氮處理對高粱氮代謝相關基因NR、GS、GOGAT表達的影響

徐洪超 王增雪 逄洪波 王蘭蘭 李雪梅 馬蓮菊 張飛 李玥瑩

摘要：為了探究不同氮處理對高粱氮代謝相關酶基因表達的影響，提高高粱氮素利用率，選擇最佳施氮模式，選用2個高粱品種遼粘3號、晉雜34，設置4個氮處理水平（N0：0 kg/hm2，N1：60 kg/hm2，N2：120 kg/hm2，N3：180 kg/hm2），用熒光定量PCR方法分別測定苗期、拔節期、抽穗期、成熟期高粱葉片、籽粒的NR、GS、GOGAT基因相對表達量，分析不同氮處理水平對氮代謝相關酶基因表達的影響。結果表明：除成熟期葉片外，各生育期遼粘3號、晉雜34葉片、籽粒在施氮條件下的NR、GS、GOGAT基因相對表達量均高于未施氮處理。隨施氮量增加，高粱葉片和籽粒NR、GS、GOGAT基因相對表達量呈上調或先上調后下調的變化趨勢。遼粘3號和晉雜34在N2、N3處理的NR、GS、GOGAT基因相對表達量處于較高水平。綜合多方面因素考慮，可以將N2處理確定為最適施氮量。

關鍵詞：氮處理；基因表達；高粱；氮代謝；基因相對表達量

中圖分類號：S514.06? 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）03-0079-05

高粱作為世界上第五大類糧食作物，具有生長力強、二氧化碳利用率高、需水量少等優勢，在惡劣的生長環境中還具有耐鹽堿、耐瘠薄、耐澇等抗逆特性［1-2］。高粱的應用十分廣泛，在釀酒業、能源業、飼料業、造紙業、板材業和色素業等領域具有巨大的發展空間和優勢。隨著高粱的需求不斷增多，產量成為其研究領域的一個重要課題。

氮素是植物生長的必需元素，主要以硝態氮和銨態氮的形式參與植物體內的氮代謝調節過程。硝酸還原酶（NR）是硝態氮轉化為銨態氮的第1個關鍵酶，谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酸合酶（GOGAT）是無機氮轉化為有機氮的關鍵酶［3］，它們對氮代謝同化過程具有不可替代的作用。同時，氮素同化過程受到一系列氮代謝相關酶基因的調控。氮代謝相關酶基因會影響酶活性的表達，從而影響高粱產量和品質。房曉琨研究發現，栽培大豆的NR、GS、GOGAT活性與其對應的基因相對表達量呈顯著或極顯著正相關關系［4］。植物體內含N化合物的含量與氮代謝相關酶基因表達量的關系也十分密切，魯黎明等對烤煙研究發現，煙葉可溶性蛋白含量與NR基因相對表達量呈極顯著正相關關系［5］。林照輝研究發現，在一定范圍內，白菜NR基因的表達隨氮素濃度升高而升高［6］。寧改星等以葡萄為試材，研究發現，施氮可以影響氮代謝相關酶基因的表達，改善氮代謝水平［7］。施氮處理下的葉片NR、GS、GDH基因表達水平均高于對照。然而過量施用氮肥，會產生成本增加、資源浪費、環境污染等眾多的問題［8］。所以，在保持作物產量穩定的同時，提高氮肥利用效率，減少氮肥使用量是解決問題的關鍵。

目前有關高粱氮代謝相關酶基因表達的報道比較少。本試驗選用遼粘3號、晉雜34高粱品種，分析比較不同氮處理對不同高粱品種各生育期葉片和籽粒的NR、GS、GOGAT基因相對表達量，旨在從分子水平探究氮肥對高粱氮代謝的調控機制，為提高高粱氮素利用率、選擇最佳施氮模式提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗于2021年在遼寧省農業科學院試驗基地進行。試驗材料是2個高粱品種遼粘3號、晉雜34，分別設置4個氮處理（N0 ：0 kg/hm2，N1：60 kg/hm2，N2：120 kg/hm2，N3：180 kg/hm2），選取苗期、拔節期、抽穗期、成熟期高粱葉片和籽粒進行試驗。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取與濃度檢測 使用promega RNA提取試劑盒對高粱葉片和籽粒RNA進行提取。用核酸定量儀ScanDrop 200進行濃度檢測［9］。

1.2.2 Sor-NR、Sor-GS、Sor-GOGAT基因引物的設計 通過查找相關文獻資料［10］，確定本試驗引物序列（表1）。

1.2.3 反轉錄 （1）去除基因組DNA。反應體系：5×gDNA Clean Reaction Mix 2 μL，Total RNA*1 8 μL；反應條件：42 ℃ 2 min。（2）反轉錄反應。反應體系：即去除基因組DNA反應液10 μL，主要包括5× Evo M-MLV RT ReactionMix*1 4 μL，RNase freewater*1 6 μL；反應條件：37 ℃ 15 min；85 ℃ 5 s。

1.2.4 RT-qPCR反應 本試驗使用TB Green Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒進行RT-qPCR反應。反應體系包括TB Green Premix Ex TaqⅡ 10 μL，PCR Forward Primer（10 μmol/L）0.8 μL，PCR Reverse Primer（10 μmol/L）0.8 μL，DNA模板（<100 ng）*2 2.0 μL，滅菌水6.4 μL。RT-qPCR反應條件：95℃預變性30s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個循環；熔解，95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min；50 ℃降溫30 s。

1.3 統計分析

試驗數據用2-ΔΔCT 算法進行計算，并采用SPSS 20.0軟件進行差異顯著性分析（α=0.05），使用Origin 2021軟件進行作圖。

2 結果與分析

2.1 氮處理對不同高粱品種不同生育期NR基因相對表達量的影響

2.1.1 對葉片NR基因相對表達量的影響 以N0處理作為對照，分別對遼粘3號和晉雜34在不同生育期不同氮處理的葉片NR基因相對表達量進行分析。結果表明，在拔節期、抽穗期、成熟期，遼粘3號葉片NR基因相對表達量均表現為N2>N3>N1>N0，N2處理下的葉片NR基因相對表達量顯著高于其他處理；在苗期，N3處理的葉片NR基因相對表達量最高，N2處理次之。在苗期、抽穗期、成熟期，晉雜34在N2處理的葉片NR基因相對表達量最高，N3處理次之，其中苗期、成熟期N2處理顯著高于其他處理。在拔節期，晉雜34葉片NR基因相對表達量隨施氮量增加逐漸上調，N3處理下的葉片NR基因相對表達量分別是N0、N1、N2處理的10.24、2.60、1.26倍（圖1）。

2.1.2 對籽粒NR基因相對表達量的影響 以N0處理作為對照，分別對遼粘3號和晉雜34在不同生育期不同氮處理的籽粒NR基因相對表達量進行分析。結果表明，在抽穗期，遼粘3號和晉雜34籽粒NR基因相對表達量隨施氮量增加呈上調趨勢，N3處理顯著高于其他處理。在成熟期，遼粘3號在N3處理的籽粒NR基因相對表達量顯著高于其他處理，晉雜34在不同氮處理的籽粒NR基因相對表達量表現為N2>N3>N1>N0，且各處理之間沒有顯著差異（圖2）。

2.2 氮處理對不同高粱品種不同生育期GS基因相對表達量的影響

2.2.1 對葉片GS基因相對表達量的影響 以N0處理作為對照，分別對遼粘3號和晉雜34在不同生育期不同氮處理的葉片GS基因相對表達量進行分析。結果表明，在苗期、拔節期、抽穗期、成熟期，遼粘3號葉片GS基因相對表達量均表現為N2>N3>N1>N0，N2處理顯著高于其他處理。在苗期、拔節期、抽穗期、成熟期，遼粘3號在N2處理的GS基因相對表達量分別是N0處理的3.73、4.55、2.91、1.73倍。在苗期、拔節期、抽穗期、成熟期，晉雜34葉片GS基因相對表達量隨施氮量增加逐漸上調，且苗期、拔節期、抽穗期N3處理顯著高于其他處理；成熟期N1、N2、N3處理間差異不顯著（圖3）。

2.2.2 對籽粒GS基因相對表達量的影響 以N0處理作為對照，分別對遼粘3號和晉雜34在不同生育期不同氮處理的籽粒GS基因相對表達量進行分析。結果表明，在抽穗期，遼粘3號和晉雜34高粱籽粒GS基因相對表達量表現為N2>N3>N1>N0，N2處理顯著高于其他處理。在成熟期，遼粘3號和晉雜34在N2處理的籽粒GS基因相對表達量最高，N0、N1、N3處理間差異不顯著（圖4）。

2.3 氮處理對不同高粱品種不同生育期GOGAT基因相對表達量的影響

2.3.1 對葉片GOGAT基因相對表達量的影響 以N0處理作為對照，分別對遼粘3號和晉雜34在不同生育期不同氮處理的葉片GOGAT基因相對表達量進行分析。結果表明，遼粘3號在苗期、拔節期、抽穗期、成熟期N2處理的葉片GOGAT基因相對表達量顯著高于其他處理，在苗期、拔節期、抽穗期、成熟期N3處理的葉片GOGAT基因相對表達量分別是N0處理的3.11、7.69、2.02、2.08倍。在苗期、抽穗期，晉雜34在N3處理的葉片GOGAT基因相對表達量最高，分別是N0處理的10.66、1.99倍；在拔節期、成熟期，晉雜34在N2處理的葉片GOGAT基因相對表達量最高，分別是N0處理的6.59、4.58倍（圖5）。

2.3.2 對籽粒GOGAT基因相對表達量的影響 以N0處理作為對照，分別對遼粘3號和晉雜34高粱在不同生育期不同氮處理的籽粒GOGAT基因相對表達量進行分析。結果表明，在抽穗期，遼粘3號和晉雜34高粱籽粒GOGAT基因相對表達量表現為N2>N3>N1>N0，N2處理的葉片GOGAT基因相對表達量分別是N0的2.97、3.98倍。在成熟期，遼粘3號和晉雜34高粱籽粒GOGAT基因相對表達量隨施氮量增加逐漸上調，且N2、N3處理間差異不顯著，N2處理的葉片GOGAT基因相對表達量是N0的12.89、4.38倍（圖6）。

3 討論

氮素同化過程受到基因的調控，氮素含量影響氮代謝相關基因的表達，不同基因在不同品種的氮代謝通路上發揮的作用也會有所差別［11-12］。硝態氮在NR等相關酶的催化下可以轉化成銨態氮，GS/GOGAT可以催化銨態氮生成谷氨酸，在無機氮轉化成有機氮過程中發揮重要作用。目前，NR基因已在菠菜［13］、桑樹［14］等多個植物中被克隆，GS基因也相繼在甜菜［15］、小麥［16］中被克隆。影響氮代謝相關酶基因表達的因素很多，其中溫度、光照、Fe3+均可以影響氮代謝相關酶基因的表達［17］。王添民研究發現，不同硝銨比可以影響葡萄NR、GS、GOGAT基因的表達量［18］。植物的不同部位氮代謝相關酶基因表達也有所差別，周月琴研究發現，NR基因在茶樹根部的表達量要高于莖和葉［19］。

本研究通過測定高粱NR、GS、GOGAT基因相對表達量發現，除成熟期葉片外，其他各生育期遼粘3號和晉雜34葉片、籽粒在施氮條件下的NR、GS、GOGAT基因相對表達量均高于未施氮處理（N0）。同時，遼粘3號和晉雜34在N2、N3處理的NR、GS、GOGAT基因相對表達量高于N0、N1處理。在抽穗期、成熟期，遼粘3號和晉雜34在N2處理下的葉片NR基因相對表達量最高。隨施氮量增加，各生育期遼粘3號葉片GS、GOGAT基因相對表達量呈先上調后下調的變化趨勢，且N2處理顯著高于其他處理；晉雜34葉片GS基因相對表達量逐漸上調。在抽穗期，遼粘3號和晉雜34籽粒GS、GOGAT基因相對表達量隨施氮量增加呈先上調后下調的變化趨勢，N2處理表達量最高。以上說明合理施氮可以提高高粱NR、GS、GOGAT基因相對表達量，氮素過多則會抑制氮代謝相關酶基因的表達。本研究結果與寧改星等的研究結果［7，20］保持一致。之前研究的施氮量對高粱氮代謝關鍵酶活性的影響發現，適當施氮可以提高遼粘3號高粱氮代謝相關酶活性，有利于氮代謝過程，從而提高產量［21］。本研究從分子角度進一步驗證上述結果。

4 結論

綜上所述，適當施氮可以提高高粱NR、GS、GOGAT基因相對表達量，促進植物氮代謝過程，同時N2、N3處理下的高粱氮代謝相關酶基因相對表達量較高，與氮代謝相關酶活性研究結果一致。綜合氮素利用效率等多方面因素，可以將N2（120 kg/hm2）處理確定為遼粘3號、晉雜34高粱的最佳施氮量。

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