基于網絡藥理學方法、分子對接技術及動物實驗驗證探討通塞顆粒治療慢性阻塞性肺疾病急性加重期的作用機制

付子堅，李建生，田燕歌，趙鵬，燕苗苗，蘆曉帆

1. 河南中醫藥大學第二臨床醫學院，河南 鄭州 450011

2. 河南中醫藥大學呼吸系統疾病重點實驗室，河南 鄭州 450046

3. 河南中醫藥大學第一臨床醫學院，河南 鄭州 450046

慢性阻塞性肺疾?。–OPD）是一種以呼吸道持續氣流受限為特征的進行性發展的肺部疾病，其肺部癥狀急性惡化階段又被稱為COPD 急性加重期（AECOPD）。感染是AECOPD 最主要的誘因，是造成COPD 患者肺功能惡化和氣道重塑的關鍵因素，也是導致患者死亡的重要原因。AECOPD 歸屬于中醫學肺脹范疇。有學者對AECOPD 中醫證候分布規律進行文獻研究與臨床調查研究，得出痰熱壅肺型為AECOPD 的最常見證型[1-2]。通塞顆粒是河南中醫藥大學第一附屬醫院的院內制劑，由葶藶子、地龍、浙貝母等組成，具有清熱滌痰活血、宣肺降氣平喘等作用。經臨床研究證實，該藥物治療痰熱壅肺型AECOPD 具有良好療效，可以有效改善患者的通氣功能和血氣分析結果，減少肺部炎癥，促進炎性分泌物的吸收[3-4]。團隊前期研究表明，通塞顆粒-補肺益腎方序貫治療AECOPD 可有效減輕急性炎癥滲出、改善AECOPD 大鼠肺組織病理損傷，且其作用機制與調控Toll 樣受體4（TLR4）/核因子-κB（NF-κB）信號通路有關[5-6]。本研究在此基礎上運用網絡藥理學和分子對接技術，通過構建中藥復方調控網絡，篩選出通塞顆粒治療AECOPD 的潛在靶標，并對富集分析出的通路及關鍵蛋白加以實驗驗證，為后續研究提供新思路。具體研究流程如圖1 所示。

圖1 研究流程示意圖

1 實驗材料

1.1 實驗動物SPF 級SD 大鼠50 只，雄性，6～8 周齡，體質量（200±20）g，動物質量合格證號：110011211105823815，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0011。動物飼養于河南中醫藥大學動物實驗室[SYXK（豫）2020-0004]。本研究通過河南中醫藥大學實驗動物福利倫理審查委員會審查批準（倫理審查批號為YFYDW2021028）。

1.2 藥物、試劑及儀器

1.2.1 藥物通塞顆粒（河南中醫藥大學第一附屬醫院院內制劑），鹽酸莫西沙星片（拜耳醫藥保健有限公司，國藥準字J20150015，規格：0.4 g×3 片），硫酸沙丁胺醇片（江蘇亞邦愛普森藥業有限公司，國藥準字H32024535，規格：2mg×100 片）。

1.2.2 試劑肺炎克雷伯桿菌（46117-5a1），購于中國醫學細菌保藏管理中心（CMCC）；紅旗渠過濾嘴烤煙型香煙（河南中煙工業有限責任公司）；蘇木素-伊紅（HE）染液套裝（Servicebio 武漢賽維爾生物科技有限公司）；大鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）酶聯免疫吸附法（ELISA）試劑盒（ELISA Kit）、大鼠白細胞介素-17A（IL-17A）ELISA Kit 均購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；NF-κB P65 抗體（以下簡寫為P65）（貨號：GTX102090）、NF-κB P65（phospho Ser536）抗體（以下簡寫為 P -P65）（貨號：GTX133899），絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶B（AKT）抗體[N3C2]， Internal（以下簡寫為 AKT）（貨號：GTX121937），AKT（phospho Ser473）抗體（以下簡寫為P-AKT）（貨號：GTX128414）、兔抗絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）/絲裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）多克隆抗體[細胞外調節蛋白激酶（ERK1/2），以下簡寫為MAPK1/3]（貨號：GTX134462）、ERK1（phospho Thr202/Tyr204）+ERK2（phospho Thr185/Tyr187）抗體[HL173]（以下簡寫為P-MAPK1/3）（貨號：GTX635617）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（貨號：GTX28245）均購自美國GENETEX，INC.；腫瘤抑制蛋白53（TP53）抗體（貨號：YT3528）購自美國ImmunoWay Biotechnology Company；辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗鼠二抗（貨號：SA00001-1）、HRP 標記山羊抗兔二抗（貨號：SA00001-2）均購于武漢三鷹技術有限公司。RIPA 裂解液（貨號：20-188）購自美國EMD MILLIPORE CORPORATION；BCA 試劑盒（貨號：PC0020）購自北京索萊寶科技有限公司；10%SDS-PAGE 電泳凝膠試劑盒（貨號：PG112）購自上海雅酶生物醫藥科技有限公司。

1.2.3 儀器DSI Buxco 非束縛小動物肺功能測量儀及FinePointe 動物肺功能檢測系統（DATA SCIENCES INTERNATIONAL，INC.，美國）；Multiskan GO 全波長酶標儀及D-37520 臺式高速冷凍離心機（賽默飛科技中國有限公司）；TissueLyser Ⅱ樣品破碎系統（QIAGEN，德國）；DM6000 B 光學顯微鏡及LAS V4.7 照相系統（Leica，德國）；Image-pro plus（IPP）6.0 專業圖像分析系統（Media Cybernetics，美國）。

2 研究方法

2.1 數據庫與軟件①數據庫：中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（TCMSP）（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）、中藥化學數據庫（http：//www.organchem.csdb.cn/scdb/default.htm）、蛋白質數據庫（UniProt）（https：//www.uniprot.org/）、人類基因（GeneCards）數據庫（https：//www.genecards.org/）、在線人類孟德爾遺傳數據系統（OMIM）數據庫（https：//www.omim.org/）、人類疾病相關基因（DisGeNET）數據庫（https：//www.disgenet.org/）、人類疾?。∕alaCards）數據庫（https：//www.malacards. org/）、 DrugBank 數據庫（https：//go.drugbank.com/）、微生信在線生物信息學分析、可視化云平臺（http：//www. bioinformatics. com. cn/）、STRING 數據庫（https：//cn.string-db.org/）、蛋白質結構數據庫（RSCB PDB）（https：//www.rcsb.org/）、有機小分子生物活性數據（Pub-chem）數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）。②軟件：Cytoscape 3.8.1軟件，R 4.1.3 軟件，ChemoBio 3D Ultra 17.0 軟件；Pymol 軟件，AutoDockTool 1.5.6 軟件，Vina 軟件。

2.2 通塞顆?；钚猿煞趾推鋵悬c篩選將通塞顆粒中的10 味中藥（矮地茶、赤芍、大黃、地龍、麻黃、麥冬、人參、石菖蒲、葶藶子、浙貝母）分別錄入TCMSP 數據庫，根據TCMSP 參數信息，將口服利用度（OB）≥20% 且類藥性質（DL）≥0.1 作為篩選標準，獲取各中藥活性成分及其對應靶點，并從Uniprot 數據庫對靶點名稱進行注釋，轉換為基因編號ID（Gene Symbol ID）。其中地龍、麥冬2 味中藥并未被TCMSP 數據庫收錄，將其錄入中藥化學數據庫，獲得2 味中藥的化學成分物質數字識別號碼（CAS 號），再從TCMSP 數據庫根據參數信息，將OB≥20%且DL≥0.1%作為篩選標準，進一步篩選。

2.3 疾病基因篩選以“acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease”為關鍵詞，通過GeneCards、 OMIM、 DisGeNET、 MalaCards、 Drug-Bank 5 個數據庫，檢索獲取與AECOPD 相關的基因。

2.4 共同靶點獲取和網絡圖的繪制通過微生信在線生物信息學分析、可視化云平臺繪制韋恩圖（Venn圖），獲得通塞顆粒治療AECOPD 的交集靶點。將相關數據導入Cytoscape 3.8.1 軟件構建中藥-有效成分-靶點-疾病網絡圖，并根據網絡圖平均度值（degree值）篩選出核心活性成分。

2.5 蛋白質相互作用（PPI）網絡構建及核心靶點篩選將2.4 項中篩選得到的交集靶點信息導入STRING 數據庫，從多種蛋白質（multiple proteins）中導入選中靶點，有機體（organism）選為“智人（homo sapiens）”，以最高置信度（highest confidence）＞0.900作為篩選條件，下載交集靶點的PPI 網絡TSV 文件。將下載文件導入Cytoscape 3.8.1 軟件構建PPI 網絡圖，根據平均度值（degree 值）和平均中介中心度值（betweenness 值）篩選核心靶點。

2.6 相關通路富集分析運用R 語言軟件中的“org.Hs.eg.db”數據包將核心靶點轉化為基因ID，導入R 4.1.3 軟件，設定P-value＜0.05、Q-value＜0.05，利用“BiocManager”等軟件包對關鍵節點進行基因本體（GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，取前30 項構建柱狀圖。并將KEGG 通路富集分析得到的數據導入Cytoscape 3.8.1軟件進一步構建靶點-通路網絡圖。

2.7 關鍵活性成分與核心靶點分子對接將2.4、2.5 項中degree 值排在前5 的活性成分和degree 值排在前6 的核心靶點分別進行對接。將活性成分的英文名稱導入Pub-chem 數據庫，下載其相應的小分子配體（2D 結構，sdf 格式），使用ChemoBio 3D Ultra 17.0 軟件轉格式（3D 結構，mol2 格式）；將核心靶點導入Uniport 數據庫，限定物質來源設定為homo sapiens，將得到的條目導入RSCB PDB 數據庫，下載其相應的基因蛋白（3D 結構，pdb 格式），利用AutoDockTool 1.5.6 軟件去水加氫轉格式（3D 結構，pdbqt 格式），并設置保存活性口袋的數據參數（grid.gpf 格式）。運用Vina 軟件對活性成分和核心靶點進行分子對接，結果通過Pymol 軟件進行可視化展示。

2.8 通塞顆粒治療AECOPD 網絡藥理學實驗驗證

2.8.1 模型制備與分組干預采用隨機數字表法將50 只大鼠隨機分為對照組、模型組、中藥組、西藥組、聯合組。每組10 只。除對照組外，其余各組通過香煙和肺炎克雷伯桿菌刺激誘導制備AECOPD大鼠模型[7-8]。并于急性加重前2 d（Day-1、0）及其后4 d（Day 2～5）給予灌胃治療，每天2 次。藥物灌胃劑量采用等效劑量系數換算公式計算，具體公式為：D大鼠=D人×（HI大鼠/HI人）×（W大鼠/W人）2/3（其中D：劑量；HI：體型系數；W：體質量），具體給藥方案見表1。對照組、模型組均予同體積0.9%氯化鈉溶液。

表1 各組大鼠給藥方案

2.8.2 肺功能檢測治療結束后，用DSI Buxco 非束縛小動物肺功能測量儀以及FinePointe 動物肺功能檢測系統檢測大鼠的肺功能指標，包括0.3 s 用力呼氣容積（FEV0.3）、用力肺活量（FVC）、0.3 s 用力呼氣容積與用力肺活量的比值（FEV0.3/FVC）、呼氣流量峰值（PEF）。

2.8.3 血清TNF-α、IL-17 含量麻醉大鼠，腹主動脈取血。取上清，采用ELISA 法檢測血清中TNF-α、IL-17 的含量。

2.8.4 肺組織病理形態學觀察處死大鼠后，結扎未灌洗的左肺，取肺組織，經脫水、透明、浸蠟、包埋、切片后進行HE 染色并封片，在光學顯微鏡100 倍及200 倍光鏡下觀察切片。

2.8.5 肺組織中P-P65、P65、P-AKT、AKT、PMAPK1/3、MAPK1/3 以及TP53 的蛋白表達在肺組織中加入RIPA 裂解液，剪碎打成勻漿，用離心機離心后提取蛋白質，通過BCA 試劑盒經全波長酶標儀進行蛋白質定量，經10% SDS-PAGE 電泳凝膠分離，轉膜、封閉、抗體孵育后，用IPP 6.0 專業圖像分析系統進行條帶掃描，測定各目的條帶及內參GAPDH 的灰度值，計算比值，求得目的蛋白的相對表達含量。

3 統計學方法

應用SPSS 22.0 軟件統計數據。計量資料數據服從正態分布，以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析。方差齊時，多重比較采用LSD 法；方差不齊時，多重比較采用Dunnett T3 法。計量資料數據不服從正態分布，則采用非參數檢驗進行比較。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

4 研究結果

4.1 通塞顆?；钚猿煞旨捌漕A測靶點篩選通過TCMSP 數據庫收集、基于藥物代謝動力學（ADME）參數（OB≥20%、DL≥0.1）篩選出通塞顆粒的活性成分共219 個，對應預測靶點1 351 個，刪去在UniProt 數據庫中不能匹配基因名的靶點，去重后，獲得通塞顆粒有效成分172 個，對應預測靶點306 個。各中藥的活性成分個數和其對應的靶點個數見表2。部分中藥活性成分名稱見表3。

表2 通塞顆?；钚猿煞謧€數和靶點個數（去重）

表3 通塞顆粒治療AECOPD 的活性成分名稱

4.2 AECOPD 疾病靶點收集將從各數據庫檢索AECOPD 英文全稱獲取的疾病相關靶點與通塞顆粒的預測靶點結合，基于微生信在線生物學分析、可視化平臺制圖分析。數據庫疾病靶點個數：GeneCard 數據庫1 993 個，OMIM 數據庫173 個，DrugBank 數據庫42 個，DisGeNET 數據庫63 個，MalaCards 數據庫97 個，見圖2。通塞顆粒與AECOPD 的交集靶點共200 個，見圖3。

圖2 AECOPD 疾病相關靶點Venn 圖

圖3 通塞顆粒-AECOPD 靶點交集Venn 圖

4.3 通塞顆?；钚猿煞峙cAECOPD 交集靶點網絡構建使用Cytoscape 3.8.1 軟件構建通塞顆粒的活性成分與AECOPD 交集靶點的關系網絡圖（見圖4）。在網絡中通過degree 值和betweenness 值篩選得到前5 名關鍵活性成分，分別為槲皮素、芹菜素、木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇，見表4。

表4 關鍵活性成分篩選

圖4 通塞顆?；钚猿煞?AECOPD 交集靶點網絡圖

4.4 核心靶點篩選將從STRING 數據庫篩選得到的162 個交集靶點信息導入Cytoscape 3.8.1 軟件進行處理，其PPI 關系見圖5。將靶點根據degree 值和betweenness 值的大小進行排列，最終篩選得到前6 名核心靶點，分別為TP53、MAPK3、MAPK1、RELA 原癌基因（RELA）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）、腫瘤壞死因子（TNF），見表5。

表5 核心靶點篩選

圖5 中藥-疾病共同靶點PPI 網絡圖

4.5 GO 富集分析及KEGG 通路富集分析將交集靶點進行GO 富集分析和KEGG 通路富集分析。GO富集分析：將“P-value＜0.05、Q-value＜0.05”作為篩選條件，得到總條目2 883 個，其中生物過程（BP）2 566 條，細胞組成（CC）108 條，分子功能（MF）209條，每組選取前10 條生成可視化三合一柱狀圖，見圖6。

圖6 GO 富集分析柱狀圖

KEGG 通路富集分析：關鍵靶點富集在178 條通路上，根據P值和Q值排序，選取前30 條繪制柱狀圖，見圖7。查閱文獻并結合P值和Q值，篩選出與AECOPD 密切相關的TNF、IL-17、MAPK、NF-κB、磷脂酰肌醇3-激酶（P13K）-AKT、缺氧誘導因子1（HIF-1）通路，見圖8。

圖8 交集靶點-信號通路圖

4.6 分子對接將關鍵活性成分槲皮素、芹菜素、木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇與核心靶點TP53、MAPK3、MAPK1、RELA、AKT1、TNF 進行分子對接。結合能（Binding energy）體現配體與受體之間結合的可能性，能值越低表示配體與受體之間親和力越高，構象越穩定，在自然狀態下更易結合。結合能＜-5.0 kcal/mol 表明有較好的結合活性；結合能＜-7.0 kcal/mol 表明具有強烈的結合活性[9]。結果顯示，對接均具有較好的結合活性，見圖9。具體分子對接見圖10。

圖9 分子對接自由結合能熱圖

圖10 中藥關鍵活性成分與核心靶點對接圖

4.7 動物實驗驗證結果

4.7.1 各組大鼠肺組織病理表現對照組大鼠：支氣管結構基本完整，肺血管壁未見明顯增厚，肺泡結構基本完整，少量散在的炎性細胞浸潤。模型組大鼠：支氣管上皮細胞脫落，杯狀細胞增生，大量炎性細胞浸潤，肺血管壁增厚，肺泡間隔變窄并斷裂，融合成較大的囊腔。中藥組大鼠：支氣管結構的破壞、炎性細胞的浸潤、肺泡間的融合均較用藥前改善，但肺血管壁仍可見明顯增厚。西藥組大鼠：支氣管病理學變化與中藥組相當。聯合組大鼠：支氣管上皮細胞的破壞程度較模型組明顯減輕，肺血管壁輕微增厚，炎性細胞的浸潤及肺泡融合擴張明顯改善，治療效果最好。見圖11。

4.7.2 各組大鼠肺功能指標比較見表6。模型組FVC、FEV0.3、FEV0.3/FVC、PEF 值均較對照組降低（P＜0.05）。中藥組、西藥組以及聯合組的FVC、FEV0.3、PEF 值均較模型組升高（P＜0.05）；聯合組FEV0.3/FVC 值較模型組升高（P＜0.05）。中藥組FVC、FEV0.3、FEV0.3/FVC、PEF 值與西藥組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。聯合組FVC、PEF 值均較中藥組及西藥組升高（P＜0.05）；聯合組FEV0.3較西藥組升高（P＜0.05）。

表6 各組大鼠肺功能指標比較（±s）

注：①與對照組比較，P＜0.05；②與模型組比較，P＜0.05；③與中藥組比較，P＜0.05；④與西藥組比較，P＜0.05

樣本量組 別對照組模型組中藥組西藥組聯合組6 6 6 6 6 FVC（mL）18.03±2.24 10.23±1.40①13.07±1.86①②13.10±1.38①②16.28±0.97②③④FEV0.3（mL）17.13±1.96 9.16±1.40①12.83±1.98①②12.47±1.46①②14.71±1.80①②④FEV0.3/FVC（%）95.55±1.01 85.08±1.61①90.77±4.03 90.44±5.94 93.50±2.82②PEF（mL/s）92.10±2.77 71.59±1.19①81.19±0.89①②80.96±1.05①②86.94±0.80①②③④

4.7.3 各組大鼠血清TNF-α、IL-17 含量比較見表7。模型組、中藥組、西藥組、聯合組的血清TNF-α、IL-17 含量均高于對照組（P＜0.05）；中藥組、西藥組及聯合組的TNF-α、IL-17 含量均低于模型組（P＜0.05）；聯合組血清TNF-α、IL-17 含量均低于中藥組、西藥組（P＜0.05）。中藥組TNF-α 含量高于西藥組（P＜0.05），IL-17 含量低于西藥組（P＜0.05）。

表7 各組大鼠血清TNF-α、IL-17 含量比較（±s） pg/mL

表7 各組大鼠血清TNF-α、IL-17 含量比較（±s） pg/mL

注：①與對照組比較，P＜0.05；②與模型組比較，P＜0.05；③與中藥組比較，P＜0.05；④與西藥組比較，P＜0.05

樣本量組 別對照組模型組中藥組西藥組聯合組6 6 6 6 6 TNF-α 11.84± 1.37 35.63± 0.76①31.26± 0.45①②27.92± 1.42①②③24.50± 1.23①②③④IL-17 17.67± 1.09 44.10± 2.17①23.84± 0.75①②26.29± 0.71①②③21.08± 0.62①②③④

4.7.4 各組大鼠肺組織蛋白表達含量比較見表8、圖12。模型組肺組織P-P65/P65、P-AKT/AKT、P-MAPK1/3/MAPK1/3 和TP53/GAPDH 蛋白表達含量均高于對照組（P＜0.05）；中藥組、西藥組以及聯合組上述蛋白的表達含量均低于模型組（P＜0.05）；聯合組上述蛋白的表達含量均低于中藥組、西藥組（P＜0.05）。注：“P”代表磷酸化，“非P”代表非磷酸化。前者代表該蛋白的磷酸化水平，后者代表該蛋白的含量。因很多信號通路的蛋白在受到刺激后，均是通過其磷酸化水平的改變而引起一系列細胞反應，所以用磷酸化與非磷酸化的比值來體現各組檢測蛋白的實際表達含量。P65、MAPK1/3 及AKT 均是通過磷酸化表達來證明通路的激活，但TP53 不是此類型，所以用TP53 與內參GAPDH 的比值來體現蛋白的表達含量。

表8 各組大鼠肺組織蛋白表達比較（±s）

表8 各組大鼠肺組織蛋白表達比較（±s）

注：①與對照組比較，P＜0.05；②與模型組比較，P＜0.05；③與中藥組比較，P＜0.05；④與西藥組比較，P＜0.05

樣本量組 別對照組模型組中藥組西藥組聯合組6 6 6 6 6 P-AKT/AKT 0.05±0.02 1.01±0.14①0.50±0.15①②0.43±0.12①②0.11±0.04②③④P-MAPK1/3/MAPK1/3 0.18±0.10 0.98±0.20①0.57±0.30①②0.54±0.16①②0.36±0.11②P-P65/P65 0.08±0.36 1.59±0.34①0.88±0.23①②1.02±0.24①②0.37±0.24①②③④TP53/GAPDH 0.09±0.01 1.41±0.03①0.92±0.12①②0.42±0.03①②③0.29±0.02①②③④

圖12 各組大鼠肺組織中相關蛋白條帶圖

5 討論

本研究通過網絡藥理學對通塞顆粒治療AECOPD 的作用機制進行了分析，并進行了動物實驗驗證。動物實驗病理學及肺功能檢測結果顯示通塞顆?？捎行Ц纳艫ECOPD 肺泡融合、血管壁增厚，減輕肺損傷并有助于恢復呼吸功能。

網絡藥理學研究結果顯示，通塞顆粒的關鍵活性成分是槲皮素、山柰酚、芹菜素、木犀草素和β-谷甾醇，除β-谷甾醇外，其余成分均為天然黃酮。黃酮類化合物具有抗氧化、抗炎、抗菌、調節免疫等藥理作用，而抗炎、抗氧化特性使其成為治療肺部炎癥疾病的潛在藥物[10]。有研究表明，槲皮素能通過抑制磷酸二酯酶4（PED-4）、激活cAMP/PKA 信號通路，抑制NF-κB 活化，并可有效減輕氣道炎癥[11-12]；在COPD 鼠體模型中，槲皮素可顯著降低TNF-α 表達水平，抑制肺泡細胞凋亡，減少肺部損傷，預防COPD 的急性加重[13]。Chung MJ 等[14]通過實驗證明，山奈酚可以顯著減少哮喘模型小鼠肺泡灌洗液中的炎癥細胞數量，改善肺泡充血及氣道壁增厚等急性肺損傷的病理特征；另外，山奈酚還可通過調節Nrf2 和NF-κB 信號通路來減少氧化應激、炎癥和細胞凋亡[15]。木犀草素可以通過抑制內毒素刺激導致的巨噬細胞磷酸化，降低IL-6 等炎癥因子的表達水平，提高肺血管通透性，減輕COPD 患者的肺水腫癥狀，改善肺功能[16-17]。芹菜素碳苷可通過抑制TLR4/瞬時受體電位通道蛋白6（TRPC6）信號通路的激活，減輕脂多糖（LPS）誘導的BALB/c 小鼠急性肺損傷模型的肺部炎癥和免疫毒性[18]。β-谷甾醇是一種天然甾醇，臨床上應用以它為主要成分的中藥球蘭治療呼吸道疾病有很好的消炎作用[19]；有實驗證明，β-谷甾醇可通過下調硫氧還蛋白（Trx）/硫氧還蛋白-1（Trx1）激活TP53 表達，誘導A549 肺癌細胞的凋亡，起到抗癌作用[20]。

通過中藥-疾疾共同靶點PPI 網絡圖發現，通塞顆粒治療AECOPD 的核心靶點涉及TP53、MAPK1、MAPK3、TNF、AKT1、RELA。TP53 是人體重要的抑癌因子，其功能為調控細胞增殖和凋亡[21]；目前有研究已證實TP53 可通過外源性和內源性凋亡途徑，調控細胞凋亡[22]；TP53 能通過下調B 淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）及上調細胞凋亡促進基因Bax 的表達水平來促進細胞凋亡過程[23]；TP53 抑制劑可有效減少COPD大鼠肺泡上皮細胞的凋亡，減輕肺組織損傷[24-25]。MAPK 作為一種絲裂原活化蛋白激酶，負責在細胞內傳遞信號，參與多種炎癥細胞因子和應激信號的傳導[26]；MAPK1、MAPK3 均屬于MAPK 家族，可以通過介導炎癥、免疫應答、氣道結構、細胞反應等途徑參與哮喘和COPD 的發生與發展[27-29]。文獻[30]報道MAPK1、MAPK3 的激活可以抑制細胞凋亡。有研究結果顯示，香煙煙霧提取物（cCSE）誘導的A549 肺癌細胞MAPK1、MAPK3 磷酸化水平顯著升高，并且增加了肺泡上皮細胞的凋亡[31]。RELA 是NF-κB 家族的重要成員，RELA/p65 具有激活NF-κB 轉錄的功能，當NF-κB 被激活，將出現核轉位過程，結合于相關基因上游的轉錄活性調控元件，促進相關基因mRNA 的轉錄，誘導對應分子的表達[32-33]。近年越來越多的研究表明，通過對RELA/P65 翻譯后修飾可以對NF-κB 通路進行精準和復雜的調控[34]。臨床研究表明，抑制RELA/P65 的過度活化可以減輕COPD 患者的氣道炎癥反應，改善肺功能和血氣指標[35]。本研究的GO 富集分析結果顯示，通塞顆?？赡芡ㄟ^調控LPS 反應、氧化應激反應、絲/蘇氨酸蛋白激酶復合物、轉錄因子活性、DNA-轉錄因子結合等BP 而發揮治療AECOPD 的功效。KEGG 通路富集分析結果表明，通塞顆粒治療AECOPD 主要涉及TNF、IL-17、MAPK、NF-κB、P13K、HIF-1 等多條信號通路。TNF 信號通路是COPD 疾病病理過程中的關鍵通路，參與多種信號轉導，主要通過上調MAPK、ERK、NF-κB 等信號通路來誘導細胞凋亡及促進炎癥反應[36]。TNF 信號通路通過釋放TNF-α 等促炎因子，產生大量炎性介質，促進氣道炎性浸潤，增加血管通透性，形成肺水腫，加重肺損傷[37-38]。有研究證實，TNF-α 廣泛存在于COPD 患者的肺組織中，其升高會引起炎性介質的瀑布樣連鎖反應，從而加重COPD 的病情發展[39-40]。輔助性T 細胞17（Th17）是人類輔助性T 細胞分化出的一類細胞亞群，主要通過分泌IL-17A 導致炎性因子釋放，促使氣道黏液腺分泌大量黏液，與肺氣腫的形成、氣流阻塞密切相關[41]。有研究發現，IL-17 可誘導中性粒細胞的募集，增加COPD 患者支氣管上皮細胞細胞間黏附分子-1（ICAM-1）的表達，增強ICAM-1 的黏附作用，并加劇氣道炎癥反應[42-43]。HIF-1 信號通路在細胞代謝、氧化應激、損傷修復等環節中發揮重要作用[44]；其由HIF-1α 和HIF-1β 兩種亞基組成異源二聚體，HIF-1α 是內源性保護機制的始動因子，也是P13KAKT 信號通路的下游因子[45]。COPD 患者普遍存在缺氧的臨床表現，在缺氧條件下，P13K-AKT 通路被激活，AKT 活化，下游蛋白mTOR 磷酸化，促使HIF-1α蛋白合成，以應對低氧環境，改善氣道缺血、缺氧狀態[46]。在PI3K-AKT 經典信號通路中，AKT 是處于PI3K 下游的關鍵蛋白，在激活后，可以通過各種下游因子的磷酸化來進行細胞調控[47]；該通路上調會激活NF-κB 上游抑制蛋白κB 抑制因子激酶（IKK）及NF-κB 抑制蛋白（IKB），使后者被泛素化降解，繼而激活NF-κB 信號通路，引起TNF-α 和IL-17 等多種炎癥因子的釋放[48-49]。另外，NF-κB 信號通路通過調節呼吸道細胞因子活性，增強促炎分子分泌，從而加重COPD[50]。因此許多藥物通過抑制NF-κB 信號通路的轉導，從而起到抗炎作用，延緩COPD 的發展[51-52]。本研究動物實驗驗證結果顯示，通塞顆?？捎行抡{TP53、P-P65、P-AKT、P-MAPK1/3 蛋白表達，減輕炎癥反應和氧化應激反應，減少細胞凋亡，起到保護肺黏膜的作用。

綜上所述，通塞顆粒治療AECOPD 是一個涉及多成分、多靶點、多通路的過程。動物實驗驗證結果顯示相較于模型組，通塞顆?？娠@著下調網絡藥理學中篩選出的核心靶點蛋白表達，減輕炎癥反應，緩解肺損傷，起到治療AECOPD 的功效。本研究系統地闡釋了通塞顆粒治療AECOPD 的潛在活性成分、核心靶點以及相關通路，為后續深入驗證和探討通塞顆粒治療AECOPD 的分子機制提供了基礎和思路。