大豆分離蛋白制備過程中熱處理及干燥方式對其熱聚集行為和凝膠性能的影響

譚文浩，郭健，楊曉泉

（華南理工大學食品科學與工程學院，廣東廣州 510640）

隨著綠色、可持續的發展理念和追求健康的生活理念深入民心，植物基食品近年在國內外掀起熱潮。全球食品工業嘗試以不同來源食物蛋白質替代動物蛋白生產各式食品，以期為未來社會發展尋求穩定的蛋白質供應來源[1]。不同豆類植物、昆蟲和藻類來源蛋白質以其生產效率高、具備特殊的保健和功能特性等特點受到各大食品生產商和研究人員的關注[2]。然而，產量大、成本低及氨基酸組成合理的大豆蛋白仍是當前食品工業應用最廣泛的植物蛋白[3]。大豆蛋白的可消化必需氨基酸評分（Digestible Indispensable Amino Acid Score，DIAAS）為0.90 分，是最接近動物蛋白評分的植物蛋白[4]；多年前的研究已表明，長期食用大豆蛋白有助于降低患冠心病、糖尿病、心腦血管病等疾病的風險[5]?？梢?，大豆蛋白是傳統動物蛋白的優質替代品。

大豆分離蛋白（Soy Protein Isolates，SPI）是最常見的一種商業化大豆蛋白產品，大多通過熱處理使產品符合有關微生物安全指標的要求，商業化大豆分離蛋白在制備過程中除了“堿溶酸沉”還需經歷高溫熱處理和短時高溫的噴霧干燥[6]。而大豆蛋白質是一類對溫度極為敏感的生物大分子物質，制備過程中，前述兩項有關熱處理均超過了大豆蛋白的變性溫度，蛋白質不可避免地發生去折疊、疏水基團暴露和聚集[7]，實際獲得的是大豆蛋白聚集體的產物，而與天然蛋白質相比，蛋白聚集體空間構象的柔性隨之下降，能產生相互作用的側鏈基團也被包裹于聚集體內部，聚集體之間發生橋連并形成三維網絡結構及其在界面組裝的能力也明顯下降。因此，商品SPI 普遍存在溶解性及成膠、乳化和起泡等功能特性不佳等問題[8]，更多是作為蛋白質填充物在不同食品中添加使用。

對于SPI 品質的改良，研究者采用不同的物理或化學方法對SPI 成品進行處理，通過降低蛋白聚集體的粒徑或增加其親水基團數量嘗試對其進行改性[9-12]。對于實際生產而言，這意味著在生產線前仍需添置相應的設備、增加工序對大豆蛋白原料進行處理，繁瑣的操作并不是生產者的首選。隨著當前植物基食品的興起，植物基蛋白奶、肉類替代物等植物基食品要求大豆蛋白產品具有良好水化性質[13]（溶解性和乳化性等）和凝膠性質[14]（凝膠強度和持水性等）。對現行工藝進行重新的剖析理解，考察不同操作步驟對SPI 產品功能特性的影響，尋找相應工藝的解決方案，最終制備獲得新一代SPI，使其滿足當前植物基食品對植物蛋白配料的要求，顯然更符合當前生產者的期望。

本研究以低溫脫脂大豆粕為原料，對經過“堿溶酸沉”分離獲得的大豆蛋白進行熱處理及噴霧干燥或冷凍干燥制備獲得SPI，比較不同樣品的熱聚集行為及所成凝膠的機械性能，以此厘清制備過程中熱處理和噴霧干燥處理對所得SPI 產品熱致凝膠性能的影響，為選擇更優的工藝操作提高SPI 品質、制備獲得符合當前植物基食品要求的大豆蛋白配料提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

低溫脫脂大豆粕，由山東御馨生物科技有限公司提供；其它化學試劑均為分析純，實驗用水為去離子水 （15.0 MΩ cm）。

1.2 主要設備與儀器

CR 22 G 高速離心機，日本日立公司；B-290 小型噴霧干燥塔，瑞士步琦公司；Alpha 1-4 冷凍干燥系統，德國CHRIST 公司；K9840 凱氏定氮儀，濟南海能儀器股份有限公司；Q-100 差示掃描量熱儀（Differential Scanning Calorimeter，DSC），美國TA公司；Zetasizer Nano ZS 納米粒度儀，英國馬爾文公司；MARS 60 哈克旋轉流變儀，美國賽默飛公司；5943萬能材料試驗儀，美國英斯特朗公司；NM20-040H-I核磁共振成像儀，上海紐邁電子科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 SPI的制備

低溫脫脂大豆粕經粉碎后以1:10 的料液比與去離子水混合均勻，用2 mol/L 氫氧化鈉溶液調節pH值至8.0，室溫下以200 r/min 攪拌2 h 后用四層60 目紗布濾去豆渣，再使用高速離心機離心（8 000 r/min，20 min，25 ℃），去除沉淀取上清液，用2 mol/L 鹽酸調節pH 值至4.5 后，靜置10 min 后離心（8 000 r/min，20 min，25 ℃），收集大豆蛋白沉淀。

取此沉淀以1:5 的質量比重新懸浮于去離子水中，并調節pH 值至7.0，獲得大豆蛋白分散液。將此分散液置于100 ℃沸水浴中30 min，然后迅速冷卻至室溫，以此模擬對大豆蛋白進行熱處理。采用小型噴霧干燥塔對此經過熱處理的大豆蛋白分散液進行噴霧干燥，進口溫度：180 ℃，出口溫度：70 ℃，進料速度：2 L/h，收集所得粉體，將該樣品命名為HSP-SPI。另外，采用小型冷凍干燥系統對經過熱處理的大豆蛋白分散液進行冷凍干燥，系統真空度為35 kPa，冷阱溫度為-55 ℃，獲得樣品記為HFD-SPI。

此外，未經熱處理的大豆蛋白分散液，經上述條件進行噴霧干燥所得樣品記為SP-SPI，經上述條件進行冷凍干燥獲得樣品記為FD-SPI。

1.3.2 SPI基本理化性質的表征

參考凱氏定氮法[15]測定制備所得SPI 的蛋白質含量。稱取一定量蛋白粉末于消化管中，添加適量五水合硫酸銅和硫酸鉀作催化劑，加入濃硫酸后進行消化，采用定氮儀對消化液進行蒸餾、吸收、洗滌，以硫酸標準溶液進行滴定，根據滴定結果計算蛋白含量。

SPI 中主要蛋白組分的熱變性溫度及焓值采用DSC 進行測定。稱取3.0 mg 的蛋白粉末置于鋁制坩堝，加入去離子水配制質量分數為20%的蛋白質分散體系，將坩堝壓制密封并儲存過夜，使蛋白充分水化。將坩堝置于DSC 樣品腔中進行分析，待樣品在25 ℃穩定1 min后以5 ℃/min速度升溫至120 ℃，監測此過程中樣品熱量的變化。使用TA Universal Analysis 軟件分析不同蛋白組分的變性溫度（Tpeak）和變性焓值（ΔH）。

蛋白質溶解度采用Lowry 法[16]進行測定。將SPI配制質量分數為1.0%的大豆分離蛋白分散液，室溫下攪拌2 h使蛋白充分水化，分別調節pH值至3.0、 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0。對各分散液進行離心（10 000 r/min，20 min，25 ℃），以福林-酚試劑測定離心前后蛋白分散液的蛋白含量。SPI 的溶解度根據公式（1），即離心前后分散液中蛋白含量的比值計算獲得。

式中：

Sp——SPI 的溶解度，%；

A1——離心后蛋白分散液在500 nm 波長處的吸收值；

A2——離心前分散液在500 nm 波長處的吸收值。

SPI 分散液的ζ-電位采用納米粒度儀利用動態光散射技術進行測定。配制質量分數為0.5%的SPI分散液，在室溫下攪拌2 h，分別調節pH 值至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0。將其注入樣品池，于25 ℃下進行測定。

1.3.3 SPI分散液中蛋白質體積分數的測定

配制質量分數分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%的SPI 分散液，調節pH 值至7.0，將其置于100 ℃沸水浴中進行30 min 熱處理，迅速冷卻至室溫。采用內徑為0.57 mm 的烏氏粘度計測定SPI 分散液在熱處理前后的動力粘度（ν），并通過Lee 公式[17]計算該體系中蛋白質所占的體積分數（φ）、蛋白分散相密度（ρp）及內部蛋白含量（Cp,m/m）。

式中：

ν——運動粘度，Pa·s；

K——粘度計常數，m2/s2；

t——試液流出時間，s。

式中：

η——蛋白分散液運動粘度，Pa·s；

ηs——分散介質運動粘度，Pa·s；

ρ——蛋白分散液密度，kg/m3；

φ——蛋白質所占的體積分數，%。

式中：

ρp——蛋白相密度，kg/m3；

ρs——水相密度，kg/m3。

式中：

Cp,m/m——內部蛋白含量，%。

Cm/v——蛋白分散液的蛋白含量，%。

1.3.4 SPI分散液剪切黏度的測定

采用哈克旋轉流變儀測定經過熱處理（100 ℃，30 min）的質量分數為10%的SPI 分散液的剪切黏度。選用直徑35 mm 的平板探頭，設置板間間隙為1 mm，記錄蛋白分散液在25 ℃、剪切速率為0.1～100 s-1條件下的黏度變化。

1.3.5 SPI熱致凝膠的制備、機械性能及持水性分析

配制質量分數為14%、16%和18%的大豆蛋白分散液，調節pH 值至7.0，將其置于100 ℃沸水浴中加熱30 min，迅速冷卻至室溫形成凝膠。將凝膠切成長15 mm、寬15 mm、高10 mm 的長方體。采用萬能材料試驗儀對凝膠的機械性能進行分析。選用直徑為25 mm 的圓盤探頭對樣品進行單向壓縮，探頭下壓速度為0.2 mm/s，觸發力為0.1 g。根據公式（7）和公式（8）計算壓縮過程中凝膠樣品的Hencky 應變（eh）和Hencky 應力（σt）的變化，并繪制應力-應變曲線。

式中：

h0——測試凝膠樣品的原始高度，mm；

A0——測試凝膠樣品的橫截面積，m2；

ht——凝膠樣品測試時隨時間t時的高度，mm；

Ft——凝膠樣品測試時隨時間t時的載荷，N。

凝膠樣品的斷裂應變（ef）和斷裂應力（σf）分別為樣品應力-應變曲線的最高點處對應的應變和應力。樣品的楊氏模量（Young,s Modulus）為樣品應力-應變曲線的斜率（應變小于5%）。

采用Shin 等[18]報道方法對凝膠樣品進行兩次壓縮，測試條件如下：壓縮形變程度為40%，探頭壓縮及返回速度均為1 mm/s，觸發力為1.0 g，對凝膠的回復性（Resilience）進行計算。

上述制得凝膠樣品中的水分狀態采用核磁共振成像儀進行觀察。主磁場強度為0.5 T，其對應共振頻率SF 為20 MHz，樣品室的溫度為（32.00±0.01）℃，采用CPMG（Carr Purcell Meiboom Gill）脈沖序列測定樣品的橫向弛豫時間（T2）。CPMG 序列采用參數為：采樣點數TD240018，回波個數NECH4000，回波時間TE 0.30 ms，采樣率SW 200 kHz，重復采樣時間間隔5 000 ms，重復采樣次數8。選用反演軟件進行連續譜迭代分析擬合得到各樣品的波譜圖，運算參數為：開始時間0.01 ms，截止時間10 000 ms，參與反演點數200。

1.3.6 數據分析

所有樣品測定均獨立進行三次重復試驗，通過PASW Statistics 18對數據進行方差分析（ANOVA），采用Duncan 檢驗對多組樣本間進行顯著性分析，P＜0.05 表示差異顯著，數據以“平均值±標準差”方式表示。

2 結果與分析

2.1 不同熱處理和干燥方式制得SPI的基本理化性質

為了探究高溫加熱和噴霧干燥兩項熱處理操作對所得蛋白制品凝膠性能的影響，本研究采用噴霧干燥獲得SD-SPI（不經沸水浴處理）和HSD-SPI（經沸水浴處理），以及采用冷凍干燥獲得FD-SPI（不經沸水浴處理）和HFD-SPI（經沸水浴處理）。四種SPI 制備過程包含的熱處理操作及其蛋白含量如表1 所示。各樣品的蛋白含量為81.57%～83.08%，四者之間并沒有顯著差異（P＜0.05）。這表明，不同的熱處理或干燥方式并不會顯著影響所得蛋白制品的蛋白含量。本研究為了簡化操作流程在“堿溶酸沉”后沒有對收集的蛋白沉淀進行酸水洗滌，部分水溶性物質可能仍然保留在蛋白分散液中。因此，最終經不同干燥方式制得蛋白制品的蛋白含量均低于90%。

表1 四種SPI樣品制備過程包含的熱處理操作及其蛋白含量Table 1 The heat treatments conducted during preparation and protein contents of the four SPI obtained in this work

蛋白配料在食品中的應用兼顧不同的pH 值范圍。ζ-電位反映了體系中蛋白分子表面所帶電荷，與其穩定性及聚集傾向有關。為此，本研究考察了經不同處理獲得SPI 在不同pH 值條件下的ζ-電位，其結果如圖1a 所示。各樣品在pH 值 4.0～5.0 范圍下的ζ-電位絕對值接近0，表明其內含蛋白質的等電點在此范圍，這說明不同的熱處理并沒有改變大豆蛋白的等電點。而在遠離此等電點的pH 范圍，體系的ζ- 電位還是有所區別的。與HSD-SPI 和HFD-SPI 相比，相同pH 條件下，SD-SPI 和FD-SPI具有更高的電位絕對值，在pH 值7.0 時，SD-SPI（-26.6 mV）和FD-SPI（-34.5 mV）明顯高于HSDSPI（-11.1 mV）和HFD-SPI（-15.9 mV）。這表明，水浴熱處理明顯減少了大豆蛋白的表面荷電量，削弱了抑制蛋白聚集的分子間靜電斥力[19]。

圖1 四種大豆蛋白樣品在不同pH 條件下的ζ-電位（a）和溶解度（b）Fig.1 ζ-potential (a) and solubility (b) of the soy protein products prepared in this work under various pH conditions

蛋白質在水相體系中的溶解度是食用蛋白質在食品工業中應用最重要的功能特性之一，與蛋白的凝膠、乳化和起泡等功能特性密切相關；具備良好溶解性的蛋白質往往具有良好的功能特性[20]。將本研究制得四種SPI 分散于去離子水中獲得蛋白分散液，將其pH值調節至3.0～8.0，其溶解度如圖1b所示。與以往大多與大豆蛋白相關的報道相一致[21]，各樣品的溶解性均具有pH 依賴性，呈典型的U 型趨勢：各樣品在pH 值4.0～5.0 范圍，也就是接近大豆蛋白等電點的條件下（圖1a），其溶解度最低（約10%）；在遠離大豆蛋白等電點的區域（pH 值3.0和pH 值6.0～8.0），其溶解度較高。制備過程中是否經歷水浴熱處理則顯著影響了SPI 在此pH 值范圍下的溶解度。以pH 值3.0 和7.0 條件下溶解度進行對比，HSD-SPI（31.9%、35.2%）和HFD-SPI（34.6%、42.0%）均低于42%，而SD-SPI（79.1%、79.9%）和FD-SPI（72.8%、69.8%）均高于69%。經過水浴熱處理的前兩者大多情況下的溶解性低于未經水浴熱處理后兩者的50%?？梢?，水浴熱處理明顯降低了所得SPI 樣品的溶解度。就不同的干燥方式進行比較，SD-SPI 與FD-SPI 溶解度曲線較接近，HSD-SPI 與HFD-SPI 溶解度曲線較接近（圖1b）。這表明，干燥方式并不會顯著改變SPI 樣品溶解度，這與以往相關的報道相一致[22]。

2.2 不同熱處理和干燥方式對制備所得SPI熱變性溫度和熱焓值的影響

本研究對經充分水化、質量分數為20%的蛋白分散體系進行DSC 分析，從熱力學的角度考察不同熱處理對SPI 結構的影響，結果如圖2 所示。在升溫過程中，SD-SPI 和FD-SPI 均出現了兩個吸熱峰。前者的雙峰分別出現在78.07 ℃和98.15 ℃；后者則出現在78.41 ℃和97.59 ℃。對照過往文獻報道[23]，這兩個吸熱峰的出現分別是大豆蛋白兩個主要的組分β-伴大豆球蛋白（β-conglycinin，7S 蛋白）和大豆球蛋白（Glycinin，11S 蛋白）在升溫過程中高級結構去折疊所致。FD-SPI 在制備過程中沒有進行水浴加熱，也沒有采用噴霧干燥處理，大豆蛋白盡可能維持其原有的結構。因此，該樣品中的7S 和11S 組分都出現了典型的吸熱峰。SD-SPI樣品兩個吸熱峰對應的溫度及焓值均非常接近FDSPI；這表明，短時熱處理的噴霧干燥并沒有破壞大豆蛋白主要組分原有的結構。經歷了水浴熱處理的HSD-SPI 和HFD-SPI 的DSC 分析圖中只出現了基線，并沒有出現7S 和11S 組分對應的吸熱峰。這說明，水浴熱處理使得大豆蛋白主要組分的高級結構去折疊；當將其樣品進行DSC 分析時，其中的蛋白質已不具備原有的高級結構。圖2 的DSC 分析結果顯示，當SD-SPI 和FD-SPI 分散于水相體系，對其進行熱處理時，其中的大豆蛋白仍然可以經歷高級結構去折疊，繼而發生聚集的過程[7]。由于在制備過程中蛋白質的高級結構已被破壞，HSD-SPI 和HFD-SPI中的大豆蛋白實際上處于去折疊的狀態，當其分散液被加熱時，已不再呈現出的蛋白變性、去折疊和聚集的典型行為[7]。

圖2 四種大豆蛋白樣品DSC 分析圖Fig.2 DSC analysis of the soy protein products prepared in this work

2.3 不同熱處理和干燥方式對制備所得SPI熱聚集行為的影響

熱處理是食品加工和食物制作中最常用的操作。蛋白質高級結構在此過程中勢必受到影響，繼續發生去折疊、隨之聚集，最終形成不同的結構。當蛋白質在熱處理時以相對有序的方式發生聚集，并形成規則的結構甚至三維凝膠網絡，可以為食品體系帶來良好的咀嚼感或口感體驗[24]。本研究將制備所得的SPI 配制成不同質量分數的分散液（pH值7.0），對其進行熱處理（100 ℃，30 min），采用烏氏黏度計對蛋白分散液的黏度進行測定；將這些體系中的蛋白質看作懸浮顆粒，并利用Lee 公式計算這些體系中蛋白所占的體積分數、容積度（Voluminosity）、顆粒內部蛋白含量和相密度，以流變學的角度考察這些樣品所含蛋白質的熱聚集行為，結果如圖3 所示。

圖3 不同質量分數（0.5%～3.0%）大豆蛋白分散液（pH 值7.0）經過熱處理后（100 ℃，30 min）的蛋白體積分數（a）、容積度（b）、內部蛋白含量（c）和相密度（d）Fig.3 Protein volume fraction (a), voluminosity (b), internal protein content (c), and phase density (d) of the soy protein dispersions (pH value 7.0) with various solid contents (0.5%～3.0%) after heat treatment (100 ℃，30 min)

從圖3a 可知，蛋白質在各體系中所占體積分數均隨質量分數增加（0.5%～3.0%）而增加。進行熱處理前，蛋白質在SD-SPI 和FD-SPI 體系中，約從10%增加至30%。進行熱處理后，蛋白質在這兩個體系中的體積分數約從5%增加至20%。另一方面，蛋白質在HSD-SPI 和HFD-SPI 體系中所占體積分數在加熱前后均從10%增加40%，熱處理并沒有顯著改變懸浮顆粒所占體積分數。各大豆蛋白樣品分散液在加熱前后的參數變化也呈相同的趨勢（圖3b、3c 和3d）。也就是SD-SPI 和FD-SPI 中蛋白質的容積度、顆粒內部蛋白含量及相密度在熱處理后均出現了明顯的變化。而HSD-SPI 和HFD-SPI中蛋白質各參數在熱處理前后的差異并不顯著。這一結果與DSC 分析的結果是一致的。

SD-SPI 和FD-SPI 中的蛋白質所占體積分數在經歷熱處理后出現明顯下降可能是這兩個樣品中的蛋白質在升溫時發生高級結構去折疊（圖2）、隨之發生聚集所導致的。與天然蛋白相比，熱誘導形成聚集體的結構更緊密（容積度下降，圖3b），蛋白質傾向分布于顆粒的內部（顆粒內部蛋白含量增加，圖3c）。這表明，這兩個樣品中的蛋白質在熱處理時可以發生聚集，并組裝形成具有一定結構的聚集體。HSD-SPI 和HFD-SPI 是經過水浴熱處理制得的SPI，其中的蛋白質更多以去折疊聚集體的形式存在；這些聚集體的形成已經消耗了大量可以提供疏水作用、氫鍵等相互作用的側鏈基團位點[25]。這兩個樣品的參數在加熱前后沒有發生明顯改變，說明這兩個樣品中的大部分蛋白質在此過程中沒有發生進一步的聚集，其聚集體的結構沒有發生明顯改變。熱處理未能破壞維持聚集體穩定的次級鍵，因而聚集體之間缺乏進一步聚集的作用位點[7]。以上結果表明，SPI 制備過程中的水浴熱處理可以顯著改變所得蛋白制品的熱聚集行為；而干燥方式，尤其是短時熱處理的噴霧干燥，則不會對所得產品的聚集能力帶來顯著的影響。

2.4 不同熱處理和干燥方式對制備所得SPI熱致成膠性能的影響

把水相體系中蛋白質質量分數提高至一定的范圍，對其進行熱處理，隨著其結構展開、聚集，蛋白質分子的數量足以通過二硫鍵、疏水作用和氫鍵等形成三維網絡結構，將水束縛于其中，蛋白基凝膠便得以形成[26,27]。在此過程中，參與形成凝膠網絡的蛋白分子數量、驅動蛋白聚集分子間相互作用的強度及數量均是所得蛋白凝膠機械性能的影響因素。蛋白分子間可以產生相互作用的位點越多，越有利于形成具有更高強度的凝膠結構。本研究在上一部分展示了不同樣品低質量分數（＜3.0%）分散液中大豆蛋白的熱聚集行為。由于其蛋白含量較低，蛋白只能形成聚集體，而不能形成凝膠網絡。為了考察不同樣品熱致成膠性能，本研究需配制質量分數超過10%的分散體系，在其可以成膠的質量分數范圍對其進行熱處理（100 ℃，30 min），待其冷卻后，測定所得凝膠的機械性能。

圖4 顯示的是本研究制備所得質量分數為10%蛋白分散液（pH 值7.0）的剪切黏度。結果表明，HSD-SPI 和HFD-SPI 分散液的黏度均呈典型的剪切變稀趨勢，兩者之間并沒有顯著差異。SD-SPI 和FD-SPI 分散液的黏度在該測試所選的剪切速率范圍內（0.1～100 s-1）的下降幅度并不顯著。值得注意的是，在剪切速率較低時（0.1 s-1），SD-SPI 和FD-SPI 樣品的黏度比HSD-SPI 和HFD-SPI 樣品低了4 個數量級。這說明，后兩者的黏度顯著高于前兩者。兩種組合之間黏度的差異再一次表明，經過水浴熱處理制得HSD-SPI 和HFD-SPI 中的大豆蛋白可能是以聚集體的形式存在，而SD-SPI 和FDSPI 中可能更多的是未發生明顯聚集、具有原有結構的大豆蛋白。

圖4 四種大豆蛋白樣品分散液（質量分數為10%）的剪切黏度Fig.4 Shearing viscosity of soy protein dispersions(solid content: 10%)

為了使不同SPI 制得凝膠之間機械性能的差異更明顯，本研究將各SPI 配制成質量分數為14%、16%和18%的分散液（pH 值7.0），對其進行熱處理，制得凝膠機械性能如圖5 所示。楊氏模量描述的是固體材料抵抗形變能力的物理量，在本研究中與凝膠的剛性（Stiffness）有關。圖5a 的結果顯示，各樣品制得凝膠的楊氏模量均隨質量分數增加而增加。SD-SPI 和FD-SPI 的楊氏模量分別從2.30 kPa和2.03 kPa 增加至3.87 kPa 和8.35 kPa；而HSDSPI 和HFD-SPI 則分別從5.97 kPa 和3.73 kPa 增加至9.95 kPa 和15.27 kPa。這表明，已經過水浴熱處理制得SPI 可以獲得具有更高硬度的熱致凝膠。

圖5 四種SPI 不同質量分數（14%～18%）分散液經熱處理制得凝膠的機械性能Fig.5 Mechanical properties of soy protein gels induced by heat treatment with various solid contents (14%～18%)

凝膠樣品被壓縮至斷裂時對應的應力和應變與其韌性有關，凝膠在更大的應力和應變發生斷裂表明其韌性更強。如圖5b 和5c 所示，三個質量分數制得SD-SPI 凝膠的斷裂應力分別為5.30、10.80 和8.59 kPa， 各FD-SPI 凝膠為8.09、12.50 和22.91 kPa；對應HSD-SPI 凝膠的斷裂應力為2.39、3.69和5.52 kPa，HFD-SPI 凝膠的斷裂應力為2.08、4.36和11.59 kPa。顯然，以質量分數為14%和16%分散液制得SD-SPI 和FD-SPI 凝膠的韌性明顯高于由HSD-SPI 和HFD-SPI 蛋白制得的凝膠樣品。凝膠的回復性數據與其彈性有關，如圖5d 所示。隨著質量分數增加，SD-SPI 和FD-SPI 分別從0.43 和0.40增加至0.49 和0.49；對應的HSD-SPI 和HFD-SPI則分別從0.20 和0.31 增加至0.34 和0.39。與斷裂應變和應力結果變化趨勢相一致，前兩者制得凝膠可以展示出更高的彈性，而由后兩者制得凝膠的彈性較低。

對于一般蛋白基凝膠而言，其剛性和韌性的表現往往與蛋白質網絡組裝形成方式有關，是凝膠口感形成的兩個不同的發展方向。前述結果表明，經過水浴熱處理制得HSD-SPI 和HFD-SPI 具有更低的蛋白溶解度（圖1），其中蛋白質多以聚集體形式存在（圖2），其分散液具有更高的黏度（圖4）；當體系中蛋白質含量提高，這些聚集體在熱處理過程中可能通過進一步纏繞形成凝膠網絡，可以形成剛性較高、韌性和彈性較差的凝膠（圖5）。未經水浴熱處理制得SD-SPI 和FD-SPI 具有良好的水溶性（圖1），其中蛋白質大多得以保留原有結構，其分散液黏度較低；這些蛋白質在熱處理中經歷了高級結構去折疊、聚集等過程，蛋白分子之間可以產生數量更多的相互作用位點（圖2 和圖3），形成相對有序的凝膠網絡，從而賦予凝膠更強的韌性和彈性（圖5），但所得凝膠的剛性弱于HSD-SPI 和HFDSPI 凝膠?？梢?，在SPI 制備過程中水浴熱處理對制得SPI 的熱聚集行為具有顯著的影響，使其形成具有不同機械性能的凝膠。

就經過不同干燥方式獲得SPI 進行比較，各樣品的溶解度、高級結構、聚集行為及所成凝膠的機械性能沒有顯示出顯著的差異。這表明，與冷凍干燥相比，噴霧干燥雖然涉及了對蛋白料液進行短時加熱，但該操作未對所得SPI 的理化性質及功能特性帶來顯著的影響。

以上述質量分數為14%的大豆蛋白熱致凝膠進行LF-NMR 分析，對凝膠中水分的狀態進行考察，所得圖譜如圖6 所示。信號峰對應的弛豫時間（T2）與凝膠中水分和蛋白網絡結合的緊密程度有關[28]。SD-SPI 和FD-SPI 凝膠在弛豫時間（T2）峰值分別在2.3、15.7 和126.0 ms 和1.48、18.0 和135.1 ms處出現了3 個明顯的信號峰。其中，第3 個峰均為兩個樣品的主峰，峰面積分別占了總面積的97.9%和96.3%。這表明，這兩凝膠樣品的的水分大多處于不易移動的狀態[28]。HSD-SPI 和HFD-SPI 凝膠則出現了四個信號峰。其中，相應的主峰分別出現在T2為117.0 ms 和126.0 ms，峰面積分別占比93.9%和94.4%。相對于前述SD-SPI 和FD-SPI 凝膠，這兩樣品的主峰變寬、峰面積占比減少。此外，兩者分別在541.0 ms 和880.0 ms 處出現了第4 個小峰。這表明，HSD-SPI 和HFD-SPI 凝膠網絡限制其中水分移動的作用有所減弱。這也反映了由于以蛋白聚集體纏繞形成凝膠網絡與水分子相互作用親水基團位點減少，其持水性有所下降[29]。而SD-SPI 和FDSPI 兩者在熱處理過程中以相對有序的方式發生聚集，凝膠網絡的形成和其與水分子的相互作用相對更平衡，因而所成凝膠具有更好的持水性。

圖6 四種SPI 樣品分散液（質量分數為14%）經熱處理制得凝膠的弛豫時間（T2）圖譜Fig.6 Relaxation times (T2) of soy protein gels induced by heat treatment with fixed solid contents (14%)

3 結論

本研究對經SPI 制備常規采用的“堿溶酸沉”法收集獲得大豆蛋白進行熱處理，并采用噴霧干燥制備獲得SPI，將其配制成不同質量分數的分散液，對其進行熱處理，觀察其聚集行為，并對其所成凝膠的機械性能和持水性，以此考察大豆蛋白分離制備過程中熱處理和噴霧干燥對所得產品熱致成膠性能的影響。結果表明，經過熱處理制得的SPI 多以聚集體的形式存在，其溶解性顯著低于未經過熱處理制得的SPI；這些聚集體再次經歷熱處理時，并沒有展現出進一步聚集并形成有序結構的趨勢；其所成凝膠的硬度顯著高于沒有經過熱處理制得的SPI 樣品制備的凝膠，但其韌性和彈性則顯著低于后者。相對于經過冷凍干燥制得的大豆蛋白，經噴霧干燥制得樣品在溶解性、高級結構、聚集行為和凝膠性能等方面沒有呈現出顯著差異?？梢?，SPI制備過程中對大豆蛋白進行升溫熱處理是影響所得蛋白產品溶解性、聚集行為和凝膠性能的關鍵步驟。針對熱處理對蛋白產品性質的負面影響，尋找替代的工藝方法，使所得產品既符合相關法規的要求，也能提高其品質和功能特性，最終拓展大豆蛋白產品在食品工業尤其是植物基食品中的應用。