靶向轉錄因子的抗腫瘤藥物研發進展

路明英,胡唯偉,高興華

(中國藥科大學,江蘇 南京 211198)

轉錄因子(TF)一般均包含兩個蛋白質結構域:結合特定 DNA 調控序列的 DNA 結合結構域(DNA binding domain,DBD),招募各種轉錄輔因子以調節染色質可及性和轉錄輸出的效應結構域(effector domain)。很多 TFs還包含一個或多個轉錄調節域,這些轉錄調節域通常用于TFs的定位和功能活動[1-2]。人類基因組中至少有1 600個TFs,其中約19%與疾病表型相關。因此TFs是疾病常見的驅動因素,這也使TFs成了有前景的治療靶點[3-5]。但是大多數的 TFs是無序的,并且缺乏經典的小分子結合口袋[6]。隨著對TFs的進一步研究以及藥物研發技術的進步,靶向TFs的藥物開發在阻斷TFs與DNA相互作用、阻斷TFs與其他轉錄因子或轉錄輔因子的結合、靶向TFs的PROTAC降解等多方面技術取得進展,改變了TFs小分子調節劑不可成藥的局面。

1 抑制TFs與DNA結合

與催化酶上小而明確的底物結合口袋相比,TFs的 DNA 結合域(DBD)的表面很大,而且其唯一的已知配體是DNA分子,因此DBD通常被認為是“不可成藥”的。TF-DNA 界面富含帶正電的殘基,例如賴氨酸和精氨酸殘基,這增加了小分子調節劑與DBD的結合難度,使得直接靶向 TFs蛋白質-DNA 相互作用區域更具有挑戰性。開發抑制TF- DNA 特異性結合以抑制TFs活性的小分子經歷了長期探索,在結構水平上對TF-DNA 結合的日益了解以及藥物篩選技術的不斷進步提高了靶向DBD小分子的篩選效率,目前已有一些藥物的研發取得了進展并逐步走向臨床。

信號轉導和轉錄激活因子 3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)通過調節腫瘤生長、轉移、血管生成和免疫逃逸相關基因的表達,在癌癥發生發展中發揮重要作用。在生長因子和激素等共同的作用下,受體相關的Janus激酶(JAK)和Src激酶通過磷酸化C末端的酪氨酸殘基使STAT3活化。磷酸化的STAT3單體形成功能性二聚體并在細胞核中積累,進而結合TFs基序并誘導靶基因的表達。STAT3與其下游基因啟動子區之間的物理相互作用對于STAT3的轉錄活性至關重要,因此 STAT3 的DNA 結合域(DBD)是一個潛在的藥物靶點。阻斷STAT3-DNA結合的 STAT3 誘餌寡脫氧核苷酸在臨床前研究中證明了靶向 STAT3 DBD的可行性[7]。Huang等[8]使用靶向 STAT3 -DNA 結合域的改良虛擬篩選策略,篩選得到了 STAT3 抑制劑 inS3-54?；衔飅nS3-54 選擇性地抑制STAT3與DNA的結合而不影響 STAT3 的激活和二聚化。InS3-54 抑制STAT3下游靶基因的表達并抑制STAT3與染色質的結合。InS3-54促進腫瘤細胞凋亡,抑制腫瘤細胞遷移和侵襲。然而,Huang等[9]進一步的研究發現,inS3-54存在一定的脫靶效應,對inS3-54進行結構優化后獲得了一種新的先導化合物(inS3-54A18),它具有更高的特異性和更好的藥理學特性。InS3-54A18不僅直接與 DBD 結合,抑制STAT3與DNA的 結合活性,還能有效抑制 STAT3 下游靶基因的表達。此外,基于已知藥效團的結構改良進一步確定了新的STAT3 DBD的抑制劑 LC28 及5種類似物,這些化合物通過進一步的修飾和開發,為治療順鉑耐藥的卵巢癌提供了新的治療策略[10]。

轉錄因子 Forkhead box O3 (FOXO3)及其家族成員識別并結合相同的核心 DNA 元件(TTGTTTAC),以控制靶基因的轉錄。FOXO3 通過轉錄調控FOXP3來調控調節性 T 細胞(regulatory T cell,Treg)的分化,Treg細胞抑制細胞毒性T 細胞的抗腫瘤作用[11]。小分子化合物對 FOXO3 活性的可逆抑制能增強抗腫瘤免疫反應并降低FOXO3 功能失活帶來的副作用。Hagenbuchner等[12]的研究結合了計算機藥效團建模和熒光偏振方法,確定了直接與 FOXO3 DBD 結合的小分子化合物 S9 及其草酸鹽 S9OX ?；衔?S9 及其草酸鹽 S9OX 阻斷 FOXO3 與靶啟動子的結合,抑制Treg細胞中FOXO3下游靶基因的表達。

總之,TF-DNA 的相互作用對于基因表達的調節至關重要,并與多種類型的癌癥有關。小分子數據庫、大規模虛擬篩選和其他計算機輔助藥物篩選等技術的發展提高了靶向TF-DNA 位點的可行性,AI(artificial intelligence) 和深度學習平臺的發展將促進藥物靶標識別、蛋白結構預測,這些方法將使得靶向TFs的蛋白質-DNA 相互作用藥物研發取得更好的發展[12]。

2 抑制TFs的蛋白-蛋白相互作用

蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction,PPI)是蛋白質與其配體之間的物理相互作用,在多種癌癥中,PPI的異常促進了腫瘤的發生發展。抑制異常的PPI 可能是一種有效的癌癥治療方法。腫瘤細胞細胞核中多種TFs存在異常的蛋白-蛋白相互作用,這為利用藥物來抑制這種相互作用提供了可能[14]。這些相互作用包括TFs之間的相互作用,以及參與轉錄的多種共激活因子和TFs的相互作用。因此,阻斷TFs和其他TFs或轉錄輔因子的相互作用,成為抑制TFs轉錄調控的新方向。

在70%的人類惡性腫瘤細胞中,MYC基因表達水平失調。由于異常表達的MYC在腫瘤發生發展過程中的關鍵作用,因此其成為了腫瘤治療的潛在靶點[15]。目前已知的MYC基因家族包括3個成員,C-MYC、L-MYC和N-MYC。它們均屬于堿性螺旋-環-螺旋亮氨酸拉鏈(bHLHLZ)DNA結合蛋白超家族。C-MYC(以下簡稱 MYC)是一種由 439 個氨基酸組成的蛋白,包含一個特征明確的 C 端 DNA 結合域和一個 N 端反式激活結構域(TAD)。C 端DNA結合域約 有100 個殘基,包含一個螺旋-環-螺旋亮氨酸拉鏈(bHLH-LZ)片段,該片段調節 MYC 與轉錄因子MAX 之間的異二聚化,介導其與基因啟動子的結合。抑制MYC與MAX蛋白二聚化提高了MYC抑制劑的成藥性[16]。SaJM589 通過破壞 MYC-MAX 異源二聚化并促進蛋白酶體介導的 MYC 降解,抑制多種腫瘤細胞增殖[17]。最近發現的另一種小分子化合物 MYCMI-6 也通過結合 MYC 的 bHLH-LZ 結構域來抑制 MYC-MAX 異源二聚化[18]。體外試驗發現MYCMI-6 抑制 MYC 依賴性的細胞生長,這種作用與腫瘤細胞中 MYC 表達水平相關?；衔?KSI-3716 可阻斷 MYC-MAX 與 DNA 的結合進而抑制腫瘤的增殖[16]。以上研究證明靶向抑制MYC蛋白-蛋白相互作用的藥物具有很好的抗腫瘤前景。

p53是一種包含有393個氨基酸的轉錄因子,可通過多種機制如DNA 修復、細胞凋亡、細胞周期停滯、衰老、新陳代謝和自噬等途徑抑制腫瘤的發生發展。在腫瘤細胞中,MDM2介導p53蛋白的泛素化,通過促進p53蛋白的降解使其蛋白表達維持較低水平。因此,破壞 p53-MDM2的相互作用可以上調腫瘤細胞中P53的蛋白表達,發揮P53蛋白的抑瘤作用。Nutlins 是首個被報道的MDM2 抑制劑,它是由 Hoffmann-La Roche對合成化合物進行篩選時發現的。為提高其效力和選擇性,研究人員通過化學優化的方法合成了第一個先導化合物 Nutlin-3a[19]。在此基礎上發展得到的 RG-7112,在WT-P53腫瘤細胞中的平均IC50為400 nmol·L-1,RG-7112也是第一個進入臨床試驗的MDM2 抑制劑[20]。臨床試驗表明,MDM2抑制劑可以激活腫瘤細胞中的p53信號,證明了該小分子化合物研發方向的可行性。Wang研究團隊通過對天然產物結構的改造,發現了新型MDM2抑制劑螺羥吲哚衍生物[21-22],并以其中的MI-219作為先導化合物,對其進行進一步優化得到 MI-773,目前MI-773已進入臨床試驗。 Espadinha等[23]研究團隊對螺吡唑啉羥吲哚類化合物進行結構優化,開發了抑制MDM2-p53 和 MDM4-p53 蛋白-蛋白相互作用的一系列雙重抑制小分子,發現有兩個化合物以濃度依賴性方式誘導 SJSA-1 細胞凋亡,顯示出較好的抗癌活性。Si等[24]參考查爾酮與MDM2的結合模式,經過虛擬篩選得到不飽和吡咯烷酮結構,合成的不飽和吡咯烷酮衍生物顯示出與MDM2優異的選擇性和抗腫瘤活性。

通過開發小分子藥物來抑制TFs的PPI是治療疾病的有效策略。外源性介入PPI 的治療方法旨在抑制蛋白質復合物的組裝和抑制蛋白復合物的穩定性[25]。裝訂肽通過在兩個氨基酸側鏈之間形成共價鍵,將短線性肽限制在天然 α 螺旋構象中,從而產生有效的PPI 抑制效果。Sharma等[26]報道了一種用于抑制 p53-MDM2 相互作用的釘合肽。以上研究提示通過開發肽類藥物來抑制p53-MDM2 相互作用是一個很好的研究方向。

在腫瘤學領域,藥物發現中用于PPI抑制劑開發的技術包括基于片段的篩選、計算分析和分子抑制劑設計。針對TFs與其他蛋白之間相互作用設計的PPI 抑制劑可能存在以下的缺點:反應性低、存在脫靶毒性、可能產生免疫原性等,克服這些挑戰將為針對TFs的PPI藥物開發提供新的可能。

3 蛋白水解靶向嵌合體(PROTAC)技術靶向降解TFs

蛋白水解靶向嵌合體(PROTAC)技術的開發是通過設計雙功能小分子嵌合體將感興趣的蛋白質(POI)帶到 E3 泛素連接酶的附近,從而誘導 POI 的泛素化并通過蛋白酶體途徑降解。通過將離散的靶蛋白配體與 E3 連接酶進行有效的連接,PROTAC提供了靶向TFs的快速降解途徑。與小分子抑制劑相比,PROTAC 具有多項優勢,包括擴大靶蛋白范圍、提高選擇性、降低毒性和避免抑制劑耐藥性[27]。

迄今為止,兩種口服活性較好的PROTAC類TFs抑制劑 PROTAC ARV-110 和 ARV-471 已進入臨床。 雄激素受體(AR) 降解劑 ARV-110 在 AR 野生型前列腺癌患者以及 AR T878A 和 H875Y 突變體患者中顯示出更好的治療效果。已有的AR抑制劑恩雜魯胺和醋酸阿比特龍對攜帶AR T878A和H875Y突變群體的治療效果不佳[28]。雌激素受體(ER)降解劑 ARV-471 在具有野生型和突變型 ER 的乳腺癌患者中均顯示出良好效果[29]。兩種高效的 TFs 降解劑 ARD-69 和 ARD-61,分別用于治療 AR 陽性前列腺癌和乳腺癌[30-31]。ARD-2585 和 ARD-2128 是兩種可口服、高效的AR降解劑,ARD-2585誘導攜帶AR T878A 突變的雄激素敏感性前列腺腺癌細胞LNCaP AR降解,并可誘導 T878A突變和L702H 突變的雄激素敏感MDA-PCa-2b細胞AR降解[32-33]。PROTAC 溴結構域抑制劑 ARV-825 通過抑制MYCN或c-Myc的表達在神經母細胞瘤中顯示出抗腫瘤活性[34]。Kaneshige等[35]發現一種有效的選擇性 STAT5 PROTAC 降解劑 AK-2292,其在體內對急性髓系白血病具有強抗腫瘤活性。

通過使用TFs靶向嵌合體(TRAFTAC)模擬其內源性配體DNA,可靶向 TFs并使其降解[36]。TRAFTAC包括一個識別TF的短雙鏈DNA序列,該dsDNA與sgRNA相關聯,而該sgRNA可被spCas9 識別,后者充當調節器,通過 dCas9-HaloTag 融合體將 TF-TRAFTAC 結合到 E3 連接酶上。HaloTag 是一種經過修飾的細菌脫鹵素酶,可與己基氯結合基團發生共價反應。當HaloTag連接到結合 von Hippel-Lindau(VHL)E3 連接酶的彈頭時,生成的 HaloPROTAC 將 VHL 募集到 HaloTag-靶標融合體。 HaloPROTAC使VHL 被招募到 dCas9-HaloTag 適配器以誘導目標TFs的降解。通過結合使用 TRAFTAC、dCas9-HaloTag 和 HaloPROTAC,兩種轉錄因子 NF-κB 和 brachyury被靶向降解。但是TRAFTAC 系統的所有3個組分(dCas9-HaloTag、TRAFTAC、HaloPROTAC)需同時進入細胞中才能產生活性降解復合物,這在臨床應用上有一定的難度。Shao等[37]構建出更為簡單的O′PROTAC 靶向TFs進行降解。O′PROTAC將雙鏈寡核苷酸作為 POI 結合部分結合到 PROTAC 中,在ERG和LEF1的靶向降解中取得成功,O′PROTAC 的合成非常簡單高效,有助于快速開發 O′PROTAC 文庫,用于高通量篩選有效的TFs降解劑。

在轉錄因子的71個家族中,zinc finger C2H2轉錄因子的數量超過600個,占比超過所有轉錄因子數量的一半[38]。沙利度胺、來那度胺和泊馬度胺是臨床批準用于治療多發性骨髓瘤和其他血液系統惡性腫瘤的藥物。這些藥物通過鋅指轉錄因子中存在的 Cys2-His2(C2H2)鋅指(ZF)結構域將它們招募到 CRL4CRBNE3 泛素連接酶,進而介導TFs降解。沙利度胺類似物結合 Cereblon(CRBN)—— E3 泛素連接酶的底物受體,改變CRBN底物選擇性以招募泛素來降解蛋白質,包括 Ikaros(IKZF1)、Aiolos(IKZF3)和酪蛋白激酶 1 α(CK1α)[39-42]。Sievers 研究小組進一步確定了通過沙利度胺類似物和CRBN降解的鋅指轉錄因子降解子的特征,為含C2H2 ZnF轉錄因子的靶向降解提供了新方法[45]。

就臨床實踐而言,PROTAC藥物仍處于研發的早期階段,存在開發緩慢且成功率低、膜通透性和口服生物利用度差、人體臨床研究證據不足等挑戰。但隨著研究的深入,這些問題將逐步得到解決,一旦獲得臨床突破,將開啟藥物創新的新紀元[44]。另外,只有不到 2% 的E3連接酶用于靶向降解,因此,開發可用于轉錄因子靶向降解的新型E3連接酶是一個很有價值和潛力的研究方向?？傊?這些技術突破能極大地促進靶向TFs的治療藥物的發展。

4 總結與展望

腫瘤細胞高度依賴TFs的異常驅動來支持它們的生長和存活。對 TFs作用機制的深入了解,可以更好地了解它們在癌癥和其他疾病中的作用。參與腫瘤發生發展的一些關鍵TFs是炎癥相關的TFs,例如NF-κB、STAT3 和 AP1等,它們調控了腫瘤的發生發展;缺氧誘導因子(hypoxia inducible factor,HIF)通過激活并維持腫瘤細胞干性,促進腫瘤細胞侵襲、轉移和血管生成等相關基因的表達,在腫瘤的惡性進展中起到了重要的驅動作用;C-Myc 和 E2F1的異常表達解除了細胞周期的限制,導致了腫瘤細胞不受控制的細胞分裂;β-catenin 和 ETS1 促進上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT) 和轉移,而 核受體(nuclear receptors,NRs) 在激素敏感性腫瘤中起關鍵調控作用。TFs 在化療后的異常表達導致EMT 和腫瘤干性的增強,對癌癥治療造成重大挑戰。因此研究人員近年來在靶向TFs的藥物開發方面進行了不斷的嘗試,從TFs生理作用特點和結構特點兩個方向著手創新藥物的開發,以控制癌癥中失調的TFs,使其由不可成藥的靶點轉化為有潛力的治療靶點。

藥物開發的主要局限之一是大多數化合物都調控蛋白質的酶活以實現其靶向性,而靶向沒有酶活性的致癌蛋白的藥物非常有限[45-46],TFs屬于缺少酶活位點并與癌癥發生和發展密切相關的蛋白?；赥Fs在癌癥中的重要驅動作用,研究人員在開發靶向TFs的藥物研究中做了很多工作,其中一些研究成果已經進入臨床試驗,但由于副作用、毒性和低耐受性的缺點,只有少數藥物最終成功進入臨床。然而,最近在藥物設計和開發方面取得的技術有希望改善這一現狀,包括計算機輔助分子建模和基于結構的藥物設計等新技術為開發出更好的靶向 TFs的藥物提供了很多技術支持。破壞蛋白質-蛋白質相互作用及其與 DNA 的結合,以及通過調節染色質可及性來限制表觀遺傳調控是靶向 TFs的新興策略。鑒于癌細胞對 TFs 的依賴性以及單一化學療法容易產生耐藥性,因此靶向 TFs 的藥物與目前的化療及靶向治療的組合可能是未來癌癥治療的有效策略。最近的研究表明基于 NR的療法也可能影響免疫反應,TFs靶向藥物與免疫療法相結合在癌癥治療中展現出巨大的潛力。

由于轉錄調控同時參與維持細胞的正常生理功能,靶向 TFs 的抑制劑容易產生毒副作用。然而,隨著研究的不斷深入,可以通過篩選識別腫瘤細胞特異性的TFs來降低藥物毒性。此外,針對癌癥中特異性轉錄因子抑制劑的開發必須考慮到同一家族中彼此非常接近的不同轉錄因子之間可能產生的代償現象,因此必須進一步闡明TF-DNA 或輔因子相互作用的詳細分子機制,以提供靶向轉錄因子新的開發策略[47]。抑制轉錄因子治療癌癥已逐漸成為目前抗腫瘤藥物開發很有前景的研究方向,該研究策略同樣可適用于其他疾病,如遺傳或炎癥性疾病、糖尿病、帕金森和阿爾茨海默病等。