枯草芽孢桿菌YQ-1降解玉米赤霉烯酮膜蛋白酶的提取及性質分析

周于群，唐語謙

（華南理工大學食品科學與工程學院，廣東廣州 510640）

玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）是鐮刀菌屬（Fusariumsp.）（主要是禾谷鐮刀菌）產生的真菌毒素之一[1]。ZEN 廣泛存在于發霉的玉米、小麥、燕麥和其他作物以及飼料、農業和副產品中[2]，是17-β雌激素的結構類似物，可以與人和動物中的17-β雌激素受體競爭性結合，引發一系列生殖毒性、遺傳毒性、致癌毒性和免疫毒性[3]。ZEN通過食物鏈蓄積，通過農產品進入牲畜和人體內，帶來嚴重的健康風險，也會造成巨大的經濟損失[4]。如何降低ZEN 污染帶來的風險和損失是當前研究的主要方向。

與傳統的物理和化學脫毒方法（如熱處理、漂洗和堿處理）相比，生物脫毒因其更高效、更安全、成本更低和無二次污染等特點而更受青睞[5,6]。生物脫毒是指使用微生物或酶作用于真菌毒素并將其轉化為低毒性或無毒代謝物的過程。ZEN 脫毒酶主要包括：內酯水解酶[7]、羰基還原酶[8]、C14/16-OH 加和酶[9]（葡萄糖基化、磷酸化等）。已知細胞定位的ZEN 降解酶多以胞外酶為主[10-12]。降解酶的挖掘途徑分為兩種，一是傳統的蛋白提取，傳統提取方法步驟繁瑣，蛋白易在提取過程中失活，蛋白得率低；二是從已有數據庫中挖掘酶，并通過重組表達等手段驗證?，F有的ZEN 降解酶序列多以此途徑獲得。目前在ZEN 降解的研究中，明確降解酶序列的并不多，而發現酶定位在細胞膜上的更是少見，定位在細胞膜上的ZEN 降解酶幾乎未見報道。

本課題組前期篩選到一株可以高效降解ZEN 的枯草芽孢桿菌Bacillus subtilisYQ-1，12 h 內全細胞催化對ZEN（20 μg/mL）的降解率達98.36%，但該菌株仍缺乏相關降解酶的研究。經初步降解酶細胞定位研究發現ZEN 降解酶定位在細胞膜上，因此本實驗根據降解酶的細胞定位，以ZEN 降解率為指標，提取YQ-1 膜上的降解酶，根據氨基酸序列分析降解酶的相關信息。

膜蛋白分為整合膜蛋白和外周膜蛋白。外周膜蛋白是通過離子鍵、氫鍵與膜脂分子的極性頭部相結合的蛋白，這種結合較為松散，常用高鹽（1 mol/L NaCl 或KCl）或變性劑（8 mol/L 尿素或6 mol/L 鹽酸胍）提取[13]。整合膜蛋白會嵌入磷脂雙分子層中，與脂肪酸鏈共價結合，這種結合更為緊密，需要有機溶劑或去垢劑破壞磷脂雙分子層后，才能將其釋放出來[14]。PDB（Protein Data Bank）數據庫中成功解析結構的膜蛋白僅占數據庫總蛋白的1%，膜蛋白的表達量極低，缺乏有效的純化技術是膜蛋白結構和功能研究的瓶頸。

本論文為枯草芽孢桿菌降解ZEN 的機制研究奠定基礎，也為提取枯草芽孢桿菌膜上活性蛋白酶提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

胰蛋白胨、葡萄糖、瓊脂、無氨基酵母氮源（YNB）、生物素、酵母提取物、海藻酸鈉、殼聚糖、檸檬酸三鈉、無水檸檬酸、三羥甲基氨基甲烷（Tris），均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；尿素、丁醇、Triton X-100、Triton X-114、十二烷基-β-D-麥芽糖苷（DDM）和辛基-β-葡萄糖苷（β-OG）購自Sigma-Merck 公司；甲醇（色譜級）、乙腈（色譜級），購自廣州彼西絡科技有限公司；玉米赤霉烯酮（99%），購自西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司。

1.2 儀器與設備

DF-1O1S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責任公司；FA2204B 電子天平，上海精密科學儀器有限公司；JW-3021HR 高速冷凍離心機，安徽嘉文儀器裝備有限公司；HWS 型恒溫恒濕箱，寧波東南儀器有限公司；QYC-200 全溫空氣搖床，上海?，攲嶒炘O備有限公司；Waters 515 高效液相色譜，沃特世科技（上海）有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株及培養條件

枯草芽孢桿菌B.subtilisYQ-1 為本實驗室保存，種子培養基（稱取30 g/L 葡萄糖，6 g/L 酵母浸提物，6 g/L NH4Cl，0.4 g/L MgSO4·7H2O，1 g/L KH2PO4和1 g/L K2HPO4，）發酵培養基（46 g/L 葡萄糖，12 g/L酵母浸提物，3 g/L (NH4)2SO4，1 g/L K2HPO4，0.4 g/L MgSO4·7H2O 和1 g/L KH2PO4）。YQ-1 于發酵培養基條件下30 ℃、180 r/min 培養20～24 h，得到菌液。

1.3.2 ZEN降解酶的細胞定位

取100 mL 按2.1 方法培養得到的菌液，低速離心，8 000 r/min 離心10 min，收集上清液過0.22 μm濾膜即得胞外上清液；無菌水重懸菌體，共清洗兩次，8 000 r/min 離心5 min，棄去上清液，加入10 mL無菌水重懸菌體，冰浴條件下超聲破碎菌體細胞，破碎參數設置如下：超聲功率為200 W，破碎總時間為5 min，工作2 s，停4 s。高速離心細胞破碎液10 000 r/min 離心5 min，收集上清液即得胞內組分。剩余的細胞碎片用10 mL 無菌水重懸，即得細胞膜組分。

將20 μL 5 mg/mL ZEN 分別加入4 980 μL 不同組分液體中，反應體系總體積為5 mL，其中ZEN 初始質量濃度為20 μg/mL，30 ℃搖床轉速180 r/min 條件下反應。實驗組分別為全細胞、胞外上清、細胞膜組分和胞內組分，測定反應2 h 后各組分的降解情況。

1.3.3 ZEN降解率的測定

圖1 玉米赤霉烯酮（ZEN）標準曲線Fig.1 The standard curve of zearalenone

分別制備質量濃度為0、5、10、20 和40 μg/mL的ZEN 標準液，進樣20 μL，重復測定三次取平均值。橫坐標為ZEN 的質量濃度，縱坐標為峰面積，根據質量濃度與峰面積關系繪制得到ZEN 標準曲線。ZEN 標準曲線如圖2 所示。標準曲線在ZEN 質量濃度范圍為0.0～40.0 μg/mL 時線性關系良好，可供后續計算ZEN 的質量濃度（μg/mL）時使用。

圖2 不同組分對ZEN 降解的測定Fig.2 Determination of the degradation of ZEN by different components

反應12 h 后，取0.5 mL 反應液加入等量甲醇停止反應后，8 000 r/min 離心5 min，取上清液過0.22 μm 微孔濾膜，使用HPLC 檢測降解后體系中ZEN 含量。高效液相色譜檢測ZEN 的條件為：Agilent ZORBAX SB-C18 的色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），使用Waters 紫外檢測器，檢測波長238 nm，流動相為乙腈:甲醇:水=46:8:46（V/V/V），柱溫30 ℃，流量0.9 mL/min，進樣量20 μL。以甲醇：水為1:1（V/V）的溶劑作為空白對照，采用下列公式計算ZEN 的降解率：

式中：

B——ZEN 降解率，%；

A1——反應體系中ZEN 的初始質量濃度，μg/mL；

A2——反應體系中ZEN 的終止質量濃度，μg/mL。

1.3.4 膜定位降解酶的初步提取

將1.3.2 方法制備得到的膜組分分為數組，分別緩慢添加不同的提取試劑，維持4 ℃條件攪拌提取過夜。不同提取試劑添加情況如表1。

表1 膜蛋白提取試劑添加量Table 1 Addition amount of membrane protein extraction reagent

得到的活性組分作為粗酶液，驗證其ZEN 降解能力，反應體系同1.3.2，反應12 h 后，經HPLC檢測ZEN 質量濃度，計算降解率。

1.3.5 酶活測定及蛋白質定量

酶反應混合物含有100 μL 稀釋酶溶液、4 μL ZEN 標準儲備溶液（5 mg/mL）和896 μL PBS 緩沖液（50 mmol/L，pH 值7.0）。將反應混合物在30 ℃下孵育30 min。孵育后，向反應體系中加入500 μL甲醇以終止反應。用高效液相色譜法檢測ZEN 的殘留濃度。酶活定義為：每mL 液體每分鐘降解1 μg ZEN 為1 單位酶活（U）。

采用BCA 法對粗酶液中的蛋白質進行定量。

1.3.6 蛋白酶解及N-端測序

選擇體積分數10%的預制膠，取20 μL 粗酶液樣品與80 μL loading buffer 混勻，煮沸5 min，取10 μL 上樣，電泳電壓為120 V，電泳時長90 min。經染色脫色后，觀察結果。

將膠條切成大小約1 mm3的小塊置于1.5 mL 離心管中，加脫色液，勻速搖晃，重復多次脫色至透明；加乙腈脫水至膠粒變白，真空抽干，加入終濃度為10 mmol/L DTT 的工作液，37 ℃孵育1 h；隨后加乙腈脫水至膠粒變白，真空抽干，加入終濃度為55 mmol/L IAM 的工作液，置于暗室孵育30 min；再次加入乙腈脫水至膠粒變白，真空抽干，再加入去離子水清洗，該步驟重復1 次；加入50 mmol/L 碳酸氫銨孵育10 min，之后再加入Trypsin 工作液，讓酶液與膠粒充分接觸，待酶液被膠粒完全吸收，37 ℃孵育過夜12 h；離心收集酶解上清液，置于新的離心管中。使用C18 脫鹽柱對樣本進行脫鹽，體積分數100%乙腈活化脫鹽柱，0.1%（V/V）甲酸平衡柱子，加載樣本到柱子上，隨后使用0.1%甲酸洗滌柱子，洗掉雜質，最后使用體積分數70%乙腈洗脫，收集流穿液，凍干。蛋白樣品酶解的肽段在HPLC 中分離后再進入質譜進行離子化然后經過質譜質量分析器將離子碎片按質量數分開，經檢測器得到譜圖。將譜圖拼接，得到肽段序列，在NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上進行序列檢索。

1.3.7 粗酶液降解ZEN的影響因素

將8 μL 5 mg/mL ZEN 分別加入1 992 μL 丁醇粗酶液中，反應體系總體積為2 mL，分別在不同溫度（20、30、40、50 和60 ℃）和pH 值（3、4、5、6、7、8、9 和10）條件下反應，其中，pH 值2.0～5.0 為檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，pH 值6.0～7.0 為PBS 緩沖液，pH 值8.0～9.0 為Tris-HCl 緩沖液，pH 值10.0～12.0 為NaHCO3-NaOH 緩沖液。在金屬離子反應中，在體系中加入200 μL 1 mol/L 金屬離子母液（Ba2+、Cu2+、Ca2+、Mn2+、Na+、K+、Mg2+和EDTA），使離子終濃度為100 mmol/L，加入8 μL 5 mg/mL ZEN，加入粗酶液補齊體積至2 mL。反應12 h 后，取等體積甲醇終止反應，每組設三個平行，液相測定ZEN 降解率。

1.4 數據處理及分析

所有的實驗均重復三次，取結果的平均值和標準差進行分析。采用Origin 2018 分析結果并作圖。

2 結果與討論

2.1 ZEN降解酶的細胞定位

枯草芽孢桿菌B.subtilisYQ-1 全細胞對ZEN 有顯著的降解作用，其中全細胞在反應2 h 后對ZEN（20 μg/mL）的降解率達到71.23%。比較胞外上清、細胞膜組分和胞內蛋白的活性，發現反應2 h 后培養上清液對于ZEN 的降解率僅為17.15%，胞內組分降解率13.96%，膜組分降解率57.74%（見圖2），這表明枯草芽孢桿菌YQ-1 中發揮催化作用的活性物質主要在細胞膜上。

已發現的ZEN 降解酶多是定位在胞外或細胞內。黑曲霉ZEN-S-FS10 以其分泌到胞外的蛋白降解ZEN，Sun 等[15]采用?KTA 蛋白純化分離系統獲得具有ZEN 降解活性的胞外蛋白FSZ，氨基酸序列分析表明其是一種新型降解酶（與已有的ZEN 降解酶序列比較，相似度＜10%）。同樣是胞外蛋白的ZEN 降解酶還有不動桿菌AcinetobacterSM04 的過氧化物蛋白Prx[16]，玫瑰華枝曲霉Clonostachys roseaGRZ7 的內酯水解酶PR-ZHD[17]等。隨著蛋白提取技術和方式的更新，膜蛋白的提取研究也日益增多，結合國內外文獻來看，本文所報道的膜定位ZEN 降解酶尚是首例。

2.2 ZEN降解酶的提取

基于降解酶在膜上的定位，根據膜蛋白的種類選擇四種不同的試劑（1 mol/L NaCl、8 mol/L 尿素、丁醇和Triton X-114）進行提取。其中1 mol/L NaCl、8 mol/L 尿素針對性溶解外周膜蛋白，丁醇和Triton X-114 針對性溶解整合膜蛋白。提取得到的粗酶液進行ZEN 降解活性驗證（表2），并通過SDS-PAGE 觀察結果（圖3）。

表2 不同試劑提取所得粗酶液的ZEN降解活性Table 2 ZEN degradation activity of crude enzyme solutions extracted with different reagents

圖3 不同試劑對YQ-1 膜上ZEN 降解酶的提取Fig.3 Extraction of ZEN-degrading enzymes on YQ-1 membranes by different reagents

結果如圖3 所示，NaCl 和尿素對酶的溶解效果并不理想，提取蛋白量少且缺乏ZEN 降解活性。高鹽環境通過破壞酶與膜之間的氫鍵和靜電相互作用使得酶從膜上脫落，但這種作用同樣會對酶本身的折疊產生影響，因此用高鹽法提取降解酶時要考慮提供一個溫和的緩沖環境，以保護降解酶的活性[18]。丁醇提取得到的粗酶液具有ZEN 降解活性，且SDS-PAGE 結果顯示其蛋白含量較其它三組都高。丁醇具有親水和親脂的兩親性，對酶的結構和活性影響較小，是一類友好的膜降解酶提取試劑[18]，由此可推測YQ-1 膜上ZEN 降解酶屬于整合型膜蛋白。

整合膜蛋白與膜的結合更緊密，本實驗嘗試選用不同提取試劑，包括丁醇和4 組去垢劑（β-OG、DDM、Triton X-100 和Triton X-114），比較它們對降解酶活性的影響。不同試劑提取得到的粗酶液活性如圖4 和表3 所示，反應12 h 后，丁醇組表現出了顯著的降解活性，而其它四組粗酶液則沒有ZEN降解活性。這可能是降解酶從膜中溶解出來時，丁醇的兩親性能較好的保持酶的空間結構，維持酶的活性，而另外4 組去垢劑提取的膜蛋白量與丁醇所提的相差不明顯，但它們會在酶周圍提供一個疏水環境，形成膠束（如圖5 所示），可能會掩蓋了酶表面的活性位點，而使得酶表現出了失活的性狀[18]。不同去垢劑對不同酶活性的影響不同，在漆酶轉化雙酚A 的反應中，Triton X-100 的存在會促進雙酚A 的轉化，這是因為Triton X-100 的存在有利于漆酶的折疊和穩定，同時Triton X-100 與漆酶表面的結合也減輕了自由基和聚合產物引起的失活效應[19]。

表3 不同試劑對膜定位ZEN降解酶活性的影響Table 3 Effect of different reagents on the activity of membrane localized ZEN degrading enzymes

圖4 丁醇和去垢劑提取所得膜蛋白粗酶液的ZEN 降解活性Fig.4 ZEN degradation activity of membrane protein crude enzyme solution obtained by butanol and detergent extraction

圖5 去垢劑-膜蛋白-脂質膠束Fig.5 Detergent membrane protein lipid micelles

膜上的蛋白質在提取過程中易發生去折疊和聚集沉淀，這可能導致蛋白質天然結構的改變和蛋白質-蛋白質相互作用被破壞，影響酶的生物活性。不同的膜蛋白提取試劑會溶解出不同的蛋白。圖6 的SDS-PAGE 圖中可以看出蛋白條帶集中在30～50 ku 范圍，丁醇和四種去垢劑提取得到的條帶接近。

圖6 丁醇和去垢劑對YQ-1 膜降解蛋白的提取Fig.6 Extraction of YQ-1 membrane degradation protein by butanol and detergent

丁醇組粗酶液蛋白質量濃度為9.86 μg/mL，比酶活為0.044 U/mg 蛋白。自海桑內生菌Bionectria ochroleuca31535 中提取得到的ZEN 降解酶ZLHY-6的酶活為2.2 U/mL[20]，與該降解酶相比，本實驗提取所得的粗酶液酶活偏低。低酶活與酶的膜定位有關，膜蛋白豐度低，加上提取過程中不可避免的損耗，最終酶濃度低于其它提取所得的胞內外蛋白；此外，膜蛋白從膜上脫落后，酶的三維結構不像其錨定在膜上那么穩定[21]，酶活性也會受到影響。劉慶瑞等[22]自鏈霉菌膜上提取膜蛋白ε-聚賴氨酸降解酶，測得粗酶液酶活為0.547 U/mg。綜上所述，采用丁醇作為提取試劑可從枯草芽孢桿菌YQ-1 膜上將ZEN 降解酶溶出，所得粗酶液在49.3 μg 添加量下，30 ℃反應12 h 可以降解64.09% ZEN（20 μg/mL）。

2.3 ZEN降解酶的氨基酸序列分析

從圖6 所得的SDS-PAGE 膠上回收箭頭所指向的五條明顯條帶，隨機酶解后N-端測序。Lane 1得到了12 條肽段，Lane 2 得到3 條肽段，Lane 3 和4 得到4 條肽段，Lane 5 得到1 條肽段。將這些肽段結果同NCBI 數據庫中已有的蛋白進行比對，比對結果見表4。檢索的結果顯示，其中Lane 1 的肽段P12 與嗜酸芽孢桿菌的α/β水解酶序列有83.33%的相似性，與貝氏芽孢桿菌的α/β水解酶也具有66.67%的相似性[23]（相似性結果比較見表5），后兩者的α/β水解酶均具有羧酸酯酶結構域。具有ZEN降解能力的貝氏芽孢桿菌分泌的α/β水解酶與ZHD 101 的序列間具有23.15%的相似性?；谏鲜龇治?，推測Lane1 可能是α/β水解酶，催化ZEN 結構中大環內酯的酯鍵的裂解，形成開環的無毒二羥基苯基產物，實現快速降解ZEN。

表4 不同肽段序列比對結果Table 4 Sequence comparison results of different peptides

表5 肽段與水解酶之間的序列相似性比較Table 5 Comparison of sequence similarity between peptides and hydrolases

2.4 影響粗酶液降解ZEN的因素

分別驗證不同ZEN 初始濃度、溫度、pH 值和金屬離子條件下，丁醇組粗酶液對ZEN 的降解效果。在丁醇組粗酶液中，分別加入不同初始質量濃度（20 μg/mL 和40 μg/mL）的ZEN 進行反應。結果顯示（圖7a），反應12 h 后，初始質量濃度為20 μg/mL 的實驗組降解率為64.09%，初始質量濃度40 μg/mL 的實驗組降解率為86.50%，ZEN 質量濃度的增加有助于降解反應的發生。

圖7 不同ZEN 質量濃度(a)、溫度(b)、pH 值(c)和金屬離子(d)對粗酶液降解ZEN 的影響Fig.7 Effect of different ZEN mass concentrations (a), temperature (b), pH value (c) and metal ions (d)on the degradation of ZEN by crude enzyme solution

粗酶液的活性受溫度影響（圖7b），在20～40 ℃范圍中，隨著溫度的升高，酶活逐漸增加，到40 ℃時相對酶活達到最大，為107.58%，溫度上升到60 ℃后，酶活緩慢下降，但仍維持在90%以上，表明60 ℃高溫對酶活性影響很小，這有利于擴大酶的應用范圍。

同樣的，不同pH 值下酶活性有顯著差異（圖7c），酸性條件下（pH 值3.0～6.0），酶的活性受到顯著抑制（活性＜30%），在pH 值7.0～9.0 的范圍內保持較好的穩定性在pH 值8.0 時達到最佳（130.03%），這一點與大多數ZEN 降解酶一致[15-17,20]。而當pH 值達到10.0 時，酶活受強堿環境的影響顯著下降，相對酶活降至54.12%。

在不同的金屬離子溶液中（圖7d），Na+（129.33%）、Ca2+（159.11%）、Mg2+（127.47%）和EDTA（119.97%）會促進酶活，Ca2+和Mg2+是脫羧酶的已知輔因子和活化劑，Mg2+和Ca2+的存在大大促進了ZEN 的降解，表明這兩個離子在丁醇粗酶液對ZEN 的降解反應中發揮了作用[24]。Mn2+（48.69%）部分抑制酶活，Ba2+（93.56%）、Cu2+（93.54%）和K+（89.19%）對酶活影響不大。

綜上所述，粗酶液在ZEN 降解反應中呈現如下特性：與20 μg/mL 相比，在40 μg/mL 質量濃度的ZEN 條件下，粗酶液降解率更高，粗酶液的最適反應溫度為40 ℃，最適反應pH 值為8.0，Na+、Ca2+、Mg2+和EDTA 的存在對酶活有促進作用，Ba2+、Cu2+和K+對酶活影響較小，而Mn2+的存在會抑制酶活。

3 結論

本文根據枯草芽孢桿菌B.subtilisYQ-1 膜上的ZEN 降解酶定位，以ZEN 降解率為指標，提取YQ-1 細胞膜上的ZEN 降解酶蛋白。不同提取試劑比較結果發現，丁醇提取效果最佳，蛋白含量最高且粗酶液仍保持了ZEN 降解活性；其次是β-OG、DDM、Triton X-100 和Triton X-114，蛋白濃度和丁醇組相近，但酶活缺失；NaCl 和尿素的提取效果最差，蛋白含量低且無降解酶酶活。12 h 內丁醇組粗酶液對20 μg/mL ZEN 的降解率為64.09%，粗酶液蛋白含量為9.86 μg/mL，酶活為0.43 U。分析氨基酸序列，推測粗酶液中發揮ZEN 降解作用的是α/β水解酶，通過作用于ZEN 大環結構上的酯鍵，脫羧形成開環產物，實現ZEN 的有效脫毒。該降解酶的提取為枯草芽孢桿菌ZEN 降解酶挖掘奠定了實驗基礎，枯草芽孢桿菌及其ZEN 降解酶的性質分析為霉菌毒素的體外脫毒研究提供支撐。