基于GEO數據庫分析水稻低溫脅迫關鍵基因

阮先樂

摘要：為了篩選水稻在低溫脅迫下的關鍵基因，從GEO數據庫下載水稻4個數據集中的70個樣本。利用在線分析程序GEO2R進行共同差異表達基因分析，并對這些差異表達基因進行GO、KEGG分析，構建蛋白質互作網絡，對關鍵基因構建熱圖。結果表明，獲得共同差異表達基因51個，其中上調表達基因1個，下調表達基因50個。上述基因的GO分析結果表明，其細胞組成主要集中在細胞、細胞要素和細胞器上；在分子功能上，上述基因的功能主要集中在結合、催化活性上；在生物過程中，上述基因的功能主要集中在細胞過程、代謝過程和生物調控上。KEGG信號通路分析結果表明，上述基因主要參與植物激素信號轉導等通路。在構建的共同差異表達基因的蛋白質網絡中，有29個節點。另外，得到10個關鍵基因、2個關鍵子網絡。研究結果為進一步研究水稻低溫脅迫關鍵基因奠定了基礎，也有利于水稻低溫育種。

關鍵詞：水稻；GEO數據庫；低溫脅迫；共同差異表達基因；GO功能分析；KEGG信號通路分析

中圖分類號：S511.01；S126? 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）03-0061-06

水稻（Oryza sativa L.）起源于熱帶與亞熱帶，是低溫敏感型作物。低溫嚴重影響了水稻的產量和品質，也限制了水稻向高海拔、高緯度地區擴展［1］。從全球范圍來看，目前有24個國家約1 500萬hm2的水稻受到低溫影響，在亞洲南部、東南部，約700萬hm2的土地由于受到低溫影響而無法種植水稻［2］。在我國的東北地區，由于緯度較高、溫度偏低，每3～5年就會發生1次冷害［3］。因此，培育耐冷水稻品種具有十分重要的現實意義。

植物的耐冷性是多基因效應的，其機理復雜，而利用傳統育種方式在改良植物耐冷性方面有限制。如果采用基因工程技術進行作物育種，是提高植物耐冷性比較有效的途徑［4］。水稻與低溫脅迫相關的基因可以分2類：第1類是功能基因，其編碼產物在水稻受到低溫脅迫時直接起到保護作用；第2類是調控基因表達的信號因子［5］。閆凌月等研究發現，OsMADS25通過提高水稻在低溫脅迫下對活性氧的清除能力，進而提高其對低溫的耐受性［6］。Hur等研究發現，水稻中合成脯氨酸的關鍵基因OsP5CS2對提高水稻的耐冷性十分重要［7］。Li等研究發現，OsTPS1基因的超表達能夠提高轉基因水稻對干旱、鹽和低溫脅迫的耐受性［8］。陳能剛等研究發現，在孕穗期、開花期，轉異戊烯基轉移酶基因（isopentenyl transferase ipt）水稻的相對電導率的變化量和葉綠體受低溫的危害較?。?］。張明星構建的OsWRKY63水稻突變體具有較強的耐冷性，為水稻耐冷品種的選育提供了潛在基因資源和中間育種材料［10］。Wang等研究發現，含有OsDREB1F基因的轉基因水稻對鹽、干旱和低溫的耐受性有所提高［11］。另有研究也發現，轉錄因子MYB、SNAC、TCP、PHD、bZIP與水稻的耐冷性有關［12-16］。

GEO數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）是一個公共功能基因組數據存儲庫，目前儲存了100多個物種的約十億個基因表達數據，科研人員借助基于WEB的工具，有效地探索、查詢和下載這些海量數據，從而更好地分析和設計自己的試驗。本研究采用生物信息學技術分析GEO數據庫中與水稻低溫脅迫相關的一些數據，篩選關鍵差異基因及其功能、信號通路，以期研究低溫脅迫對水稻生長發育影響的分子機制，從而為今后水稻耐冷性育種奠定良好基礎。

1 材料與方法

1.1 基因芯片數據的獲取與篩選

水稻低溫脅迫基因表達譜芯片數據來源于NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）的GEO數據庫?；趯Λ@得的初始數據的分析與試驗要求，采用GSE6901、GSE31874、GSE37940和GSE71680共4個數據集，選擇其中70個樣本進行數據分析（表1）。試驗分析時間是2022年10—12月，地點在周口師范學院。

1.2 方法

1.2.1 共同差異表達基因的篩選 首先利用GEO數據庫中的在線分析程序GEO2R對不同數據集的處理組、對照組進行分析，并以P<0.05、|log2 FC|≥2作為差異表達基因篩選的標準。然后，利用Evenn（http：//www. ehbio.com/test/venn/#/）獲得4個數據集的共同差異表達基因。

1.2.2 共同差異表達基因的GO功能分析和KEGG信號通路分析 首先在UniProt數據庫（https：//www.uniprot.org）中查詢各個共同差異表達基因的GO號，然后利用WEGO 2.0（https：//wego.genomics.cn/）進行共同差異表達基因的GO功能分析。KEGG信號通路分析利用DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp）、KOBAS （http：//kobas.cbi.pku.edu.cn/）2個在線網站。

1.2.3 蛋白互作網絡的構建 用STRING（https：//cn.string-db.org/）和Cytoscape 3.9.1軟件構建共同差異表達基因的蛋白質互作網絡關系圖，用Cytoscape 3.9.1 Cytohubba插件篩選關鍵基因，用Cytoscape 3.9.1 MCODE篩選關鍵子網絡。

2 結果與分析

2.1 共同差異表達基因的篩選結果

利用4個數據集的70個樣本進行研究分析，按照規定的篩選標準，從GSE6901中獲得1 107個基因，從GSE31874中獲得2 537個基因，從GSE71680中獲得184個基因，從GSE37940中獲得498個基因。之后，經Evenn在線分析，獲得51個共同差異表達基因 （圖1），其中上調表達基因1個，是AK108642，下調表達基因50個（表2）。

2.2 共同差異表達基因的GO功能分析和KEGG信號通路分析

對共同差異表達基因的GO分析結果（圖2）表明，細胞組成主要集中在細胞、細胞要素、細胞器上，分別達到41.2%、41.2%、35.3%。在分子功能上，這些基因的功能主要集中在結合、催化活性上，分別達到62.7%、31.4%。在生物過程中，這些基因的功能主要集中在細胞過程、代謝過程、生物調控上，分別達到49.0%、41.2%、39.2%。KEGG信號通路分析結果（表3、圖3）表明，這些差異表達基因主要參與植物激素信號轉導、植物病原相互作用、類胡蘿卜素生物合成、脂肪酸延伸、RNA降解和次生代謝產物的生物合成等通路中。

2.3 共同差異表達基因的蛋白質網絡構建與關鍵基因的篩選

利用STRING數據庫與Cytoscape軟件對共同差異表達基因構建蛋白質網絡，最終得到29個節點 （圖4-a）。另外，得到10個關鍵基因（圖4-b）、2個關鍵子網絡（圖4-c、圖4-d）。這10個關鍵基因的熱圖見圖5。

3 討論和結論

本研究基于GPL2025、GPL7344等2個平臺上的4個數據集的70個樣本進行基因表達數據的分析。最終篩選出共同差異表達基因51個，其中上調表達的基因只有1個，下調表達的基因50個，并用Cytoscape 3.9.1 Cytohubba篩選出10個關鍵基因。

KEGG信號通路分析結果表明，植物激素信號轉導過程是一個主要的信號通路過程。脫落酸（ABA）是植物體內一種多功能植物激素，植物在非生物脅迫下，其體內的ABA含量通常會升高，從而可以增強植物應對干旱、鹽、低溫等非生物脅迫的能力［17］。一些早期的研究結果表明，內源性ABA的積累是植物對低溫脅迫的響應［18-20］，另有研究證實，ABA處理能夠增強黃瓜、苜蓿的抗寒性［21-22］。在本研究中，植物激素信號轉導路徑涉及AK107854、AK120087、AK070649等3個基因，這3個基因都與轉錄因子TIFY有關。幾乎所有的OsTIFY基因對干旱、鹽度和低溫等有一種或多種非生物脅迫有反應［23］。徐佳寧的研究發現，幾乎所有蘋果MdUPL基因的表達都受到鹽、干旱或者低溫脅迫的誘導，尤其是MdUPL7、MdUPL9在低溫脅迫下表達量顯著上調［24］。Ca2+已經被證明是植物冷脅迫的第二信使，而編碼CML的基因參與了冷脅迫誘導的Ca2+信號途徑［25］。Hu等研究發現，KCS與小麥的耐冷性有關［26］。YLS9（YELLOW-LEAF-SPECIFIC GENE 9）對ABA有響應［27］。在擬南芥CBP60家族成員中，AtCBP60a、AtCBP60g、AtSARD1參與低溫誘導的水楊酸的合成［1］。Peres等研究發現，EL2編碼了一種新型植物CDK（cyclin-dependent protein kinase）抑制劑，將細胞周期進程與生物、非生物應激反應聯系起來，而非生物脅迫如低溫和干旱誘導了EL2 mRNA的表達［28］。

GO功能分析結果也表明，這些共同差異基因的功能主要集中在細胞過程、代謝過程和生物調控上。利用Cytoscape 3.9.1-MCODE篩選得到2個關鍵子網絡，這2個關鍵子網絡所涉及的7個基因都屬于重點關注的10個關鍵基因。結合以上分析，在水稻的耐冷育種中，可以重點考慮上面提到的10個關鍵基因。本研究為水稻的耐冷育種提供了一定的理論依據，奠定了良好的基礎。

參考文獻：

［1］吉凌霄. OsTIL1和OsCBP60調控水稻苗期耐冷性信號轉導機制的研究［D］. 武漢：華中農業大學，2022：1-2.

［2］Pradhan S K，Pandit E，Nayak D K，et al. Genes，pathways and transcription factors involved in seedling stage chilling stress tolerance in indica rice through RNA-Seq analysis［J］. BMC Plant Biology，2019，19（1）：352.

［3］王海濤. CHS1調控水稻耐冷性的機制研究［D］. 長春：吉林大學，2022：1-5.

［4］段俊枝，李 瑩，周 雷，等. 利用基因工程技術提高水稻耐冷性的研究進展［J］. 浙江農業學報，2015，27（4）：705-712.

［5］徐青山，黃 晶，孫愛軍，等. 低溫影響水稻發育機理及調控途徑研究進展［J］. 中國水稻科學，2022，36（2）：118-130.

［6］閆凌月，張豪健，鄭雨晴，等. 轉錄因子OsMADS25提高水稻對低溫的耐受性［J］. 遺傳，202 3（11）：1078-1087.

［7］Hur J H，Jung K H，Lee C H，et al. Stress-inducible OsP5CS2 gene is essential for salt and cold tolerance in rice［J］. Plant Science，2004，167（3）：417-426.

［8］Li H W，Zang B S，Deng X W，et al. Overexpression of the trehalose-6-phosphate synthase gene OsTPS1 enhances abiotic stress tolerance in rice［J］. Planta，2011，234（5）：1007-1018.

［9］陳能剛，余顯權，趙德剛，等. 轉ipt基因水稻植株耐冷性研究［J］. 西南農業學報，2006，19（2）：255-259.

［10］張明星. OsWRKY63調控水稻耐冷性的分子機制研究［D］. 長春：吉林大學，2022：21-48.

［11］Wang Q Y，Guan Y C，Wu Y R，et al. Overexpression of a rice OsDREB1F gene increases salt，drought，and low temperature tolerance in both Arabidopsis and rice［J］. Plant Mol Biol，2008，67（6）：589-602.

［12］Yang A，Dai X Y，Zhang W H. A R2R3-type MYB gene，OsMYB2，is involved in salt，cold，and dehydration tolerance in rice［J］. Journal of Experimental Botany，2012，63（7）：2541-2556.

［13］Hu H H，You J，Fang Y J，et al. Characterization of transcription factor gene SNAC2 conferring cold and salt tolerance in rice［J］. Plant Mol Biol，2008，67：169-181.

［14］王孫婷. 水稻OsPCF6與OsTCP21基因冷脅迫應答功能研究［D］. 哈爾濱：東北農業大學，2014：37-57.

［15］馬 卉. 水稻PHD-finger家族低溫誘導基因的鑒定與啟動子功能分析［D］. 合肥：安徽農業大學，2014：30-34.

［16］關可興. 水稻耐冷性相關轉錄因子OsbZIP32的功能分析［D］. 長春：吉林大學，2015：1-9.

［17］張明菊，朱 莉，夏啟中. 植物激素對脅迫反應調控的研究進展［J］. 湖北大學學報（自然科學版），202 3（3）：242-253.

［18］Daie J，Campbell W F. Response of tomato plants to stressful temperatures increase on abscisic acid concentrations［J］. Plant Physiol，1981，67（1）：26-29.

［19］Eze J M O，Dumbroff E B，Thompson J E.Effects of temperature and moisture stress on the accumulation of abscisic acid in bean［J］. Physiologia Plantarum，1983，58（2）：179-183.

［20］Lalk I，Drffling K. Hardening，abscisic acid，proline and freezing resistance in two winter wheat varieties［J］. Physiologia Plantarum，1985，63（3）：287-292.

［21］Flores A，Grau A，Laurich F，et al. Effect of new terpenoid analogues of abscisic acid on chilling and freezing resistance［J］. Journal of Plant Physiology，1988，132（3）：362-369.

［22］Mohapatra S S，Poole R J，Dhindsa R S.Abscisic acid-regulated gene expression in relation to freezing tolerance in alfalfa［J］. Plant Physiology，1988，87（2）：468-473.

［23］Ye H Y，Du H，Tang N，et al. Identification and expression profiling analysis of TIFY family genes involved in stress and phytohormone responses in rice［J］. Plant Mol Biol，2009，71（3）：291-305.

［24］徐佳寧. 蘋果UPL基因家族及轉錄組和蛋白質組響應非生物脅迫的研究［D］. 泰安：山東農業大學，2017：42-94.

［25］陳文燁. 小麥鈣調素/類鈣調素基因的特征分析、克隆及功能研究［D］. 石家莊：河北科技大學，2019：1-2.

［26］Hu X J，Zhang Z B，Fu Z Y，et al. Significance of a β-ketoacyl-CoA synthase gene expression for wheat tolerance to adverse environments［J］. Biologia Plantarum，2010，54（3）：575-578.

［27］Divi U K，El-Tahchy A，Vanhercke T，et al. Transcriptional and biochemical responses of monoacylglycerol acyltransferase-mediated oil synthesis and associated senescence-like responses in Nicotiana benthamiana［J］. Frontiers in Plant Science，2014，5：204-216.

［28］Peres A，Churchman M L，Hariharan S，et al. Novel plant-specific cyclin-dependent kinase inhibitors induced by biotic and abiotic stresses［J］. Journal of Biological Chemistry，2007，282（35）：25588-25596.