低共熔溶劑提取荔枝殼中的原花青素及其抗氧化活性

鄭德瑜，張瑞芬，黃菲，董麗紅，張名位，郭朝萬，賈栩超*

（1.廣東海洋大學食品科技學院，廣東湛江 524088）

（2.廣東省農業科學院蠶業與農產品加工研究所，農業農村部功能食品重點實驗室，廣東省農產品加工重點實驗室，廣東廣州 510610）

（3.廣東丸美生物技術股份有限公司，廣東廣州 510530）

荔枝（Litchi chinensis）是一種廣泛種植于全球熱帶至亞熱帶地區的水果作物，中國、泰國、印度以及越南等亞洲國家是荔枝的主要產區[1]。荔枝是非呼吸躍變型水果，成熟期集中，采后易腐敗，不宜長期儲藏[2]。開展荔枝加工可以緩解鮮銷壓力，并能夠提升荔枝的經濟附加值。荔枝加工主要集中于荔枝果肉，其果殼和果核則作為副產物被丟棄，造成一定的資源浪費與損失[3]。荔枝殼富含水溶性多糖以及黃酮、酚酸與原花青素等酚類活性物質，其中原花青素是荔枝果殼的重要活性成分，且構型以A 型為主[4,5]。前期研究表明荔枝殼具有抗氧化、抗炎以及美白等作用，可作為活性物質用于功能食品和日化產品開發[6]。

目前，原花青素傳統的提取方法是乙醇浸提法，提取時間長、溫度高，對原花青素的穩定性和化學組成有一定的影響，同時也會降低其生物活性[7]。低共熔溶劑（Deep Eutectic Solvent，DES）是由兩種或以上的試劑分別以氫鍵供體（Hydrogenbond Donor，HBD）和氫鍵受體（Hydrogen-bond Acceptor，HBA）的形式在一定的溫度下通過氫鍵作用結合形成的高粘度透亮的溶劑[8]。低共熔溶劑具有較強的穿透植物細胞壁能力，并且能與酚類、黃酮類物質形成氫鍵鍵合，增加生物活性物質的提取率[9]。此外，低共熔溶劑還能增強生物活性物質的抗菌、抗氧化等活性，改善生物活性物質的熱穩定性和儲藏穩定性[10,11]。因此，既能兼容安全性、環保性，又能保證提取效率的低共熔溶劑有望成為原花青素的理想提取溶劑[12]。目前，低共熔溶劑廣泛應用于橄欖、馬鈴薯、甜菜根等原料的多酚和黃酮物質提取，而在原花青素的提取中應用還相對較少[13]。

本文通過對比4 種低共熔溶劑和70%（V/V）乙醇提取的荔枝殼原花青素的得率、平均聚合度、化學組成及抗氧化活性，篩選出最佳的低共熔溶劑。并進一步考察料液比、DES 摩爾比、DES 含水量、提取時間及提取溫度5 個單因素對荔枝殼原花青素提取的影響，結合正交優化，明確荔枝殼原花青素的最佳提取工藝，并對提取物的抗氧化活性進行分析。旨在為荔枝殼原花青素的綠色高效提取制備和高值化利用提供理論依據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

荔枝殼（妃子笑），采購于廣東省廣州市；氯化膽堿、1,3-丁二醇、4-二甲基氨基肉桂醛、香草醛，上海麥克林生化有限公司；尿素，天津市永大化學試劑有限公司；乳酸、甘油、無水乙醇，天津市富宇精細化工有限公司；無水甲醇，廣東光華科技股份有限公司；磷酸氫二鈉、亞硝酸鈉，天津市福晨化學試劑有限公司；檸檬酸、過硫酸鉀，天津市百世化工有限公司；福林酚試劑、熒光素鈉、2,2’-偶氮二（2-甲基丙基咪）二鹽酸鹽（2,2’-Azobis(2-methylpropionamidine) Dihydrochloride，AAPH），美國Sigma 公司；氫氧化鈉、三氯化鋁（結晶），天津市大茂化學試劑廠；濃鹽酸，廣州化學試劑廠；2,2’-聯氨-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2,2’-Azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic Acid)，ABTS），上海阿拉丁試劑有限公司；1,1-二苯-2- 苦基肼（2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH），上海源葉公司；高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography，HPLC） 級甲醇、乙酸和乙腈，Thermo Fisher Scientific 公司；沒食子酸、低聚原花青素（UV ≥ 95%）、水溶性維生素E（Trolox）、原花青素B1、表兒茶素、蘆丁、原花青素A2 以及山奈酚-3-O-蕓香糖苷標準品購于上海源葉公司和Sigma 公司，其他試劑均為國產分析純；蒸餾水。

1.2 主要儀器與設備

EYELAN-1100 旋轉蒸發儀：東京理化器械株式會社；T25 digital 分散機：德國IKA 公司；Infinite M200pro 多功能酶標儀：瑞士Tecan 公司；LC-20 高效液相色譜儀、UV-1800 紫外可見分光光度計：日本島津有限公司。

1.3 DES的制備

按照表1 的摩爾比分別稱取一定質量的氫鍵受體和氫鍵供體于圓底燒瓶中，并放入在70 ℃水浴下旋蒸，直至形成透亮無晶體的粘稠溶液的狀態，即得到DES-1～4。

表1 不同種類DES的配比Table 1 Proportioning of different DESs

1.4 荔枝殼原花青素的提取

將1 g 荔枝殼（剪刀剪碎）分別加入30 mL 的體積分數均為70%（V/V）的DES 與乙醇溶劑當中，使其料液比為1:30（g/mL），在室溫下通過8 000 r/min 分散機均質2 min 后，置于60 ℃水浴提取120 min。待提取完成后，冷卻抽濾，除去荔枝殼渣，并旋蒸去除水分，最后用無水甲醇定容至50 mL，即得到荔枝殼提取液。

1.5 荔枝殼提取液組成成分測定

1.5.1 總酚的測定

采用福林酚方法[14]測定荔枝殼提取液的總酚含量。取125 μL 荔枝殼提取液與500 μL 蒸餾水和125 μL 福林酚試劑混勻，避光反應6 min，再加入1.25 mL 7%（m/V）的Na2CO3避光反應90 min，在760 nm 處測其吸光值。以沒食子酸為標準品制作標準曲線（0.03～0.30 mg/mL)，荔枝殼提取液的總酚含量以每毫升提取液中所含沒食子酸當量（Gallic Acid Equivalent，GAE）表示，即mg GAE/mL。

1.5.2 總黃酮的測定

采用NaNO2-AlCl3·6H2O-NaOH 方法[15]測定荔枝殼提取液的總黃酮含量。取300 μL 荔枝殼提取液與1.5 mL 蒸餾水和90 μL 5%（m/V）NaNO2試劑混勻，靜置反應6 min，再加入180 μL 10%（m/V）的AlCl3·6H2O 靜置反應5 min，最后加入600 μL 1 mol/L 的NaOH 和330 μL 蒸餾水后，在510 nm 處測其吸光值。以蘆丁為標準品制作標準曲線（0.03～0.40 mg/mL），荔枝殼提取液的總黃酮含量以每毫升提取液中所含蘆丁當量（Rutin Equivalent，RE）表示，即mg RE/mL。

1.5.3 原花青素含量的測定

采用4-二甲基氨基肉桂醛（DMAC）方法[16]測定荔枝殼提取液的原花青素含量。取0.05 g DMAC 置于50 mL 含有12.5%（V/V）濃鹽酸的70%（V/V）酸化乙醇溶液混勻，即為DMAC 反應液。依次取70 μL 荔枝殼提取液和210 μL DMAC 反應液加到96 孔板中，避光靜置反應25 min，在640 nm 處測其吸光值。以酸化乙醇作試劑空白組；用無水甲醇作樣品空白組。以原花青素標準品制作標準曲線（0.01～0.50 mg/mL），荔枝殼提取液的原花青素含量以每毫升提取液中所含原花青素標品當量（Procyanidins Equivalent，PE）表示，即mg PE/mL。

1.5.4 原花青素平均聚合度（mDP）的測定

根據魏冠紅等[17]的方法測定荔枝殼提取液的平均聚合度。取一定量的荔枝殼提取液，分別用無水甲醇或者乙酸稀釋至一定體積。其中用無水甲醇稀釋的荔枝殼提取液來測定原花青素的質量，取0.5 mL 樣液依次與3 mL 4 g/100 mL 的香草醛-甲醇溶液和1.5 mL 濃鹽酸混勻，靜置反應15 min，在500 nm處測其吸光值，并以無水甲醇作試劑空白組。以兒茶素標準品制作標準曲線（68.97～500.00 μg/mL），荔枝殼提取液的原花青素含量以每毫升提取液中所含兒茶素標品當量（Catechin Equivalent，CE）表示，即μg CE/mL。而用乙酸稀釋的荔枝殼提取液來測定原花青素的物質的量，取1 mL 樣液與5 mL 4% HCl（V/V）-0.5%香草醛（m/V）乙酸溶液混勻，靜置反應5 min，在500 nm 處測其吸光值，并以0.5%（m/V）香草醛乙酸作試劑空白組。以兒茶素標準品制作標準曲線（0.07～0.35 μmol/mL），荔枝殼提取液的原花青素物質的量以每毫升提取液中所含兒茶素標品當量（Catechin Equivalent，CE）表示，即μmol CE/mL。其平均聚合度（Mean Degree of Polymerisation，mDP）計算公式為：

式中：

D——原花青素平均聚合度（mDP）；

m——原花青素的質量，μg CE/mL；

M——兒茶素的相對分子質量，為290；

n——原花青素物質的量，μmol CE/mL。

1.5.5 荔枝殼提取液中主要化學成分分析

采用HPLC 測定荔枝殼提取液中主要化學成分的組成成分及含量。色譜柱為ZORBAX SB-C18 column（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A 相為0.1%乙酸水（V/V），B 相為乙腈；梯度洗脫程序如下：0～35 min，5%～32% B；35～40 min，32%～50% B；40～45 min，50%～60% B。檢測波長為254 nm；流速為1 mL/min；柱溫為40 ℃；進樣量為10 μL。通過與原花青素B1、表兒茶素、蘆丁、原花青素A2以及山奈酚-3-O-蕓香糖苷等標準品的保留時間進行對比進行色譜峰的鑒定，化合物的含量則通過峰面積代入標準物質的標準曲線進行計算確定。

1.6 DES提取荔枝殼原花青素的單因素試驗設計

在初始條件（料液比為1:30（g/mL）、DES 含水量為30%、DES 摩爾比為1:2、提取時間為120 min、提取溫度為60 ℃）下，以提取物的原花青素含量為指標，采用控制變量法分別對料液比（1:10、1:20、1:30、1:40、1:50，g/mL）、DES 摩爾比（1:2、1:3、1:4、1:5、1:6）、DES 含水量（0%、15%、30%、50%、70%，V/V）、提取時間（30、60、90、120 min）以及提取溫度（40、50、60、70 ℃）5 個因素進行單因素試驗。

1.7 DES提取荔枝殼原花青素的正交試驗設計

在1.6 單因素試驗基礎上，分別選取DES 摩爾比、DES 含水量、提取時間和提取溫度，進一步研究4 個因素對荔枝殼原花青素提取含量的影響，采用L9(43)進行正交試驗，因素水平見表2。

表2 正交試驗因素與水平設計Table 2 Orthogonal experimental design

1.8 抗氧化活性

1.8.1 ORAC抗氧化能力

根據盧琦等[14]的方法測定荔枝殼提取液的氧自由基吸收能力（Oxgen Radical Absorbance Capacity，ORAC)。以75 mmol/mL pH 值7.4 的磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffered Saline，PBS）作為稀釋液，將樣品溶液稀釋至一定體積，并取20 μL 加入黑色96 孔板中37 ℃孵育10 min，再加入200 μL 0.96 μmol/L 熒光素鈉溶液37 ℃孵育20 min，最后，加入20 μL 119 mmol/L AAPH 自由基溶液（除空白孔外），并置于激發波長485 nm，發射波長520 nm 的酶標儀下測定各個孔的熒光值，每4.5 min 循環1 次，共循環35 次。以PBS 作為空白組，不同質量濃度水溶性維生素E（Trolox）標準品（6.25～50.00 μmol/L）制作標準曲線，計算提取液中的ORAC 值，結果以Trolox 當量表示，單位為μmol TE/ mL。

1.8.2 DPPH自由基清除能力

稱取3.9 mg DPPH 溶解于100 mL 甲醇配制成0.1 mmol/L 的DPPH 工作液，并將樣品配成不同體積的溶液。用移液槍移取100 μL 樣品溶液與現配制的DPPH 工作液200 μL 充分混勻。常溫避光反應30 min 后在517 nm 處測定吸光值A1（實驗組），同時測定100 μL 樣品溶液與200 μL 甲醇溶液的吸光值A2（實驗空白組）以及100 μL 樣品溶劑與200 μL DPPH 工作液的吸光值A0（空白對照組），根據以下公式（2）算出清除率（Clearance，C），結果以提取液中所含原花青素標品（Procyanidins Equivalent，PE）為當量，單位為μg PE/mL，用Graphpad Prism 7.0 軟件求出IC50值。

式中：

C1——DPPH 自由基清除率；

A0——空白對照組的吸光值；

A1——實驗組的吸光值；

A2——實驗空白組的吸光值。

1.8.3 ABTS+自由基清除能力

稱取66.23 mg K2S2O8溶解于100 mL 蒸餾水配制成2.45 mmol/L 的K2S2O8溶液，再稱取19.20 mg ABTS 溶解于5 mL 2.45 mmol/L 的K2S2O8溶液制備成7 mmol/L ABTS 儲備液。將適量的ABTS 儲備液用10 mmol/L pH 值 8.0 的磷酸鹽緩沖液稀釋至在734 nm處的吸光值為（0.70±0.05），配制成ABTS 工作液。用移液槍移取不同體積的樣品溶液50 μL 與現配制的ABTS 工作液200 μL 充分混勻。室溫避光反應6 min 后在734 nm 處測定吸光值A1（實驗組），同時測定50 μL 樣品溶液與200μL 磷酸鹽緩沖溶液的吸光值A2（實驗空白組）以及50 μL 樣品溶劑與200 μL ABTS工作液的吸光值A0（空白對照組），根據以下公式（3）算出清除率（Clearance，C），結果以提取液中所含原花青素標品為當量，單位為μg PE/mL，用Graphpad Prism 7.0 軟件求出IC50值。

式中：

C2——ABTS+自由基清除率；

A0——空白對照組的吸光值；

A1——實驗組的吸光值；

A2——實驗空白組的吸光值。

1.9 數據分析

所有實驗均重復三次，實驗數據采用SPSS 19.0軟件進行Duncan 檢驗和獨立樣本T檢驗統計分析，采用Graphpad Prism 7.0 和Origin 2018 作圖。定量數據采用“平均值±標準差”表示，不同字母表示存在顯著性差異（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 DES種類篩選

不同DES 對荔枝殼多酚類物質的提取效果如表3 所示，提取液中原花青素含量DES-3＞DES-2＞ DES-4＞DES-1＞70%（V/V）乙醇，其中DES-3提取的原花青素含量可達3.71 mg PE/mL，為70%（V/V）乙醇提取的1.3 倍。呈酸性的DES-2、DES-3、DES-4 比70%乙醇及堿性溶劑DES-1 擁有更高的極性，因此能與原花青素更穩定地結合，進而表現出更高的提取得率[18]。而DES-1 溶劑呈堿性，且原花青素在堿性條件下易降解，因此原花青素含量在四種低共熔溶劑中最低[19]。Zain 等[20]采用了6 種不同DES 提取油棕黃酮，發現氯化膽堿-丁二醇提取的油棕黃酮的含量最高。Wang 等[21]通過篩選9 種不同醇基、酸基與糖基的DES 提取槐花中的黃酮類物質，最終發現氯化膽堿-丁二醇為溶劑時提取槐花黃酮的效果最好。這可能因為以丁二醇為HBD 的DES 含有的羥基更多，流動性更好，且對活性物質的氫鍵結合作用更強的緣故[22]。此外，也考察了DES 提取對原花青素mDP的影響。從表3 中可以發現在DES 中，只有堿性DES-1 提取原花青素的mDP顯著低于乙醇提取。根據馬燁[23]的研究表明，原花青素在pH 值大于7的堿性環境下的穩定性顯著降低，多聚體的原花青素結構被破壞降解成低分子量物質，因而其原花青素的mDP和提取得率都較低，所以DES-1 不適合荔枝殼原花青素的提取。

進一步比較了不同低共熔溶劑提取液中酚和黃酮的含量，DES-2、DES-3 和DES-4 提取液中的黃酮含量高于乙醇提?。≒＜0.05），而只有DES-3 提取液中的總酚含量（2.92 mg GAE/mL）顯著高于乙醇提取液（P＜0.05）。氧自由基清除能力結果表明三種低共熔溶劑提取液（DES-2、DES-3、DES-4）的ORAC 值顯著高于乙醇提?。≒＜0.05），其中DES-3 的ORAC 活性最強（3 406.05 μmol TE/mL），而DES-1 的抗氧化能力顯著低于乙醇提取液。結合不同溶劑提取液的原花青素、總酚、總黃酮含量和mDP以及抗氧化活性結果可知，DES-3 最適合作為荔枝殼原花青素的提取溶劑。

同時，通過HPLC 分析4 種DES 與70%（V/V）乙醇作為溶劑時提取物的化學組成，結果如圖1 所示，4 種DES 與70%（V/V）乙醇提取物中的主要成分較為類似，主要色譜峰基本一致。通過比對酚類標準品的保留時間，鑒定出5 種單體物質，分別是原花青素B1、表兒茶素、蘆丁、原花青素A2 以及山奈酚-3-O-蕓香糖苷，與已報道的荔枝殼原花青素的主要化學成分結果一致[24,25]。進一步測定了5 種單體酚類的含量，結果表明（表4）5 種溶劑的提取物中均為原花青素A2 含量最高，其次是蘆丁，山奈酚-3-O-蕓香糖苷含量最少。楊麗珍[25]通過UPLC-Q-TOF/MS 分析鑒定出荔枝殼含有原花青素A2、兒茶素、山奈酚-3-O-葡萄糖苷、蘆丁等12 種酚類物質，并也發現原花青素A2 的含量最高（96.04 mg/g）。此外，4 種DES 提取原花青素A2 與蘆丁的能力都高于70%（V/V）乙醇，其中以DES-3 提取的能力最強。所以，DES-3 被選為后續的提取溶劑。

圖1 不同溶劑提取荔枝殼原花青素的高效液相分析圖Fig.1 Liquid chromatogram of litchi pericarp procyanidins extracted with different solvents

表4 不同溶劑提取荔枝殼原花青素的主要化學成分分析Table 4 Chemical constituents of litchi pericarp procyanidins extracted with different solvents (mg/mL)

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 料液比對提取物中原花青素含量的影響

料液比不僅是影響提取原花青素的因素之一，還是提取工藝的成本優化的主要參數。結果如圖2所示，料液比從1:10（g/mL）提高到1:30（g/mL）時，原花青素的提取含量呈增加趨勢，達到顯著水平（P＜0.05）。但隨著料液比進一步增大，荔枝殼原花青素提取含量呈下降趨勢，這可能是由于過量地增加DES-3 量，DES-3 與原花青素的氫鍵作用減弱，反而使得原花青素提取含量下降[26]。但因料液比在1:20 與1:30（g/mL）的提取含量差異不顯著（P＜0.05），考慮成本節省，避免不必要的試劑浪費，故選擇1:20 為最佳料液比。

圖2 料液比對提取物中原花青素含量的影響Fig.2 Effect of material-liquid ratio on the content of procyanidins in extracts

2.2.2 DES摩爾比對提取物中原花青素含量的影響

DES 的HBD 與HBA 的選擇能夠直接決定其物理化學特性，所以HBD 與HBA 摩爾比能影響DES的分子性能[27]。如圖3 所示，荔枝殼原花青素提取含量隨著DES-3 摩爾比（HBA:HBD）的增加出現先上升后下降，當DES-3 摩爾比在1:4 時，荔枝殼原花青素提取含量為4.05 mg PE/mL，隨著DES-3摩爾比的提高，DES-3 相互作用力的減弱，從而原花青素的提取量下降[21]。因此，選擇DES-3 摩爾比的比值為1:3～1:5 間作為工藝優化范圍。

圖3 DES 摩爾比對提取物中原花青素含量的影響Fig.3 Effect of molar ratio on the content of procyanidins in extracts

圖4 DES 含水量對提取物中原花青素含量的影響Fig.4 Effect of water content of DES on the content of procyanidins in extracts

2.2.3 DES含水量對提取物中原花青素含量的影響

DES 的含水量是影響荔枝殼原花青素提取含量的重要因素之一。DES 是具有高粘度特性的溶劑，但因其特性使之流動性差，阻礙了分子的擴散作用，從而遏制DES 與提取物之間的傳質過程[28]。隨著DES-3 含水量從0%～50%（V/V）增加，能使DES-3 的粘度降低，流動性增強，促進DES-3 與荔枝殼的傳質過程，原花青素的提取率也逐漸升高至3.88 mg PE/mL[29]。但當含水量高于50%（V/V）時，可能會削弱DES-3 組分之間的氫鍵作用，破壞了DES-3 的分子結構，致使荔枝殼原花青素的提取含量下降[30]。因此，選擇DES-3 的含水量為30%～70%（V/V）作為考察水平。

2.2.4 提取時間對提取物中原花青素含量的影響

在60 min 提取時間下，隨著提取時間的增加，DES-3 充分滲透于荔枝殼中，促進固液相的傳質過程，而隨提取時間延長，提取物和提取溶劑之間達到一定平衡[31]。由圖5 可知，在提取時間長達60 min 時，原花青素在DES-3 的溶解度達到最大值3.96 mg PE/mL。但是，60 ℃下過長的提取時間不僅不能增加原花青素的提取含量，反而會使原有的原花青素發生分解反應，導致其含量降低[32]。因此，選擇30～90 min 的提取時間為正交因素水平。

圖5 提取時間對提取物中原花青素含量的影響Fig.5 Effect of extraction time on the content of procyanidins in extracts

由圖6 可知，當溫度從40 ℃升高到50 ℃時，荔枝殼原花青素提取含量達到3.77 mg PE/mL，可歸因于提取溫度的升高能使DES-3 熱膨脹，分子的動能和遷移率升高，有利于DES-3 對荔枝殼細胞的滲透以及促進與荔枝殼原花青素之間的氫鍵結合[33,34]。但溫度從50 ℃到70 ℃進一步增加時，原花青素熱穩定性下降，且易發生氧化反應，致使原花青素的含量下降[35]。

圖6 提取溫度對提取物中原花青素含量的影響Fig.6 Effect of extraction temperature on the content of procyanidins in extracts

2.3 正交試驗結果

DES-3 提取荔枝殼原花青素正交優化工藝如表5 所示，以原花青素含量為指標，其各個因素通過極差分析可得到影響原花青素提取量的主次順序：B＞C＞D＞A，即DES 含水量＞提取時間＞提取溫度＞DES 摩爾比。由表6 的試驗結果方差分析可知，各個單因素（DES 摩爾比、DES 含水量、提取時間及提取溫度）均對原花青素提取量有顯著性影響（P＜0.05）。

表5 正交試驗結果Table 5 Results of orthogonal experiment

表6 試驗結果方差分析Table 6 Analysis of variance of orthogonal experiment results

2.4 驗證實驗

為了更深入研究正交試驗結果的可靠性，將正交試驗結果得到的最優工藝A2B2C3D3，即DES 摩爾比為1:4、DES 含水量為50%（V/V）、提取時間為90 min、提取溫度為60 ℃，進行驗證試驗，并重復3 次。在此優化工藝條件下，荔枝殼原花青素提取量達到 5.07 mg PE/mL，確證為最優提取條件，故確定該條件為DES 提取荔枝殼原花青素最優提取工藝。在最優提取工藝的條件下，氯化膽堿-1,3-丁二醇提取荔枝殼原花青素含量為乙醇提取原花青素（3.61 mg PE/mL）的1.40 倍。

2.5 抗氧化活性試驗結果

2.5.1 ORAC結果

氯化膽堿-1,3-丁二醇與乙醇提取液的荔枝殼原花青素的氧自由基吸收能力（ORAC）結果如表7所示，其ORAC 值分別為5 496.25 μmol TE/mL 及3 370.17 μmol TE/mL，且前者是后者的1.63 倍，表明氯化膽堿-1,3-丁二醇提取的原花青素氧自由基吸收能力更強。

表7 荔枝殼原花青素的ORAC值Table 7 ORAC value of litchi pericarp procyanidins

2.5.2 清除DPPH自由基結果

氯化膽堿-1,3-丁二醇與乙醇提取液的DPPH 自由基清除能力的結果見圖7，在低質量濃度時，氯化膽堿-1,3-丁二醇提取液的DPPH 自由基清除能力顯著優于乙醇提取液。而在高質量濃度時，兩者的DPPH 自由基清除率皆達90%以上。兩者的DPPH自由基的半清除率（IC50值）分別為27.35 μg PE/mL與36.41 μg PE/mL，表明氯化膽堿-1,3-丁二醇提取的原花青素清除DPPH 自由基能力更強。

圖7 荔枝殼原花青素對DPPH 自由基清除率曲線Fig.7 DPPH free radical scavenging curve of litchi pericarp procyanidins

2.5.3 清除ABTS+自由基結果

氯化膽堿-1,3-丁二醇與乙醇提取的荔枝殼原花青素的ABTS+自由基清除能力結果見圖8，結果顯示，兩種溶劑提取的原花青素都具有良好的ABTS+自由基清除能力，在76.72 μg/mL 時兩者清除率均可達100%，其IC50值分別在23.82 μg PE/mL 與31.56 μg PE/mL，氯化膽堿-1,3-丁二醇提取的原花青素清除ABTS+自由基能力更強。

圖8 荔枝殼原花青素對ABTS+自由基清除率曲線Fig.8 ABTS free radical scavenging curve of litchi pericarp procyanidins

氯化膽堿-1,3-丁二醇提取的荔枝殼原花青素提取物具有更好的抗氧化活性，這可能與氯化膽堿-1,3-丁二醇荔枝殼提取液中總酚、總黃酮以及原花青素含量顯著高于70%乙醇荔枝殼提取液有關（P＜0.05）?？寡趸镔|清除自由基的本質是電子的轉移，即自由基從抗氧化物質上獲得電子轉變為中性分子的形式[36,37]。Mirahmadi 等[38]認為酚類物質的含量與自由基清除之間存在顯著相關性，酚類物質含量越高，其提供電子的能力越強，即自由基清除能力也就越強。而Bu[39]和Fu 等[40]研究表明，相較于傳統有機試劑，低共熔溶劑提取酚類物質的能力更強，其提取物的抗氧化能力也更強。所以，氯化膽堿-1,3-丁二醇提取物的酚類物質含量越高，其抗氧化能力就越強。

3 結論

本文通過比較4 種低共熔溶劑與70%（V/V）乙醇提取法對荔枝殼提取液中原花青素含量及mDP、總酚和總黃酮含量、單體成分組成及ORAC 活性的影響，篩選出氯化膽堿-1,3-丁二醇為最佳提取溶劑。進一步考察了料液比、DES 摩爾比、DES 含水量、提取時間及提取溫度5 個單因素對原花青素提取得率的影響，結合正交試驗優化得到荔枝殼原花青素的最佳提取工藝：氯化膽堿-1,3-丁二醇為溶劑，料液比1:20（g/mL），溶劑摩爾比1:4，含水量50%（V/V），提取溫度60 ℃，提取時間90 min。在此條件下測得的荔枝殼原花青素含量為5.07 mg PE/mL，是70%（V/V）乙醇提取液的1.4 倍。氯化膽堿-1,3-丁二醇提取物的ORAC 值以及清除DPPH 和ABTS自由基的IC50值分別為5 496.25 μmol TE/mL、27.35 μg PE/mL 和23.82 μg PE/mL，均優于70%（V/V）乙醇提取液（3 370.17 μmol TE/mL、36.41 μg PE/mL和 31.56 μg PE/mL）。本試驗為荔枝殼原花青素的綠色高效提取和高值化利用提供理論依據和技術支撐。