轉基因小鼠源性胰腺癌原位移植瘤模型的構建與評價

安慶玲，譚鄧旭，趙亞，張彩勤，師長宏

（空軍軍醫大學實驗動物中心，西安 710032）

胰腺癌是惡性程度最高的腫瘤之一，早診率低、進展快、預后差，患者5 年生存率僅為12%[1-4]。既往首選手術治療，但僅20%患者可手術，且術后復發率高[5]。 很多患者對放療不敏感，化療易產生耐藥，同樣收效甚微，這可能與胰腺癌致密的基質環境和獨特的免疫浸潤有關[6-8]。 這些基質成分不僅阻滯化療藥物的浸潤，還能增加腫瘤細胞的活性、塑造免疫抑制微環境，促進腫瘤發生發展[9-12]。建立穩定可靠且能夠模擬胰腺癌患者的腫瘤基質與免疫微環境的藥物臨床前研究動物模型[13-15]，對于研究胰腺癌的發病機制，探索更加有效的治療方案至關重要。

目前胰腺癌動物模型包括化學誘導模型、移植瘤模型和基因工程模型。 化學誘導模型個體差異大，治療窗口期較短；移植瘤模型缺乏豐富的基質環境和免疫細胞浸潤；基因工程模型能夠模擬患者胰腺癌的遺傳改變，塑造胰腺癌復雜的基質成分和免疫微環境，是研究胰腺癌發生、進展，篩選治療策略的理想動物模型[16]。LSL-KrasG12D／＋LSLTrp53R172H／＋Pdx1-Cre（KPC）轉基因小鼠是研究胰腺癌最常用的自發轉基因小鼠模型，其原癌基因LSLKrasG12D／＋在胰腺上特異性活化，抑癌基因LSLTrp53R172H／＋在胰腺被特異性抑制，從而誘導胰腺癌的發生。 但是，該小鼠模型自發腫瘤周期長，腫瘤異質性高，成瘤時間不穩定，組內腫瘤一致性較差[17-18]。 為了克服KPC 小鼠的缺點，擴大其在胰腺癌藥物臨床前研究中的應用，嘗試將其自發性胰腺癌腫瘤組織塊移植到C57BL／6J 小鼠胰尾，完善造模方法和評價技術，從而獲得批量、均一且穩定生長的原位模型，以模擬更加貼合臨床特征的胰腺癌微環境和穩定的胰腺癌進展過程，促進胰腺癌發病機制、預防措施和治療方案的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

2 只SPF 級雄性LSL-KrasG12D／＋LSL-Trp53R172H／＋（KP）小鼠、2 只SPF 級雌性Pdx1-Cre小鼠和66 只SPF 級雄性C57BL／6J 小鼠，6 ～8 周齡，18 ～22 g，均購自江蘇集萃藥康生物科技有限公司【SCXK（蘇）2023-0009】，飼養在空軍軍醫大學實驗動物中心SPF 級屏障設施內【SYXK（陜）2019-001】。 環境溫度23 ～25 ℃，相對濕度40% ～60%，12 h 晝夜交替，小鼠籠盒、墊料、飼料及飲用水等經高溫高壓滅菌處理，動物自由攝食和飲水。 本動物實驗獲得空軍軍醫大學實驗動物福利及倫理委員會批準（IACUC-20220830）。

1.1.2 主要試劑與儀器

DMEM 培養基、 胎牛血清（Gibco）， DMSO（Sigma，D2650），兔源Ki67 抗體（Abcam，ab16667），鼠源α-SMA 抗體（Servicebio，GB13044），兔源CD45抗體（proteintech，20103-1-AP），鼠源CD206 抗體（proteintech，60143-1-lg），Cy3 標記山羊抗兔IgG（GB21303-100UL）， Cy3 標記山羊抗小鼠 IgG（GB21301-100UL），DAPI（Leagene，DA002），甘油明膠（Solarbio， S2150）。 彩色多普勒超聲系統（Mindray，ZS3 SCI），光學顯微鏡（OLYMPUS，BX43）用于HE 染色拍攝，Image J 1.8.0 軟件進行半定量分析，激光掃描共聚焦顯微鏡（ZEISS，LSM 900）用于免疫熒光染色拍攝和分析。

1.2 方法

1.2.1 原位模型構建以及腫瘤組織的凍存與復蘇

將KP 小鼠與Pdx1-Cre小鼠合籠進行交配，新生的小鼠經瓊脂糖凝膠電泳鑒定基因篩選得到KPC 小鼠。 選擇自發胰腺癌的KPC 小鼠作為移植供體，于狀態明顯較差、臨近仁慈終點的時候進行安樂死，在無菌條件下取出胰腺原發腫瘤，該腫瘤組織為P0 代（Passage 0）。 將P0 代原發胰腺癌組織快速轉移至4 ℃的DMEM 培養液中，去除壞死部分，選擇質地均勻的腫瘤部分修剪成2 mm × 2 mm× 2 mm 大小一致的組織塊，用于后續移植或凍存。將10 只6 ～8 周齡的C57BL／6J 小鼠作為移植受體，用戊巴比妥鈉按照30 mg／kg 劑量進行麻醉，左側腹部剃毛后，采用無菌操作進行手術，用縫合線將胰腺癌組織塊縫合到胰尾，術后將小鼠放置37 ℃保溫毯上直至蘇醒。 將剩余部分P0 代腫瘤組織塊置入含有90%胎牛血清與10% DMSO 的1.5 mL 凍存管內，梯度降溫后液氮保存。 復蘇時，從液氮拿出凍存管迅速置于37 ℃水浴鍋中復溫，DMEM培養液清洗腫瘤組織去掉殘留凍存液后將組織塊移植于36 只C57BL／6J 小鼠的胰尾，驗證腫瘤復蘇成功率。

1.2.2 超聲監測

手術完成后，每2 ～3 d 用彩色多普勒超聲對腫瘤的生長情況進行監測，于腫瘤體積800 ～1000 mm3結束觀察并對其進行安樂死，收集胰腺腫瘤、腸、腹膜、脾、腎、肝和肺置于4%多聚甲醛中性固定液中，石蠟包埋后切片。

1.2.3 HE 染色

石蠟切片二甲苯脫蠟，100%、90%、80%、70%乙醇各5 min 覆水，蘇木精染色5 min，乙酸分化2 s，促藍液返藍1 min，伊紅染色5 min，70% ～95%梯度乙醇脫水各5 min，浸泡二甲苯后用中性樹脂封片，顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4 免疫熒光染色

石蠟切片二甲苯脫蠟，100%、90%、80%、70%乙醇各5 min 覆水，檸檬酸鈉緩沖液抗原修復，2%BSA 封閉非特異性抗原表位1 h，4 ℃過夜孵育一抗，次日常溫避光孵育熒光標記的二抗2 h，DAPI 復染細胞核10 min，甘油明膠封片，應用激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照。

1.3 統計學分析

使用SPSS 21.0 軟件對數據進行統計學分析，Graphpad Prism 8.0 軟件進行圖片制作，以平均值±標準差（±s）表示。 多組間比較采用單因素方差分析進行組間差異性分析，用Tukey’s 檢驗進行多重比較，生存率用Log-rank test 檢驗比較與無癥狀小鼠的指標差異，P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 KPC 小鼠自發胰腺癌情況

將KP 小鼠與Pdx1-Cre小鼠合籠進行交配，新生的小鼠經瓊脂糖凝膠電泳鑒定基因篩選得到24只KPC 小鼠（圖1A）。 在飼養過程中密切關注KPC小鼠的狀態，當出現體重下降、行動遲緩、精神萎靡或者腹部異常腫大時，通過體外無創超聲監測技術觀察其自發胰腺癌的情況（圖1B）。 KPC 小鼠體重下降10%或者自發腫瘤體積達到800 ～1000 mm3，判斷為仁慈終點，通過解剖再次確認KPC 小鼠自發胰腺癌的情況，其中4 只（16.66%）KPC 小鼠自發胰腺癌，平均壽命124.5 d；10 只（41.67%）KPC 小鼠自發皮下肉瘤，多發生在四肢，由于肉瘤發生較早，進展迅速，腫瘤負荷比較大，這類小鼠生存期最短，平均壽命92.5 d；其余10 只（41.67%）KPC 小鼠沒有觀察到明確的自發胰腺腫瘤和皮下肉瘤，平均壽命169.9 d（圖1C ～1E）。 KPC 小鼠自發胰腺癌組織的HE 染色結果顯示，腫瘤細胞呈無序排列，具有中等分化的導管樣結構，間質成分豐富，富含膠原蛋白和各種免疫細胞。

2.2 組織塊原位移植瘤模型構建

選擇C57BL／6J 小鼠作為移植受體，將KPC 小鼠自發胰腺癌組織塊移植到受體小鼠的胰尾，具體操作同方法“1.2.1”（圖2A，2B）。 移植后，觀察2～3 周，并通過體外無創超聲技術監測移植腫瘤的生長速度（圖2C），繪制生長曲線，結果顯示，移植術后6 d 瘤體增長速度明顯加快。 KPC1 在移植17 d 時，瘤體體積在（621.4 ± 180.9）mm3，KPC2 在移植13 d 時，瘤體體積在（744.9 ± 107.1）mm3，KPC3 在移植13 d 時，瘤體體積在（800.6 ± 142.9）mm3（圖2D）。 表明這種方法構建的轉基因小鼠源性胰腺癌組織塊原位移植瘤具有穩定增殖能力。將凍存復蘇后的腫瘤組織塊移植于36 只C57BL／6J小鼠胰尾，其中35 只小鼠成功生長胰腺癌，腫瘤組織塊凍存后復蘇成功率高達97.22%。

2.3 模型評價

2.3.1 模型病理學特征穩定性的評價

腫瘤傳代的病理學穩定性對于腫瘤研究具有重要意義，是評價腫瘤模型可靠性和可重復性的關鍵因素。 為驗證轉基因小鼠源性胰腺癌組織塊原位移植瘤的移植穩定性，將其進行傳代移植，在連續傳代4 次后，取正常胰腺、P0 代原發胰腺癌組織和不同傳代次數的原位移植瘤組織進行HE 染色，結果顯示傳代4 次后，KPC 小鼠P4 代原位移植瘤組織仍能保持其導管樣腺體瘤形態，間質成分豐富，與P0 代原發胰腺癌組織形態一致，說明該模型能穩定地保留原發胰腺癌病理學特征（圖3A）。

2.3.2 模型微環境相似性的評價

胰腺癌擁有復雜的微環境，包括致密的基質環境和獨特的免疫浸潤情況。 為了驗證該模型的基質和免疫浸潤情況，選擇傳代4 次的P4 代原位移植瘤組織和P0 代原發胰腺癌組織及正常胰腺組織進行對比。 首先，采用Ki67 和α-SMA 分別作為腫瘤增殖和基質纖維化的指標，通過免疫熒光染色技術分析其基質情況。 結果顯示，第4 代原位移植瘤組織的增殖和纖維化程度相較于正常胰腺組織均明顯升高，原位移植瘤組織的增殖和纖維化程度相較于KPC P0 代自發原位胰腺癌組織也有升高，Ki67陽性面積分別為（2.7500 ± 0.0841）%vs.（1.2730± 0.1652）%，α-SMA 陽性面積分別為（3.3110 ±0.3585）%vs.（2.2000 ± 0.1394）%，這說明原位移植瘤傳代保持病理學特征的同時，還可以將其增殖能力和間質特征擴大（圖3B）。 免疫熒光結果表明，正常胰腺組織、P0 代原發胰腺癌組織、第4 代原位移植瘤組織，均可發現不同程度的CD45 陽性免疫細胞和CD206 陽性免疫抑制細胞浸潤，且與正常胰腺組織相比，P0 代原發胰腺癌和第4 代原位移植瘤組織的免疫細胞浸潤數量更多（圖3C）。 這說明該模型既能模擬胰腺癌的進展過程，也能真實地反映基質和免疫系統在胰腺癌進展過程中的作用。

2.3.3 模型腫瘤轉移能力的評價

轉移的發生一直是腫瘤學研究的熱點，是腫瘤治療失敗和預后惡化的主要原因之一，構建具有腫瘤轉移能力的藥物臨床前研究的動物模型對于揭示腫瘤轉移機制和患者預后至關重要。 本研究構建的模型在仁慈終點還發生了廣泛的侵襲轉移，可以直接在腹膜、脾和腸道觀察到腫瘤包塊（圖4A）。HE 染色及統計學分析結果顯示，該原位胰腺癌模型96.67%發生腸轉移，93.33%發生腹膜轉移，76.67%發生脾轉移，20%發生肺轉移（圖4B）。 另外，雖然腎和肝沒有發生明顯的腫瘤細胞轉移病灶，但是觀察到腎小球數量增多、體積增大，少數肝細胞發生壞死，凋亡小體增多（圖4C）。 因此，該模型可以作為研究胰腺癌轉移機制及預防治療方案的藥物臨床前研究的動物模型。

3 討論

胰腺癌基因工程小鼠模型能夠反應胰腺癌患者遺傳物質變化情況，完整地模擬了胰腺癌的發生與進展過程，富含豐富的腫瘤基質成分和免疫微環境，是研究胰腺癌最理想的動物模型[19]。 但是其造模周期長，胰腺癌自發時間不能預測，發生比例低，且不同個體自發的胰腺癌異質性強，同一時期獲得足夠實驗的動物數量需要很多時間和經濟成本，從而限制了應用[20]。

在自發胰腺癌KPC 小鼠的基礎上，將腫瘤組織去除壞死部分，選擇質地均勻的腫瘤部分修剪成大小一致的組織塊，移植到野生的C57BL／6J 小鼠的胰尾，構建了基于KPC 自發胰腺癌腫瘤的原位移植瘤模型。 選擇Ki67 作為腫瘤增殖指標，α-SMA 作為纖維化指標，評價胰腺癌的基質情況；CD45 作為免疫細胞標志物，CD206 作為免疫抑制細胞標記物，評價胰腺癌免疫細胞浸潤情況[21-22]。 通過免疫熒光染色分析，該模型能夠穩定的模擬并且遺傳胰腺癌的導管腺瘤形態，具有良好的增殖能力，擁有與患者相似的纖維環境和免疫細胞浸潤。 采用這種造模方式可以快速、大規模的進行胰腺癌相關研究。 為防止體內連續傳代導致腫瘤生物學特征發生變化，選擇將低代次（P0、P1 代）的腫瘤組織進行冷凍保存，復蘇后原位移植成功率高達97.22%。除此之外，發現該模型中，胰腺癌能夠轉移到腸、腹膜等多器官，這與臨床上胰腺癌發生轉移的部位和病理特征相似，所以可以作為研究胰腺癌轉移機制的優質模型。

實驗過程中，需要有效的技術手段監測原位腫瘤的動態生長情況。 在本研究主要用到腹部超聲動態監測了該模型的生長情況并繪制了腫瘤生長曲線。 超聲波技術是一種無創、無輻射的方法，可以用來檢測胰腺腫塊，并評估其性質（囊實性、實質性）[23]。 為了獲取清晰可靠的實驗數據，在進行超聲檢查之前，需要對實驗動物進行隔夜禁食，以減少胃腸蠕動對胰腺的干擾。 次日將造模小鼠呈仰臥位放置，沿腹主動脈橫切掃查，以脾和腎的解剖位置輔助判斷胰腺的大體位置，彩色多普勒成像顯示血流，少血供、低回聲區域即為胰腺腫瘤區域，通過計算獲取胰腺腫瘤的體積大小。 盡管胰腺腫瘤超聲檢查的敏感性高度依賴于操作者的經驗和疾病進展的程度，但其檢查結果比較準確，能夠作為胰腺腫瘤原位實驗動物模型的影像診斷工具[24]。

構建轉基因小鼠源性胰腺癌組織塊原位移植瘤模型的優勢在于其易于操作、成本相對較低，且腫瘤與人胰腺癌具有較高的生物相似性。 此外，這種模型可以更好地模擬腫瘤在體內生長和發展的過程，并為新藥物的篩選提供可靠的動物模型[25]。然而，該模型也存在一些限制。 首先，該模型仍然是以小鼠作為宿主，而并非完全模擬人類的生理環境。 其次，這種模型對于特定基因突變類型的胰腺癌可能并不適用，因為不同的基因突變可能產生不同的生物學行為和病理學特征[26-27]。

綜上所述，轉基因小鼠源性胰腺癌組織塊原位移植瘤模型是一種可行的模型，可以用于研究胰腺癌的發生機制和治療方法的評估。 通過對模型的構建與評價，可以更好地了解胰腺癌的發展過程，并為治療策略的研究提供有效的平臺。