云南 昆明 650201；2.達州職業技術學院，四川 達州 635001；3.云南師范大學生命科學學院，云南 昆明 650222；4.愛科特生物工程(昆明)有限公司，云南 昆明 650506)

大量體內外試驗及綜述表明，抑菌性能是飼用凝結芽孢桿菌平衡或調控畜禽腸道菌群、改善生產性能的重要作用機制之一[1-7]。體外菌株的抑菌性能評估可用于高效篩選優質飼用凝結芽孢桿菌產品，常用方法是牛津杯抑菌試驗法。然而，當前凝結芽孢桿菌體外牛津杯抑菌試驗操作尚無國家標準，造成不同研究報道的抑菌圈直徑值及其代表的抑菌作用差異較大，這在本課題組前期綜述已有描述。本文推測，除了不同研究中凝結芽孢桿菌菌株的差異外，牛津杯體外抑菌的很多操作步驟對抑菌圈直徑有影響，分析如下：①凝結芽孢桿菌培養液及其處理方式。絕大多數牛津杯抑菌試驗操作，均在牛津杯中直接注入凝結芽孢桿菌培養液。隨著凝結芽孢桿菌分泌抗菌肽類物質的抑菌機制逐步清晰[8-10]，近年來有少量研究將凝結芽孢桿菌培養液進行前處理，并比較凝結芽孢桿菌培養液、培養液離心后的上清液、培養液離心后的底層菌懸液之間抑菌性能的差異，以期獲得客觀、真實的體外抑菌結果[11-12]。然而令人遺憾的是，目前少量的報道結果有較大差異。②凝結芽孢桿菌培養液的pH。很多綜述文章提示，凝結芽孢桿菌分泌乳酸等酸性物質，而乳酸等酸性物質具有抑菌性能，這也可能是凝結芽孢桿菌抑菌作用機制之一[13-14]。然而，這一假設并無更多的體內外試驗驗證，這不利于支撐飼用凝結芽孢桿菌在畜禽胃腸道不同pH 環境下，調控腸道菌群的作用效果。

鑒于此，本試驗參照畜禽胃腸道pH環境，比較研究了凝結芽孢桿菌培養液及其離心上清液、菌懸液在不同pH條件下對3個腸道有害菌的抑菌作用，為規范凝結芽孢桿菌牛津杯抑菌法的操作提供科學依據，為科學、準確地評估凝結芽孢桿菌體外抑菌性能提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

凝結芽孢桿菌（菌株編號為YNAU 3127）由課題組前期從云南當地品種“大河豬”腸道中分離[15-17]。牛津杯體外抑菌試驗的指示菌豬霍亂沙門氏菌（S.choleraesuisBNCC186354）、雞白痢沙門氏菌（S.pullorumBNCC124693）、大腸桿菌K88（E.coliCGMCC1.2385）購買于北納創聯生物科技有限公司。

1.2 試驗設計

針對可能影響凝結芽孢桿菌牛津杯法體外抑菌作用的兩個因素（菌液的處理、菌液的pH），試驗設計了主效應因素（菌液的處理）和次效應因素（菌液的pH）進行研究。①主效應設計4 個處理組，對照組（無菌蒸餾水, sterile distilled water，SDW組）、凝結芽孢桿菌培養液組（B.coagulansculture solution，BCS組）、凝結芽孢桿菌培養液離心后的上清液組（centrifuged supernatant ofB.coagulansculture solution, CSS 組）、凝結芽孢桿菌培養液離心后的底層菌懸液組（centrifuged bacterial suspension ofB.coagulansculture solution, CBS 組）；②次效應參照畜禽胃腸道pH，設計pH 2.5、4.0、5.5、7.0條件下，檢測4個處理組對3個腸道有害菌指示菌的體外抑制作用。

1.3 牛津杯抑菌試驗

1.3.1 BCS組、CSS組、CBS組的制備

1.3.1.1 制備凝結芽孢桿菌菌液采用改良MRS 培養基，有氧培養凝結芽孢桿菌24 h[15-16]，制備凝結芽孢桿菌菌液180 mL。

1.3.1.2 調整凝結芽孢桿菌菌液的pH

將180 mL分為4份（每份45 mL），裝于4個50 mL無菌離心管。依據菌液初始pH（實測pH 為4.7±0.1），用乳酸和NaOH 依次將4 個離心管的菌液pH 調為2.5、4.0、5.5、7.0。

1.3.1.3 制備凝結芽孢桿菌的BCS組、CSS組、CBS組

調完pH 后，從4 個離心管中各取5 mL，裝入4 個EP管中，作為BCS組。隨后，將4個離心管剩余菌液高速離心處理（10 000 r/min、15 min），上清液移出裝入4 個EP 管，作為CSS 組。同時，底層的懸濁液（＞600 μL）盡量移出，作為CBS 組。制備好的BCS 組、CSS 組、CBS組放于4 ℃冰箱中備用。

1.3.2 SDW組的制備

取4 等份無菌蒸餾水，置于滅過菌的EP 管中，分別調節pH 至2.5、4.0、5.5、7.0，作為SDW 組，于4 ℃冰箱中備用。

為了全面提高柳林縣鄉鎮抗旱應急能力，保障嚴重干旱年城鄉用水安全，推進構建與經濟社會可持續發展相適應的抗旱減災體系，為全縣經濟轉型發展、跨越發展、和諧發展打造良好用水環境，提供有力水資源支撐，根據國家水利部組織編制的《抗旱規劃實施方案（2013—2017年）》大綱和省、市水利部門統一安排，結合柳林縣實際，縣水利局制定了《柳林縣抗旱規劃實施方案》。

1.3.3 指示菌涂布平板的制備

指示菌涂布平板的制備參考前期報道[18]。3個指示菌豬霍亂沙門氏菌、雞白痢沙門氏菌、大腸桿菌采用LB 培養基，有氧培養24 h。隨后，從3 個指示菌培養液中各取800 μL，加入裝有7.2 mL 蒸餾水的EP 管中。以上操作重復2 次，逐次稀釋至10-2。進一步從10-2菌液中吸取200 μL，涂布于MRS 培養基平板上，每個指示菌涂3個平板。

平板靜置15 min 后，即可用于抑菌圈直徑（diameter of inhibition zone，DIZ）的測定。以上操作重復3次。

1.3.4 抑菌圈直徑測定方法

每個平板上放置4 個牛津杯，牛津杯中依次加入的200 μL 的SDW、CSS、BCS、CBS，隨后平板于37 ℃恒溫培養箱中培養。12 h后取出平板，用游標卡尺測定DIZ值[15]。

以DIZ 值判定抑菌作用（見表1）[15]，評估主效應及次效應對凝結芽孢桿菌體外抑菌作用的影響，確定凝結芽孢桿菌牛津杯法體外抑菌試驗的合理操作。

表1 抑菌作用的判定標準[15]

1.4 統計分析

同一個pH 條件下，對菌液處理的3 個處理組（BCS、CSS、CBS 組）及無菌蒸餾水的對照組（SDW組），進行抑菌圈直徑數據的單因素方差分析和LSD多重比較；對同一處理組，在不同pH 條件下測定的抑菌圈直徑數據，進行單因素方差分析和LSD 多重比較。統計軟件為SPSS 21.0，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 BCS 組、CSS 組、CBS 組在不同pH 條件下對豬霍亂沙門氏菌的抑制作用

由表2 和圖1 結果可知，pH 4.0、5.5、7.0 條件下，BCS 組和CBS 組對豬霍亂沙門氏菌均有抑制作用，且CBS 組抑制效果顯著大于BCS 組（P＜0.05）。CSS 組在pH 4.0 條件下，對豬霍亂沙門氏菌有抑制作用（敏感），但在pH 5.5 和7.0 時均無抑制作用（不敏感）。SDW 組在pH 4.0、5.5 和7.0 時，對豬霍亂沙門氏菌均無抑制作用（不敏感）。此外，pH 2.5條件下，4個處理組對豬霍亂沙門氏菌有強抑制作用（高敏感），BCS、CSS、CBS 3 組之間抑制效果差異不顯著，且抑制作用均顯著大于SDW組（P＜0.05）。

圖1 BCS組、CSS組、CBS組在不同pH條件下對豬霍亂沙門氏菌的抑制作用

表2 BCS組、CSS組、CBS組在不同pH條件下對豬霍亂沙門氏菌的抑制作用(DIZ值, mm)

2.2 BCS 組、CSS 組、CBS 組在不同pH 條件下對雞白痢沙門氏菌的抑制作用

表3 和圖2 結果可知，pH 4.0、5.5、7.0 條件下，BCS 組和CBS 組對雞白痢沙門氏菌均有抑制作用（敏感），且CBS 組抑制效果顯著大于BCS 組（P＜0.05）。CSS 組在pH 4.0 條件下，對雞白痢沙門氏菌有抑制作用（敏感），但在pH 5.5 和7.0 時均無抑制作用（不敏感）。SDW 組在pH 4.0、5.5和7.0時，對雞白痢沙門氏菌均無抑制作用（不敏感）。此外，pH 2.5條件下，4個處理組對雞白痢沙門氏菌有強抑制作用（高敏感），BCS、CSS、CBS 3組之間抑制效果差異不顯著，且抑制作用均顯著大于SDW組（P＜0.05）。

圖2 BCS組、CSS組、CBS組在不同pH條件下對雞白痢沙門氏菌的抑制作用

表3 BCS組、CSS組、CBS組在不同pH條件下對雞白痢沙門氏菌的抑制作用(DIZ值，mm)

2.3 BCS 組、CSS 組、CBS 組在不同pH 條件下對大腸桿菌K88的抑制作用

表4 和圖3 結果可知，pH 4.0、5.5、7.0 條件下，BCS 組和CBS 組對大腸桿菌K88 均有抑制作用（敏感），且CBS 組抑制效果顯著大于BCS 組（P＜0.05）。CSS 組在pH 4.0 條件下，對大腸桿菌K88 有抑制作用（敏感），但在pH 5.5和7.0時均無抑制作用（不敏感）。SDW 組在pH 4.0、5.5 和7.0 時，對大腸桿菌K88 均無抑制作用（不敏感）。此外，pH2.5 條件下，4 個處理組對大腸桿菌K88 有強抑制作用（高敏感），BCS、CSS、CBS 3 組之間抑制效果差異不顯著，且抑制作用均顯著大于SDW組（P＜0.05）。

圖3 BCS組、CSS組、CBS組在不同pH條件下對大腸桿菌K88的抑制作用

表4 BCS組、CSS組、CBS組在不同pH條件下對大腸桿菌K88的抑制作用(DIZ值, mm)

3 討論

現有凝結芽孢桿菌體外牛津杯抑菌試驗報道中，大部分操作是將凝結芽孢桿菌培養液（BCS）直接注入牛津杯，檢測抑菌圈直徑來表征抑菌作用的強弱[16-20]，但少量報道是用培養液的離心上清液(CSS)注入牛津杯，檢測抑菌圈直徑[21-23]。鑒于這一試驗操作差異，劉冬梅等[11]和林松泉等[12]比較了凝結芽孢桿菌培養液(BCS)及其離心處理的上清液(CSS)、菌懸液(CBS)抑菌效果差異。劉冬梅等[11]研究顯示，凝結芽孢桿菌抑菌性能“CSS組顯著強于CBS組，CSS＞CBS”；林松泉等[12]進一步報道，凝結芽孢桿菌抑菌性能“CSS＞BCS＞CBS”。以上結果與本研究凝結芽孢桿菌對3 個指示菌的綜合（pH 為4.0～7.0）抑菌性能“CBS組＞BCS組＞CSS組”矛盾。

很多試驗研究證明，凝結芽孢桿菌培養液中含有多種高分子抗菌蛋白和（或）肽類抑菌物質[9-10，24]，是凝結芽孢桿菌發揮抑菌作用的關鍵。眾所周知，培養液中均勻分布的蛋白質或肽類物質，在高速離心作用下，會更多地向離心管底部聚集。因此，理論上若僅考慮凝結芽孢桿菌所分泌的抗菌蛋白或抗菌肽濃度對抑菌性能的影響，抑菌性能“CBS＞BCS＞CSS”是合理的，這也與本試驗主效應的研究結果相符。此外，考慮到離心操作設備及參數帶來的可能差異，本研究建議直接用培養液（BCS）開展凝結芽孢桿菌牛津杯體外抑菌試驗。

除高分子抗菌蛋白和（或）肽類抑菌物質外，凝結芽孢桿菌同時分泌乳酸等多種低分子有機酸，也可能是凝結芽孢桿菌體外抑菌、體內調控腸道菌群的作用機制之一[13-14，25]。有機酸中H+能降低pH，理論上有抑制腸道有害菌增殖的作用。鑒于此，本試驗次效應研究，實測了該株凝結芽孢桿菌培養液pH 為4.7 后，將培養液進一步調整為pH 2.5（胃環境）及4.0、5.5、7.0（腸道環境），模擬畜禽胃腸道pH環境，評估H+對凝結芽孢桿菌抑菌性能的影響，為飼用凝結芽孢桿菌對畜禽胃腸道菌群的調控效果提供支撐。綜合對豬霍亂沙門氏菌、雞白痢沙門氏菌、大腸桿菌K88等3個指示菌的抑菌結果顯示，pH 調整為4.0、5.5、7.0 對培養液（BCS）的抑菌性能無顯著影響，且pH 4.0、5.5、7.0對菌懸液（CBS）的抑菌性能也無顯著影響。以上結果表明，飼用凝結芽孢桿菌在畜禽腸道pH 范圍內，其抑菌性能不受pH影響；基于飼用凝結芽孢桿菌在腸道內分泌的各類有機酸，被食糜、消化器官分泌液等不同程度地緩沖，以上結果進一步提示，“產酸抑菌”不是飼用凝結芽孢桿菌調控畜禽腸道菌群的主導機制。

此外，綜合3 個指示菌的抑菌結果均顯示，培養液組（BCS）pH 2.5 時的抑菌圈直徑（DIZ=23.82～25.09，高敏感）幾乎是pH 4.0～7.0 時測定結果（DIZ=11.08～14.54，敏感）的約2 倍，由于培養液中主導抑菌作用的抗菌蛋白或抗菌肽含量恒定，這一變化顯然是高濃度H+造成的。為驗證這一觀點，本研究對照組無菌蒸餾水（SDW 組），先用乳酸將pH 調整為至2.5，檢測SDW 對3個指示菌抑制作用也達到了“高敏感”；隨后，用氫氧化鈉降低SDW 中的H+、將pH 調整為4.0、5.5 和7.0 時，檢測SDW 對3 個指示菌均無抑制作用。由于該株凝結芽孢桿菌培養液實測pH 為4.7，因此以上的結果證明“產酸抑菌機制”不是飼用凝結芽孢桿菌調控胃腸道菌群的主導機制。

綜上所述，用牛津杯法體外評估凝結芽孢桿菌抑菌性能時，凝結芽孢桿菌培養液和菌懸液均可用于反映凝結芽孢桿菌的抑菌性能，但培養液操作更方便。同時模擬畜禽腸道pH 環境發現，凝結芽孢桿菌抑菌性能不受pH影響。

4 結論

本研究表明，凝結芽孢桿菌的培養液適合用于牛津杯抑菌試驗操作。進一步通過模擬畜禽腸道的不同pH 條件（pH 4～7），發現用凝結芽孢桿菌培養液評估的抑菌性能（抑菌圈直徑數據）差異不顯著。以上研究結果為規范凝結芽孢桿菌體外牛津杯抑菌試驗操作、進一步闡明抑菌機制提供了科學依據。