基于數據挖掘探究溪黃草藥用成分及潛在抗癌的作用機制*

李小敏,張佳涵,梁宏軒,黃鎮江,張振霞,鄭玉忠,陳良輝,劉亞群

(韓山師范學院生命科學與食品工程學院,廣東 潮州 521041)

溪黃草(Herba lsodi Lophanthoidis)為唇形科植物線紋香茶菜的干燥全草。線紋香茶草2個變種:風血草(狹基香茶菜)和纖花香茶菜,同屬植物溪黃草,在一些地區也作溪黃草使用[1]。溪黃草具有很高的藥用價值,常被用于治療急性黃疸型肝炎、急性膽囊炎、痢疾、腸炎、癃閉、跌打瘀痛等病癥?，F代藥理學研究中溪黃草具有抗炎、抗腫瘤、抑菌、增強免疫力的作用,且具有較強的抗氧化能力。通過對溪黃草化學成分分析發現,溪黃草還具備預防癌癥發生的作用。其中溪黃草甲素是目前發現的對人類宮頸癌Hela細胞增殖具有極其明顯抑制作用的成分[2]。對溪黃草化學成分進一步研究發現,其除對人宮頸癌細胞有著明顯抑制作用外,還對消化癌、膀胱癌、消化道疾病等具有明顯抑制作用[3]。

本研究利用多個大數據分析平臺對溪黃草的有效成分進行篩選分析,結合相關數據庫的疾病信息,得出溪黃草作用于癌癥的靶點及機制,構建“藥物-靶標-疾病”網絡,為后續溪黃草輔助治療癌癥的作用機制提供理論參考。

1 資料與方法

1.1溪黃草成分的篩選 通過中國知網(http://www.cnki.net/)檢索關鍵詞“溪黃草”,并結合BATMAN-TCM數據庫(http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/)和CancerHSP數據庫(https://old.tcmsp-e.com/CancerHSP.php)收集整理溪黃草化學成分,成分名稱鍵入化源網(https://www.chemsrc.com/casindex/)查詢CAS號,運用TCMSP數據庫(https://old.tcmsp-e.com)以口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18為條件,檢索活性化學成分;在PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中檢索各成分的CAS號,下載其2D 結構并保存為SDF格式。上傳至SwissADME在線平臺(http://www.swissadme.ch/)進行再次篩選,設定條件:胃腸道吸收為“high”,5種DL(lipinski、ghose、veber、egan、muegg)預測結果有2個及以上為“yes”,生物利用度預測值≥0.50。

1.2有效成分作用靶點的收集與整理 采用SwissTargetPrediction在線平臺(http://www.swisstargetprediction.ch/),限定物種為“homo sapiens”,進行靶點預測。刪除可能性為“0”的靶點,去重后得到溪黃草有效成分的作用靶點。

1.3靶標基因的GO和KEGG富集分析 運用Metascape數據庫(http://metascape.org/),限定物種為“homo sapiens”,對溪黃草治療疾病的潛在靶點進行GO與KEGG富集分析,用以說明相關靶點在基因功能和信號通路中的作用。GO富集分析主要包括生物過程(BP)、分子功能(MF)和細胞組成(CC)。通過在線作圖平臺微生信(http://bioinformatics.com.cn/)對富集分析結果進行可視化處理。

1.4蛋白質相互作用(PPI)網絡構建 采用STRING平臺(https://cn.string-db.org/,Version 11.5),限定物種為“homo sapiens”,最低相互作用評分設置為最高置信度(highest confidence=0.900),隱藏離散靶點,其余參數保持默認設置,得到溪黃草潛在作用靶點的PPI網絡圖。以node degrees最高的16個靶點基因為核心靶點。

1.5“藥物-靶標-疾病”網絡構建 運用NIMNT數據庫(http://www.idrug.net.cn/NIMNT/)對度值大于0的靶標基因進行分析,預測該藥可能的適應證。預測結果根據q<0.001進行篩選,并按從小到大排序。取前30個疾病與對應的核心靶點通過Cytoscape3.9.1構建“藥物-核心靶標-疾病”網絡,進一步利用CytoHubba插件、Network Analyzer插件分析網絡,設置節點大小與顏色反映度值大小,使其相互作用結果可視化。

2 結 果

2.1溪黃草的化學成分 通過大量文獻[4-22]的查閱與各中藥成分數據庫平臺檢索構建溪黃草的化學成分庫。通過化源網對成分名稱進行檢索,初步獲得化學成分270個,主要包括萜類共52個,揮發油類35個,酚酸類33個,甾醇類30個,醛類23個,酯類22個,酮類21個。

2.2活性藥用成分篩選 通過TCMSP平臺以OB≥30%,DL≥0.18為條件進行篩選。通過SwissADME平臺進行毒藥動力學分析,以腸胃吸收度為“high”及DL類別中有2個以上的“yes”為篩選條件,最終獲得符合藥用條件的活性成分共10個,分別為5,6,3′,4′-四羥基-7-甲氧基黃酮、鐵銹醇、山柰酚、杜鵑黃素、槲皮素、槲皮素-3,3′-二甲醚、薊黃素、木犀草素、松屬素、異鼠李素,見表1。

表1 溪黃草的有效活性藥用成分

2.3溪黃草靶標GO和KEGG富集分析 通過SwissTargetPrediction數據庫進行靶點預測,結果去重后共得到靶點基因212個。使用Metascape數據庫對靶點基因進行KEGG和GO富集分析,GO富集分析共得到BP 5 310條,CC 524條,MF 981條。結果顯示,這些蛋白在BP中參與了蛋白質磷酸化、激素反應、細胞對有機環化合物反應、激酶活性調節、輸運調節、GPCR發信號等過程。在CC上與轉移酶復合物/轉移含磷基因、樹突、膜筏、胞質核周區、中心體、受體復合物等有關。在MF上主要與蛋白激酶活性、碳酸鹽脫水酶活性、核受體活性、激酶結合、蛋白酪氨酸激酶活性、氧化還原酶活性等相關(圖1)。上述溪黃草活性成分的GO基因注釋功能均與抗癌相關,如BP的蛋白質磷酸化幾乎參與了細胞所有的生命過程,若其磷酸化位點發生突變時,可能導致惡性腫瘤的發生和發展[23]。

圖1 溪黃草靶點GO和KEGG富集氣泡圖

KEGG通路富集分析共得到260條信號通路,推測溪黃草可能參與癌癥的通路、氮代謝、神經活性配體-受體相互作用、磷脂酶D信號通路、孕酮介導的卵母細胞成熟、化學致癌-活性氧物種等相關信號通路(圖1),上述通路與癌癥、阿爾茨海默病存在聯系,癌癥通路中STAT3起核心作用,主要通過蛋白質磷酸化作用,與激酶結合,抑制樹突狀細胞的成熟[24]。氮代謝通路的衰減與癌細胞增殖有關,其中氨基酸和核苷酸中的氮會促進癌細胞生長[25-26]。而神經活性配體-受體相互作用通路可能與肺腺癌有聯系。磷脂酶D信號通路中質膜上磷脂酶D活性的降低,從而影響免疫細胞的囊泡運輸[27]。孕酮介導的卵母細胞成熟通路是由黃酮類物質介導的卵母細胞成熟,與卵巢癌密切相關[28]。

2.4溪黃草靶標PPI網絡構建 將212個溪黃草的靶點基因導入STRING數據庫,去除游離節點,最小互相體用閾值選擇為“highest confidence=0.900”,其余為默認值,得到PPI網絡圖(圖2)。去除度值為0的節點后得到148個靶點。其中度值較高的16個核心靶點為SRC、PIK3R1、PIK3CA、AKT1、ESR1、CDK1、EGFR、CCNB2、CCNB1、VEGFA、AR、CDK5、FYN、AKR1C3、CDC25A、CDK2。見圖2。

圖2 溪黃草活性成分交集靶點PPI網絡圖

上述核心靶標基因中,PIK3R1基因參與抑癌作用,使腫瘤患者獲得PIK3R1基因的表達產物,可望通過調節PI3K信號轉導通路的作用而顯著減弱乳腺腫瘤細胞的侵襲能力。此外,PIK3R1多態性還與子宮內膜癌和膀胱癌的生存有關[29-30]。SRC可在外部信號轉導入細胞時瞬間激活并使下游信號轉導分子被磷酸化,通過信號傳導最終影響細胞的黏附和侵襲能力。在乳腺癌、肺癌等腫瘤組織中,SRC處于異?；罨癄顟B[31]。PIK3CA基因已被證實為卵巢癌、乳腺癌等多種腫瘤的癌基因[32]。AKT1基因在調節腫瘤血管生成和癌癥轉移方面起關鍵作用[33]。ESR1基因中內含子多態性與乳腺癌風險增加有關,其表達失調可能參與細胞癌的發生和發展過程[34-35]。CDK1、CCNB1和CCNB2是潛在的預后生物標志物,與肝細胞癌(HCC)中免疫細胞的浸潤有關,是HCC的潛在治療靶點[36]。AR在三陰性乳腺癌(TNBC)癌變中起作用,可能是通過EGFR和PI3K-AKT信號通路完成的[37]。VEGFA幾乎在所有的惡性腫瘤中起重要作用,且不僅在腫瘤血管生成中起重要作用,還能參與腫瘤免疫反應[38]。CDK5參與腫瘤生物學行為,包括致癌作用及抑癌作用,其高表達和信號傳導的超激活已在乳腺癌、卵巢癌等多種癌癥中有報道。CDK5作為癌基因促進細胞增殖、遷移和侵襲[39-41]。FYN在前列腺癌中的調節特別上調和在多種癌癥中起促進作用[42]。AKR1C3表達的上調或下調發生在激素依賴性和激素非依賴性腫瘤中,其在PI3K-AKT、MAPK、ERK、IGF-1/AKT和PTEN/AKT等信號通路中發揮作用[43]。CDC25A的過度表達在腫瘤中表現出原癌基因的特性,逐漸成為抗癌藥物中具有價值的分子靶標[44]。CDK2則與肝癌的發生和發展密切相關[45]。綜上所述,以上靶點均與癌癥有關,提示這些靶點可能是溪黃草治療癌癥的核心靶點。

2.5溪黃草適應證預測及“溪黃草-靶點-疾病”網絡構建 將2.4得到的148個靶點導入NIMNT數據庫,進行適應證分析,根據q<0.001對結果進行篩選并按由小到大排序,得到306個可能適應證,排在前30位的可能適應證見圖3,主要包括乳腺癌、女性生殖器官癌、細胞型良性腫瘤、男性生殖器官癌、前列腺癌等。將前30個適應證和對應的核心靶點導入Cytoscape3.9.1軟件構建“溪黃草-核心靶點-疾病”網絡圖,見圖4。根據度值調整節點的大小和顏色,度值越大節點顯示越大,顏色越深。結果顯示溪黃草可能的核心靶標為VEGFA、EGFR、AKT1等,主要與男性生殖器官癌癥、前列腺癌及腎癌等泌尿及男性生殖系統癌癥有關。

圖3 溪黃草適應證預測

圖4 “溪黃草-核心靶點-疾病”網絡圖

3 討 論

溪黃草為我國民間常見飲用草藥茶,傳統中醫藥理論指出其味苦性寒,具有清熱、利濕、退黃等功效?，F代藥理學研究中提出溪黃草具有預防癌癥發生的作用,但其作用機制和物質不詳,限制了其在臨床中的應用。為了進一步明確溪黃草的功效,本研究利用網絡藥理學能為中藥預測提供科學技術和理論的作用,同時也探討了溪黃草對癌癥的干預和治療的作用機制,為臨床合理使用本藥物治療癌癥提供了一定程度的科學理論依據。據相關研究表明,ESR1可能是表觀遺傳學方法診斷或治療卵巢癌的潛在靶點及評估卵巢癌預后的潛在標志物[46]。CDK1是miR-143-3p和miR-495-3p的共同靶基因,CDK1在宮頸癌組織和細胞中出現過表達,而miR-495-3p和miR-143-3p的表達則出現下調。CDK1沉默會抑制宮頸癌細胞的活力,促進細胞凋亡[47]。PI3K的Ⅰ類成分,如催化部分PIK3CA和調節部分PIK3R1等與宮頸癌的腫瘤發生有關。PIK3CA在宮頸癌中表達為35%,在宮頸癌鱗狀細胞癌中表達為38%,在宮頸腺癌中表達為39%[48]。PIK3CA和PIK3R1的突變與子宮內膜癌發生有關,93%的子宮內膜樣腫瘤有突變,并表明有使用PI3K/AKT通路抑制劑進行靶向治療的可能性[49]。此外,PIK3R1突變還與轉移性前列腺癌有直接關聯,且PIK3R1是調節胰島素介導葡萄糖攝取的PI3K途徑主要的參與者,其促進了癌細胞的生長,因此PIK3R1的突變可能成為多種癌癥類型的致癌驅動因素[50]。本研究分析提示,ESR1、CDK1、PIK3CA和PIK3R1等均為溪黃草化學成分作用的核心靶點,預示著溪黃草中的某些化學成分可能通過調節ESR1和CDK1的活性,分別干擾與之相關的信號通路,以此抑制卵巢癌及宮頸癌的發展。而PIK3CA基因編碼PI3Kα亞單位的蛋白和PIK3R1基因編碼PI3K調節亞單位的蛋白,其突變通常導致PI3K-AKT信號通路異常激活,促進腫瘤細胞的增殖和生存。即表明溪黃草有關成分可能通過調節PIK3CA和PIK3R1的表達水平來調節PI3K-AKT信號通路的活性,并以此抑制宮頸癌、子宮內膜癌及前列腺癌細胞的增殖和遷移。綜上可推測溪黃草可能在泌尿及生殖系統腫瘤治療方面具有一定的應用潛力,但由于中藥有效成分及作用靶點的篩選可能存在誤差,以及通過對溪黃草成分進行系統檢索和分析,可以看到在眾多成分中,其有效藥用成分種類甚少,其成分種類相關性、生物可及性和生物利用度需要后期重點關注及研究。因此,本研究并不能闡述溪黃草治療癌癥的完整機制,仍需要進一步的實驗驗證與技術支持來展開深入的探究。

綜上所述,通過網絡藥理的研究可以發現溪黃草主要有效成分有5,6,3′,4′-四羥基-7-甲氧基黃酮、鐵銹醇、山柰酚和杜鵑黃素等。并且每個有效成分都作用于多個靶點,GO和KEGG富集分析結果提示溪黃草可能與治療癌癥有關。通過對溪黃草潛在作用靶點PPI網絡分析及篩選,得到溪黃草核心靶點有SRC、PIK3R1、PIK3CA、AKT1、ESR1、CDK1和EGFR等。這些靶點在癌癥的發生發展過程中起著重要重用。核心靶點度值較高,說明這些靶點與活性成分之間聯系極為密切,靶點之間也存在相互作用關系。同一靶點還能影響不同的BP和信號通路,起到不同的作用,共同起到治療癌癥的作用,體現溪黃草治療癌癥多藥物活性成分、多交集靶點、多治療通路的作用機制。此外,進一步聚焦核心靶點,本研究初步預測溪黃草可能與抗泌尿及男性生殖系統腫瘤疾病更為緊密。