宏基因組二代測序對肺部感染診斷價值的中國數據meta分析*

王 洋,牛五層,張曉煜,張 麗△

(1.國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫學研究中心/中國醫學科學院北京協和醫學院腫瘤醫院深圳醫院檢驗科,廣東 深圳 518116;2.邯鄲市第一醫院核醫學科,河北 邯鄲 056000)

肺部感染是臨床常見的呼吸道疾病,發病率高,是導致生命死亡的主要原因之一[1]。尤其在老年人和免疫功能低下的個體中,準確、快速地診斷感染的原因是實現肺部感染治療和改善預后的關鍵。傳統的培養方法耗時長,陽性檢出率低,不能完全滿足臨床需求[2]。其他的檢測方法,如聚合酶鏈反應(PCR)和免疫學等技術,只能識別特定的病原體。此外,多種病原體的感染和多重耐藥菌的出現使病原體的鑒定更加困難。宏基因組二代測序(mNGS)是一種新興的病原體檢測方法,可以對目前已知的所有病原體的總DNA或RNA含量進行無偏倚、詳細地檢測[3],尤其在用于檢測復雜、罕見、非典型的感染性疾病時,顯示出比傳統方法更好的診斷性能[4]。近年來,mNGS應用于診斷肺部感染的研究逐漸增多,但其診斷性能尚未達成共識。本研究采用meta分析方法,合并目前經公開發表的相關研究結果,評估mNGS在肺部感染中的應用價值及準確性。

1 資料與方法

1.1文獻檢索策略 計算機檢索 PubMed、Embase、the Cochrane Library、中國知網、萬方、維普等數據庫,檢索時限均為建庫至2022年5月30日,語種為英文或中文。選取國內外發表的通過mNGS技術應用于肺部感染診斷的文獻,并對納入文獻的參考文獻進行擴大檢索。英文檢索詞為“metagenomic next-generation sequencing”“mNGS”“next-generation sequencing”“pneumonia”“lung infection”等,中文檢索詞為“宏基因組二代測序”“二代測序”“肺部感染”“肺炎”等。

1.2納入與排除標準 納入標準:(1)采用 mNGS 技術應用于肺部感染診斷的研究,能從文中獲取診斷實驗的四格表數據,包括真陽性值(TP)、假陽性值(FP)、假陰性值(FN)、真陰性值(TN)。(2)研究對象為疑似肺部感染的患者,且有明確的診斷標準,診斷標準主要包括影像學資料、臨床癥狀和實驗室檢測結果,最終判斷由臨床醫生進行。研究組為確診肺部感染的患者,對照組為最終診斷非肺部感染的患者。(3)病例數超過10 例。(4)英文和中文文獻。

排除標準:(1)動物實驗、會議摘要、病例報告、系統評價類文獻。(2)重復發表文獻或無法獲取四格表數據的文獻。

1.3文獻的篩選和資料提取 由2位研究員對所有納入的文獻全文進行系統回顧,并提取相應的數據,包括文獻作者、發表時間、國家或地區、研究設計類型、納入的病例數、診斷肺部感染的參考標準、四格表數據等。有異議時通過討論解決。如果未達成一致,則由第三位評價者做出最終決定。

1.4納入研究的質量評價 由2位研究員使用RevMan5.3軟件根據QUADAS-2條目[5]逐條按“是”“否”“不清楚”對納入文獻的質量進行偏倚風險和適用性評價。QUADAS-2表單包含4個部分:(1)病例的選擇;(2)待評價試驗;(3)參考標準;(4)病例流程和進展情況。如遇分歧則通過查閱相關資料、內部討論或咨詢專家解決。

1.5統計學處理 采用Meta-Disc1.4、STATA15.0軟件進行meta分析。納入研究通過Cochran-Q檢驗判斷是否存在異質性,檢驗水準設為0.05,結合I2判斷異質性的大小。若P>0.05或I2≤50%,說明納入研究間異質性較小,可以采用固定效應模型;若P≤0.05或I2>50%,說明納入研究間異質性較顯著,則運用隨機效應模型,并分析異質性來源。通過Spearman 相關系數確定納入研究之間是否存在閾值效應。若Spearman 相關分析顯示P>0.05,說明不存在閾值效應。通過亞組分析探索異質性來源。計算納入文獻的合并敏感度、特異度、陽性似然比(PLR)、陰性似然比(NLR)及診斷比值比(DOR)等指標,并繪制總受試者操作特征曲線(SROC),計算曲線下面積(AUC)。發表偏倚通過Deeks 漏斗圖評估。

2 結 果

2.1文獻檢索結果 初步檢索到相關文獻1 613篇,根據文獻排除標準,其中1 571篇在瀏覽標題和摘要后被排除在外。全文閱讀后,另外30篇被排除在外,剩下12篇文獻被納入研究[6-17]。文獻篩選流程及結果見圖1。

圖1 文獻篩選過程

2.2納入研究的基本特征與質量評價 本研究納入8篇[6-13]英文文獻和4篇[14-17]中文文獻,均來源于國內相關研究。納入的12篇文獻共包括1 154例患者,其中794例被確診為肺部感染,360例最終確診為非肺部感染性疾病。納入研究的基本特征見表1,利用QUADAS-2所作出的文獻質量評價結果見圖2。

表1 納入研究的基本特征

圖2 文獻質量評價偏倚風險圖

2.3meta分析結果

2.3.1mNGS技術應用肺部感染診斷準確性 Spearman相關系數結果顯示,r=0.175,P=0.587,提示納入文獻不存在閾值效應。異質性檢驗結果顯示,敏感度(χ2=100.68,P<0.000 1,I2=89.1%),特異度(χ2=75.27,P<0.000 1,I2=85.4%),PLR(Cochran-Q=58.83,P<0.000 1,I2=81.3%),NLR(Cochran-Q=67.16,P<0.000 1,I2=83.6%),DOR(Cochran-Q=54.07,P<0.000 1,I2=79.7%)。見圖3～8。各研究間異質性較大,采用隨機效應模型進行meta分析。結果顯示,合并敏感度為0.82[95%可信區間(95%CI)0.79～0.84],合并特異度為0.73(95%CI0.68～0.78),PLR為2.39(95%CI1.62～3.50),NLR為0.24(95%CI0.15～0.39),DOR為12.66(95%CI5.53～28.99),SROC的AUC為0.850,Q指數為0.782。

圖3 納入研究的敏感度森林圖

圖4 納入研究的特異度森林圖

圖5 納入研究的PLR森林圖

圖6 納入研究的NLR森林圖

圖7 納入研究的DOR森林圖

圖8 納入研究的SROC

2.3.2亞組分析 所納入的文獻之間具有較高的異質性,利用亞組分析探索異質性來源。按病例組標本量、標本預處理方式、測序方式等進行亞組分析,分析結果見表2。

2.3.3發表偏倚 Deeks 漏斗圖大致對稱,P=0.63(P>0.05),見圖9。提示納入研究無明顯發表偏倚。

3 討 論

肺部感染是由臨床中常見的多種病原微生物引起的感染性疾病之一,發病率及病死率較高[18]。細菌、病毒或真菌等多種病原體與肺部感染相關,對肺部感染的快速微生物學診斷有助于抗菌藥物治療的及時應用。測序技術和生物信息學的快速發展使mNGS成為臨床診斷發展的重要領域。

mNGS理論上可以檢測臨床樣本中的所有病原體,現已應用于中樞神經系統、血液、呼吸系統及局部組織感染等的病原體檢測中[19]。mNGS具有非靶向性及相對較短的檢測周期,能夠快速檢測到病原體。作為現有傳統常規培養及涂片的補充方法,可改善復雜感染患者的病原體檢測和疾病管理[20]。此外,在流行病學分析方面,mNGS能夠提供病原體的遺傳和基因組信息,用于新發和罕見病原體的識別已得到廣泛認可[21]。

關于mNGS在診斷肺部感染方面的性能和價值的綜合研究逐漸增多,但診斷性能尚未達成共識。因此,本文對mNGS技術在肺部感染診斷的應用價值進行meta分析。

本次最終納入12篇研究,借助Meta-Disc1.4與STATA15.0軟件,選用隨機效應模型,評估了mNGS技術在肺部感染診斷的診斷效能。分析結果顯示,合并敏感度為0.82(95%CI0.79～0.84),特異度為0.73(95%CI0.68～0.78)。對于肺部感染的研究,敏感度應被特別關注,mNGS通常于常規微生物實驗室診斷不明時開展?？咕幬锏氖褂脤NGS診斷率的影響小于傳統培養[22],mNGS在免疫抑制或危重癥患者中診斷的敏感度更高[23]。DOR可反映檢驗項目的結果與疾病之間的關聯強度,DOR>1時,其值越大說明判別效果越好[24]。本研究DOR為12.66(95%CI5.53～28.99),似然比為反映敏感度和特異度的復合指標,PLR>10.0或NLR<0.1,可認為診斷精度高[23]。本研究PLR值為2.39(95%CI1.62～3.50),NLR值為0.24(95%CI0.15～0.39),AUC為0.850,Q指數為0.782,總體診斷價值尚可。

本研究亞組分析提示,標本預處理方式、測序方法、病例組標本量大小等亞組均存在較大異質性。由于納入文獻的不足,尚未對研究類型、標本來源、人群免疫狀態做進一步分析探索其異質性來源。臨床診斷標準因研究而異,可能導致病例分類的變化,影響敏感度和特異度,成為異質性的來源之一。mNGS作為一種無偏倚的檢測方法,可以檢測環境中的所有病原體,這種測試方法本身并不能區分病原微生物與定植微生物、背景微生物和受污染微生物[24]。檢測結果中的大量信息可能會干擾醫生做出臨床決策。在解釋mNGS結果時,應根據臨床癥狀、微生物毒力、病原體reads數量、基因組覆蓋率等來區分真正的病原體與定植及污染。不同標本類別下的結果可能存在差異,標本的采集方法和部位的缺乏標準化也可能影響mNGS的結果。有研究指出,由于肺活檢樣本中存在惡性腫瘤、肺結節或肺陰影等并發癥,支氣管肺泡灌洗液樣本比肺活檢樣本更容易診斷感染[24];血液樣本中的病原體DNA可能反映了肺部感染,也有可能由其他器官感染所致[25];痰液樣本極易受到污染,使得背景微生物的識別和測序結果的解讀變得困難。此外,mNGS陽性閾值標準尚未確立。在納入的12項研究中,有7項[6-9,11-12,15]研究對確定mNGS陽性閾值有明確要求,盡管各個要求不完全一致。目前,還沒有權威的指南來解釋mNGS報告[26],不同解讀方式可能對檢測結果造成偏倚。因此,制訂統一的mNGS陽性閾值標準至關重要。需要更多的研究來盡可能統一定義mNGS陽性的閾值標準。

此外,本研究尚存在以下不足:(1)納入文獻來源僅為中國地區,缺乏地區代表性。(2)納入文獻語種僅包括英文、中文,可能存在語言偏倚。(3)納入文獻較少,且大多為回顧性研究。納入的部分研究樣本量小,評估診斷準確性的能力不足。(4)在亞組分析中存在顯著異質性。

綜上所述,mNGS在確立肺部感染病因方面表現出的敏感度和特異度尚可,具有廣泛的臨床應用前景。但目前mNGS技術的應用仍有一些局限性,如測序成本高、陽性閾值的確立、病原體的報告解讀等,尚不能取代傳統病原體檢測方法。本研究納入文獻數量較少,各個研究間的異質性高,尚需進一步大規模高質量的研究,更客觀準確地評估mNGS在肺部感染中的診斷價值。