基于網絡藥理學和分子對接預測紅花綠絨蒿活性成分抗肝纖維化的作用機制*

娘格才讓,索朗拉宗,卓瑪措毛,格拉措,才讓南加

(西藏藏醫藥大學,西藏 拉薩 850000)

肝纖維化作為肝損傷轉變成肝硬化或肝癌的中間環節,是肝損傷后必經的病理階段[1]。有研究表明,肝纖維化的早期具有可逆性,處于肝臟疾病的早期預防與治療過程中的關鍵時期[2]。肝損傷是一個慢性、長期的過程,各種內外因素對肝臟造成損傷后,其自身進行修復時進入肝細胞損傷、慢性炎癥、纖維組織增生三環節的重復循環,造成細胞外基質(ECM)過度增生與異常堆積后形成肝纖維化等肝臟疾病[3]。而傳統的藏醫藥作為具有獨立理論系統和特色的治療方法,能結合現代技術為肝纖維化的治療提供思路。藏醫藥理論認為,肝臟疾病的外因多由感受濕熱疫毒之邪所致,內因則與患者正氣虛弱有關[4]。長期的不良飲食、作息及染濕熱毒之邪,導致“三因”失調,以熱性“赤巴”盛行,造成肝損傷。肝臟作為血液和精華所藏之腑,藏醫將其歸為五源中的“火”,屬于“赤巴”范疇,本性為“熱”,在臨床治療時多以清熱解毒為治療方法。

紅花綠絨(Meconopsis punicea Maxim)為罌粟科綠絨蒿屬植物,是藏藥“歐貝”類藥材之一。藏藥中綠絨蒿屬的“歐貝”類藥材是治療肝臟疾病的一種常用藥材,《四部醫典》《晶珠本草》將藏藥“歐貝”歸為花類藥材,具有清肝熱和肺熱、治熱邪引起的喉阻塞等功效[5-6]?，F代研究表明,紅花綠絨蒿含有黃酮類化合物、生物堿、揮發油等多種化學成分,其95%乙醇提取物能顯著改善脂多糖誘導的肺損傷小鼠的病理形態[7]。SHANG等[8]通過研究證明,紅花綠絨蒿花的醇提物具有良好的鎮痛、鎮靜、鎮咳和祛痰作用。目前,從“歐貝”類藥材紅花綠絨蒿中分離鑒定出26種化合物[9-10],但其活性成分和作用機制尚不明確。因此,本研究基于網絡藥理學和分子對接技術初步探討紅花綠絨蒿抗肝纖維化的作用機制,為更深層次地研究紅花綠絨蒿的肝保護藥效物質基礎和作用機制的篩選提供理論依據。

1 資料與方法

1.1化學成分篩選及靶點預測 借助TCMSP數據庫檢索預測紅花綠絨蒿化學成分,設置參數為口服生物利用度(OB)≥30%和藥性(DL)≥0.2進行篩選。對于TCMSP數據庫中未找到的化學成分,則使用PubChem數據庫獲取化合物的3D結構和Smiles格式后,導入SwissTarget數據庫得到相應的預測靶點。

1.2肝纖維化靶點篩選 使用關鍵詞“liver fibrosis”,在GeneCards和OMIM數據庫中進行搜索。從GeneCards檢索結果中篩選relevance score≥5分的靶點,與OMIM數據庫的結果合并,并去除重復,得到與肝纖維化相關的作用靶點。然后,與“1.1”項獲得的靶點進行交集比對,最終篩選出紅花綠絨蒿抗肝纖維化的潛在作用靶點。

1.3蛋白互相作用(PPI)網絡構建及關鍵靶點篩選 利用STRING數據庫,設置連接評分(combined score)最小值為0.900,選擇“homo sapiens”物種,將紅花綠絨蒿與肝纖維化的關鍵靶點導入,得到PPI關系,然后將相關數據導入Cytoscape3.6.1軟件進行可視化分析,并得到PPI網絡分析結果。

1.4GO和KEGG富集分析 使用DAVID數據庫,對紅花綠絨蒿抗肝纖維化的潛在作用靶點進行GO和KEGG富集分析。設定閾值P<0.05,獲得富集結果,然后使用R語言的ggplot2包來進行主要生物功能的可視化分析。

1.5“成分-靶點-通路”網絡圖 利用紅花綠絨蒿抗肝纖維化的潛在作用靶點的GO和KEGG富集數據信息,通過Cytoscape3.7.2軟件繪制“成分-靶點-通路”圖。

1.6分子對接 利用網絡拓撲分析篩選得到的核心靶點,通過分子對接驗證它們與成分之間的相互作用關系。通過PDB數據庫,找到目標蛋白的PDB ID,并從PubChem數據庫下載相應成分的三維結構。通過AutoDocktools(v1.5.6)將受體和配體信息導入,進行分子對接,選擇結合能較低的構象。使用Pymol2.3.0軟件進行可視化分析。

2 結 果

2.1紅花綠絨蒿與肝纖維化的共同靶點 通過上述數據庫共獲得紅花綠絨蒿相關靶點117個,肝纖維化相關靶點6 423個,用Venny2.1取得交集后,共獲得251個紅花綠絨蒿與肝纖維化的共同靶點。

2.2紅花綠絨蒿與肝纖維化的PPI網絡 借助STRING數據庫和導入Cytoscape3.6.1構建 PPI網絡圖,見圖1。拓撲分析顯示,核心靶點有PRKCZ、LCK、RXRA、PIK3CA、AKT1、PIK3R1、MAPK3、MAPK1、HSP9OAA1、SRC,度值分別為24、25、26、34、35、36、43、44、45、46。

注:節點代表PPI關系,圓圈越大代表其節點產生的連接越緊密[11]。

2.3GO與KEGG富集分析 對核心靶點與成分進行GO和KEGG富集分析和可視化,規定校正P<0.05為符合標準,將基因GO本體條目按P值進行排序,分別選取前10條繪制條形圖,見圖2。圖中顯示,GO富集分析結果包括生物過程(BP)、細胞組分(CC)和分子功能(MF)。BP主要涉及肽基-絲氨酸修飾(peptidy-serine modification)、肽基-絲氨酸磷酸化(peptidy-serine phosphorylation)、蛋白質運輸的正向調節(positive regulation of protein transport)和細胞對化學應激的反應(cellular response to chemical stress)等;CC主要包括細胞膜筏(membrane raft)、細胞膜微域(membrane microdomain)、膜區域(membrane region)、細胞突觸前膜的完整組成部分(integral component of presynaptic membrane)等;MF包括蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶的活性(protein serine/threonine kinase activity)、核受體活性(nuclear receptor activity)、配體激活的轉錄因子活性(ligand-activated transcription factor activity)及藥物結合(drug binding)等。KEGG富集分析主要涉及糖尿病并發癥AGE-RAGE信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、脂質與動脈粥樣硬化(lipid and atherosclerosis)、化學致癌-受體激活通路(chemical carcinogenesis-receptor activation)和PI3K-AKT信號通路(PI3K-AKT signaling pathway)等,見圖3。

圖2 GO富集分析

圖3 KEGG通路富集分析

2.4“成分-靶點-通路”網絡的構建 以251個共同靶點作為紅花綠絨蒿抗肝纖維化的作用靶點,通過運用Cytoscape3.6.1軟件構建“成分-靶點-通路”網絡,見圖4。由此表明,紅花綠絨蒿可能通過多成分、多靶點及多通路相互線圖作用于肝纖維化疾病。此外,篩選度值前5的有效成分,包括木犀草素、小麥黃素、芹菜素、小檗堿、3-甲基聯苯,度值分別為101、101、101、100、79。

注:紅色六邊形節點代表紅花綠絨蒿抗肝纖維化的有效成分,紫色節點代表肝纖維化疾病靶點。

2.5分子對接預測結果 選取度值前4的核心成分與靶點進行對接,結構可視化結果見圖5。其中有效成分小檗堿與SRC和MAPK3靶點的結合能分別為-9.0 kcal/mol(1 kcal=4.184 kJ)和-9.7 kcal/mol,木犀草素與HSP90AA1和MAPK1的結合能分別為-9.3 kcal/mol和-9.0 kcal/mol,見表1。

表1 紅花綠絨蒿有效成分與關鍵靶點的分子對接結合能

注:A.SRC-小檗堿;B.HSP90AA1-木犀草素;C.MAPK1-木犀草素;D.MAPK3-小檗堿。

3 討 論

本研究從TCMSP網站共獲得紅花綠絨蒿有效成分11個,包括木犀草素、小麥黃素、芹菜素、小檗堿等。其中木犀草素作為一種天然的黃酮類化合物,存在于多種天然植物中,具有抗炎、抑菌、抗氧化、抗腫瘤、抗癌、肝保護等作用[12-13]。LI等[14]研究發現,木犀草素對轉化生長因子-β1(TGF-β1)和血小板衍生生長因子(PDGF)刺激激活的造血干細胞(HSC)和HSC-T6細胞的增殖、遷移、膠原合成及纖維化相關基因表達均有抑制作用。而且木犀草素可誘導HSC細胞凋亡,并增加Caspase-3活性和p53表達,誘導細胞周期G1期阻滯,降低Bcl-2、Cyclin E和P-CDK-2表達。木犀草素能顯著抑制PDGF和TGF-β1模擬的AKT和Smad通路的磷酸化。這表明木犀草素在體內外通過多種機制減輕肝纖維化潛力。小麥黃素屬黃酮類化合物,普遍存在于禾本科、大戟科等植物中,具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤及免疫調節等廣泛的藥理作用[15]。SEKI等[16]研究發現,小麥黃素通過阻斷人的HSC細胞系LI90和活化的HSC細胞周期進程和細胞遷移,抑制PDGF-BB誘導的細胞增殖,減少PDGF受體B和下游信號分子ERK1/2和AKT的磷酸化,顯示小麥黃素可能在肝纖維化的HSC靶向治療或化學預防應用中是有益的。芹菜素是一種主要存在于柑橘類水果、蔬菜、香料和草藥中的黃酮類化合物[17],具有抗炎、抗病毒、免疫調節、抗腫瘤和保護肝功能等多種藥理作用[18]。JI等[19]研究證實,芹菜素能降低丙氨酸轉氨酶和天冬氨酸轉氨酶水平,抑制ECM生成,抑制HSC活化,調節基質金屬蛋白酶-2(MMP2)和TIMP1平衡,降低自噬相關蛋白表達,抑制TGF-β1/Smad3和p38/PPARα通路,從而減輕肝纖維化。小檗堿是許多中藥的一種常見活性物質,小檗堿對臟器損傷和心血管疾病及代謝性疾病的相關并發癥、炎癥等具有保護作用[20]。TAN等[21]研究發現,小檗堿顯著誘導HSC凋亡,促凋亡標志物p53、Bax和PARP的表達上調,抗凋亡標志物Bcl-2的表達下調,ATG5的過度表達逆轉了這種作用。在體內,小檗堿通過減少膠原沉積、炎性細胞浸潤、纖維化標志物羥脯氨酸、α-平滑肌肌動蛋白、Ⅳ型膠原和自噬標志物LC3的表達來改善肝纖維化的新機制。

紅花綠絨蒿有效成分的靶點與肝纖維化疾病靶點進行交集分析,得到共同靶點251個,度值較大的核心靶點有SRC、HSP9OAA1和MAPK1等。SRC激酶家族由非受體酪氨酸激酶組成,廣泛存在于各種細胞中。SRC最初被鑒定為癌基因,并在人類腫瘤中表達,然而,其也在所有細胞類型中普遍表達。SRC磷酸化信號蛋白STAT3、AKT和表皮生長因子受體,從而調節各種生物活性,包括細胞存活、增殖和遷移[22-23]。SRC的激活引起肺、肝和腎纖維化,表明SRC激活是纖維化疾病的病理觀察[24]。采用HSP90AA1抑制劑可誘導HSC細胞的凋亡,表明HSP90AA1的下調可抑制TGF-β的增殖,從而發揮抗肝纖維化作用[25]。 MAPK1即ERK2,是 ERK信號通路的關鍵節點,通過靶向調控MAPK1的表達可影響腫瘤等多種疾病的發展[26-27]。調控通路中MAPK1的表達會對其下游一些關鍵信號造成影響,磷酸化激活的MAPK1由胞質轉位到核內,激活下游通路蛋白磷酸化,引起細胞多種生物學功能的變化[28]。

通過紅花綠絨蒿-肝纖維化交集基因進行GO富集分析表明,紅花綠絨蒿有效成分具有蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶的活性、核受體活性、配體激活的轉錄因子活性、藥物結合、蛋白酪氨酸激酶活性、類固醇結合、單羧酸結合、磷酸酶結合-組蛋白激酶活性、激素受體結合等多個生物學功能;同時紅花綠絨蒿的有效成分能影響細胞膜筏、細胞膜微域、細胞膜區域、細胞突觸前膜的完整組成部分和細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶全酶復合體等多個CC,從而參與肽基-絲氨酸修飾、肽基-絲氨酸磷酸化、蛋白質運輸的正向調節、細胞對化學應激的反應等多個BP。KEGG富集分析顯示,紅花綠絨蒿有效成分可能參與AGE-RAGE、脂質與動脈粥樣硬化、化學致癌-受體激活、PI3K-AKT等信號通路。

綜上所述,本研究通過網絡藥理學和分子對接技術,探討紅花綠絨蒿抗肝纖維化的藥效物質基礎、作用靶點及相關藥理機制,揭示了紅花綠絨蒿多成分、多靶點及多種通路間協同起效的復雜網絡關系。通過構建“成分-靶點-疾病”通路網絡,結合分子對接技術,預測出紅花綠絨蒿抗肝纖維化可能的作用機制,為后續紅花綠絨蒿抗肝纖維化的實驗研究提供了理論支持。