木糖葡萄球菌實時熒光定量PCR 檢測方法的建立及其應用

于靈芝，馮麗萍，孔志豪，朱琦，魏曉鋒

（上海實驗動物研究中心，上海 201203）

木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus，S.xylosus）是一種凝固酶陰性革蘭氏陽性葡萄球菌，由其引起實驗動物尤其是免疫缺陷小鼠感染的報道逐年增多。 木糖葡萄球菌在SPF 級C57BL／6 小鼠皮膚上被發現是一種共生細菌[1]，會導致沙鼠的鼻腔皮炎[2]，能促進肝纖維化小鼠模型的肝纖維化和細菌移位[3]。 無胸腺裸鼠自發性感染木糖葡萄球菌表現為彌漫性鱗屑性皮炎[4]，經木糖葡萄球菌誘導的燙傷性皮炎表現為顯著的真皮炎癥[5-6]。NADPH 氧化酶缺陷的小鼠通常被用作慢性肉芽腫疾病的模型，對木糖葡萄球菌的易感性增加，表現為皮炎和膿腫[7-10]。 NOS2 在宿主防御多種微生物中起著重要作用，因此，NOS2 基因敲除小鼠通常對木糖葡萄球菌感染沒有反應，表現出伴有表皮潰瘍的肉芽腫性皮炎，在這些小鼠皮膚中分離并鑒定到了木糖葡萄球菌，因此，作者認為，木糖葡萄球菌是NOS2 基因敲除小鼠的潛在機會性病原體[11-14]。

木糖葡萄球菌感染免疫缺陷或基因工程小鼠出現皮屑、脫毛、膿腫和皮炎等，嚴重影響實驗動物質量及實驗結果。 免疫缺陷或基因工程動物作為疾病研究的重要工具，研發和使用數量逐年增強，對其進行木糖葡萄球菌的監測尤為重要。 木糖葡萄球菌尚未被列入我國實驗動物國家標準檢測體系中，而其他國家的一些實驗動物生產和使用單位已將其列為檢測項目[15]。

目前團體標準對木糖葡萄球菌的檢測采用細菌培養及生化鑒定的方法[15]，耗時長，操作復雜。因此，有必要開發一種靈敏特異快速的檢測方法。qPCR 方法兼具快速、特異性強和靈敏度高的優勢，在醫學檢測領域已被廣泛推廣和應用，但用該方法檢測木糖葡萄球菌的方法未見報道。 本研究采用gehM基因片段作為靶標，建立了檢測木糖葡萄球菌的qPCR 方法，并將其應用于臨床樣本的檢測，旨在監測免疫缺陷小鼠木糖葡萄球菌的攜帶狀態，并對其進行控制，對保障研究結果的準確性和科學性至關重要。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

標準菌株包括木糖葡萄球菌（ATCC29971）、表皮葡萄球菌（CMCC26069）、 嗜肺巴斯德桿菌（ATCC35149）、支氣管鮑特桿菌（ATCC14065）、沙門氏菌（CMCC50115）、綠膿桿菌（ATCC27853）、金黃色葡萄球菌（ATCC6538）、腐生葡萄球菌（ATCC BAA-750）和肺炎克雷伯桿菌（CMCC46117），由本實驗室購買保存。 頭狀葡萄球菌（23041070-1）、松鼠葡萄球菌（23041070-b）、 松鼠葡萄球菌（23041905-b）、松鼠葡萄球菌（23041070-5a）和科氏葡萄球菌（22101015-2-3）由本實驗室分離并保存。

1.1.2 主要試劑與儀器

TB Green ? Premix Ex TaqTMⅡ（ 批號：AM43086A）（日本TaKaRa 公司）；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；磁珠法核酸提取試劑（批號：20221020）（麥諾迪生物科技有限公司）；Nanodrop（型號：ND-1000）（美國Nanodrop 公司）。熒光定量PCR 儀（型號：CFX Opus 96）（美國Bio-Rad 公司）；全自動核酸純化儀（型號：Purifier 32）（麥諾迪（上海）生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 引物合成

本文選用GenBank（登錄號：AF208229.1）中登錄的特異性gehM基因片段的引物組序列[16-17]，并通過NCBI 比對確認引物的特異性。 上下游引物序列分別為gehM-F：5’-GTAGAAAAAGCGAATGAA CAAC-3’，gehM-R： 5’-CCTGGTTGCCAATCTTTA TATAC-3’。

1.2.2 DNA 提取

按照核酸提取儀操作說明書及配套提取試劑進行DNA 提取。 對DNA 濃度進行定量，并按梯度稀釋至所需的濃度。

1.2.3 qPCR 檢測體系建立

將提取的DNA 作為反應模板進行qPCR 擴增。陰陽性對照的設計方案同本實驗室已發表的參考文獻[18]。

反應體系：TB Green Premix（2 × ）12.5 μL（終濃度1 × ）、gehM-F（10 μmol／L）1 μL（終濃度0.2 μmol／L）、gehM-R（10 μmol／L）1 μL（終濃度0.2 μmol／L）、模板1 μL、加滅菌水9.5 μL 至25 μL。反應程序為：95 ℃，1 min；（95 ℃，10 s；50 ℃，30 s；72 ℃， 30 s），40 個循環；72 ℃，1 min；熔解曲線。熒光信號收集在50 ℃，30 s 時進行。

1.2.4 特異性實驗

將木糖葡萄球菌和13 種非目的菌加入經培養法確認為陰性的樣本中，陰性樣本包括大、小鼠糞便、皮膚拭子和EAD 拭子樣本，與常規樣本一樣提取DNA，并進行擴增。 以木糖葡萄球菌標準株的DNA 為陽性對照，來判斷本方法是否與其他細菌存在交叉反應，從而對特異性進行驗證。

1.2.5 建立標準曲線及靈敏度實驗

木糖葡萄球菌標準菌液的DNA 濃度按10 倍梯度進行稀釋，從107fg／μL 至1 fg／μL，取模板1 μL進行qPCR 擴增反應。 標準曲線繪制方法和靈敏度分析方法同參考文獻[18]。

1.2.6 重復性實驗

在2 個濃度水平進行重復性實驗，高濃度為106fg／μL， 低濃度為103fg／μL。 對組內和組間進行重復性評估，每個組進行重復檢測6 次，統計所測得的Ct 值，并計算變異系數。

1.2.7 臨床樣本的應用

委托檢驗的大、小鼠不同類型樣本共60 份，包括排風管道粉塵拭子（exhaust air dust， EAD）20 份，皮膚拭子2 份，小鼠糞便20 份，大鼠糞便18 例。 糞便樣本取40 ～50 mg，EAD 拭子和皮膚拭子折斷，然后按“1.2.2”和“1.2.3”操作。

1.2.8 qPCR 產物測序鑒定

測序鑒定方案同參考文獻[18]。

1.2.9 金標準對比實驗

按團體標準T／CALAS 92—2020《實驗動物木糖葡萄球菌檢測方法》對臨床樣本分離培養及鑒定[15]。

2 結果

2.1 特異性結果

特異性實驗結果表明，僅木糖葡萄球菌標準菌株出現典型S 擴增曲線，其他13 種細菌和水均為平直線（圖1）。 即本方法僅能擴增出木糖葡萄球菌，而不能擴增出其他13 種菌。

圖1 木糖葡萄球菌qPCR 特異性檢測結果Note. Red S curve， S.xylosus standard strain. Straight purple lines， Other 13 non-S.xylosus species.Figure 1 Specificity for S.xylosus detected by qPCR

2.2 標準曲線的建立及靈敏度結果

10 倍梯度稀釋后的木糖葡萄球菌標準菌株DNA 樣品進行qPCR。 由圖2 可見，可檢測到100 fg／μL，在107～100 fg／μL 各濃度梯度之間線性關系良好，線性回歸方程為Ct ＝-3.4159 × lg（DNA量） ＋39.281，k 為回歸方程的斜率，擴增效率計算公式為E ＝ 10（-1／k）-1 ＝ 0.9498，即擴增效率為95%，相關系數R2＝0.9892，表明所建方法的擴增效率較高。 本方法的靈敏度為 100 fg／μL 的DNA量（圖2）。

圖2 木糖葡萄球菌qPCR 靈敏度檢測結果Note. Amounts of DNA represented by the curves from left to right， 107 fg／μL， 106 fg／μL， 105 fg／μL， 104 fg／μL， 103 fg／μL and 100 fg／μL.Figure 2 Sensitivity for S.xylosus detected by qPCR

2.3 重復性結果

組內和組間Ct 值的變異系數均小于3%（表1），證明本方法重復性良好，且穩定可靠。

表1 組內和組間重復性結果（Ct 值和CV（%））（n ＝6）Table 1 Repeatability results （Ct and CV（%）） for intragroups and intergroups（n ＝6）

2.4 臨床樣品檢測結果

陰陽性對照均符合結果判定要求，因此，60 份臨床樣本檢測結果均有效。 其中，有5 份樣品擴增曲線呈典型的S 型，可判定木糖葡萄球菌核酸陽性（圖3）。 根據標準曲線，計算出其濃度分別為1798.99、1010.70、428.48、695.89 和590.14 fg／μL。

圖3 木糖葡萄球菌qPCR 的臨床檢測結果Note. Black S curve. Positive control for nucleic acid extraction. Red S curve. Positive control for amplification. Straight purple lines. Negative controls and negative samples. Blue S curves. Positive samples.Figure 3 Clinical detection results for S.xylosus by qPCR detection

2.5 qPCR 產物測序分析

所測陽性樣本的序列經BLAST 進行序列同源性比對，結果顯示，該序列與木糖葡萄球菌的序列同源性為99.63%，表明該樣本木糖葡萄球菌核酸陽性（圖4）。

圖4 qPCR 產物序列BLAST 比對結果Figure 4 Results of the sequence of qPCR product by BLAST

2.6 與金標準的對比實驗

38 例大、小鼠糞便樣本中，qPCR 法與培養法的木糖葡萄球菌陽性檢出例數相同，均為1 例。 20 例EAD 樣本中，qPCR 法的陽性檢出例數為2 例，培養法為1 例。 2 例皮膚拭子樣本的qPCR 法和培養法檢出陽性樣本均為2 例。 qPCR 方法所檢樣本的陽性率為8.3%，培養法得到的陽性率6.7%，qPCR 方法的靈敏度略高于培養法。

3 討論

木糖葡萄球菌被認為是非致病菌，因此，其鑒定方法的研究文獻較少，且主要集中在食品領域。16S rRNA 基因[17]和16S ～23S rRNA 區間序列可以進行木糖葡萄球菌鑒定[19-20]。 RANTSIOU 等[17]利用16S rRNA 基因的V1 ～V3 區可擴增出葡萄球菌屬，再經變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）可鑒定到種。 實驗動物的木糖葡萄球菌可以用16S rRNA基因進行檢測，但文獻中是送到第三方實驗室進行檢測，并未對其性能等進行闡述[21-22]。

MOROT-BIZOT 等[23]報道了基于PCR-RAPD方法進行木糖葡萄球菌的鑒定，該方法特異性良好，缺點是需進行隨機擴增多態性DNA 標記分析，操作繁瑣，需要較長時間出結果。 木糖葡萄球菌編碼酯酶的gehM基因片段，經RNA 點雜交實驗[16]和PCR-DGGE 方法[17]驗證，該片段可特異性地識別木糖葡萄球菌，因此，該gehM基因片段可作為木糖葡萄球菌種屬特異的序列。 經查閱文獻，未檢索到該基因片段檢測木糖葡萄球菌的qPCR 方法。

本研究以木糖葡萄球菌特異性gehM基因片段為靶序列，建立了大、小鼠木糖葡萄球菌qPCR 的檢測方法，并進行了性能評估、臨床應用、測序驗證及與培養法比對等研究。 所建方法只能擴增出木糖葡萄球菌，特異性強；其最低檢測限為100 fg／μL 的DNA 量，靈敏度高；重復性好，均小于3%。 陽性樣本熒光PCR 產物序列與木糖葡萄球菌的基因序列同源性為99.6%，表明該樣本木糖葡萄球菌核酸陽性。

大、小鼠糞便樣本為常規送檢樣本（經與送檢客戶溝通，無皮屑等臨床癥狀，共38 例），其qPCR法與培養法的木糖葡萄球菌陽性檢出例數相同，均為1 例。 EAD-PCR 法（共20 例）的陽性檢出例數為2 例，培養法檢出陽性1 例。 皮膚拭子樣本（嚴重皮屑裸鼠1 例，輕微皮屑裸鼠1 例，共2 例）的qPCR法和培養法檢出陽性樣本均為2 例。 qPCR 方法所檢樣本的陽性率為8.3%，培養法得到的陽性率為6.7%，qPCR 方法的靈敏度高于培養法。 分析EADPCR 培養法陽性檢出率低的可能原因：一是按團體標準[15]進行細菌分離培養時，采用的是劃線法接種的方式，陽性EAD 樣本分離培養的平皿僅出現約2～6 個疑似單菌落，該接種方式可能會導致目標菌漏檢；二是樣本分離培養時，對木糖葡萄球菌的菌落和菌體的符合性判斷經驗不足，可能導致假陰性結果；三是EAD 為排風管道粉塵，細菌在粉塵環境中的存活力與糞便和皮膚環境相比可能較弱，導致EAD 中可培養的活菌相對較少；四是不同的方法學決定了不同的靈敏度，qPCR 的靈敏度優于培養法是有大量文獻支撐的[25-26]。

本研究的局限性之一是非目標菌種和目標菌種的數量都有限，應采用更多的非目標菌種，以更好地驗證檢測結果的特異性，以及采用更多的目標菌種以提高檢測方法的準確性；局限性之二是按團體標準[15]進行細菌分離培養時，采用的是劃線法接種的方式，陽性EAD 樣本分離培養的平皿疑似單菌落個數較少，該方式可能會導致目標菌漏檢，應結合涂布法或傾倒法，以防止假陰性結果。

綜上所述，本研究建立的木糖葡萄球菌qPCR檢測方法，特異性強、靈敏度高、重復性好，結合全自動核酸純化儀提取核酸，可高效快速地得出檢測結果，經臨床樣本測序及方法學比對驗證，可用于實驗動物尤其是免疫缺陷動物木糖葡萄球菌的監測，以保障科研結果的準確性和科學性。