TLR7和TLR8在家畜性控技術中的研究進展

王娜娜,李頎菡,馬 媛,金昊延,胡亞美,馬 云,張令鍇

(寧夏大學動物科技學院 寧夏回族自治區反芻動物分子與細胞育種重點實驗室,銀川 750021)

家畜性別控制技術是通過對家畜正常生殖過程的人為干預,使雌性動物生產出符合人類所期望的性別后代的技術手段,在畜牧生產實踐中有著重要的意義[1-5]。在畜牧生產實踐中,通過家畜的性別控制可極大地加強良種選育的強度,加快育種進程。同時,對特定畜產品的需求往往會導致對動物后代性別控制的需求偏向[6],例如,在實際生產中往往會使雌性家畜充分發揮繁殖和泌乳性能,而雄性家畜發揮其肉用或種用性能,使得公母畜最大限度產生經濟效益[3]。

性控技術主要分為受精前的X/Y精子分離和受精后早期胚胎鑒定兩大類,家畜育種主要聚焦于受精前的X/Y精子分離技術。目前,常用的受精前X/Y精子分離技術主要有離心分離法、免疫學分離法和流式細胞儀分離法等,其中流式細胞儀分離法應用范圍最廣、分離效果最好;常用的受精后早期胚胎性別鑒定主要依靠SRY-PCR 法、免疫學法和細胞遺傳學方法等,其中最常用的是SRY-PCR法[7]。但以上方法在實際應用中均有所限制,Umehara等[8]基于抗原抗體反應報道了新的X/Y精子分離方法——激活TLR7和TLR8受體以分離X/Y精子。將TLR7和TLR8與共同配體R848共孵育,通過抑制糖酵解途徑以降低X精子ATP產生,影響X精子活力,從而分離X/Y精子。目前對該方法的作用機制及應用前景的研究,將為畜產品發展提供巨大的經濟效益。

1 傳統性別控制技術

1.1 受精前X/Y精子分離技術

受精前的性別控制技術基于 X/Y 精子分離技術,在畜牧業發展中起到重要作用。通過受精前的性別控制技術可以大幅提高家畜育種的選擇強度、縮短育種周期,從而提高育種效率。該技術是基于哺乳動物 X/Y 精子的理化差異,利用物理或化學方法使得 X/Y 精子分離[9-12],然后使卵母細胞受精,是目前干預和選擇后代的最直接方法。研究發現,X 精子和 Y 精子之間存在差異,包括體積大小、DNA 含量、游動速度、表面電荷以及耐凍性[13]。早期的精子分離方法大多以 X/Y 精子之間存在的物理差異——精子的密度、形態、大小、活力、質量、表面電荷等特性為依據進行分離,這類方法缺乏試驗的可靠性和重復性,未能在生產上得到有效推廣和應用[14]。近年來,隨著精子差異蛋白的深入研究,流式細胞儀分離技術成為目前最為成熟和科學可靠的精子分離方法[15]。此外,利用 CRISPR-Cas9基因編輯系統對精子進行改造,實現 X/Y 精子分離的研究也不斷涌現[16-17]。雖然這些技術還需要進一步完善和驗證,但它們具有非常大的應用潛力,有望推動受精前性別控制技術的進一步發展和應用。

1.1.1 離心分離法 研究表明,哺乳動物 X/Y 精子的DNA含量不同,如牛、馬、羊、豬等的X精子染色體DNA含量分別比Y精子高3.8%、4.1%、4.2%、3.6%,X精子染色體DNA含量高于Y精子,使得X精子的密度及重量大于Y精子,在離心時X精子的沉降速度比Y精子快,從而使X精子和Y精子得到有效的分離[18]。曹世禎等[19]通過Percoll溶液將人的精液進行離心,獲得了純度高達90% 以上的X精子。除此之外,曹世禎等[19]還利用該方法處理牛的精液,所得后代中雌性動物比例超過50% 。使用該方法分離X/Y精子的操作時間短,對精子的損害小,但是分離X/Y精子缺乏重復性,其中的原因有待進一步研究。

1.1.2 免疫學分離法 X/Y精子免疫學分離的關鍵是挖掘X 精子和Y精子的根本差異,X/Y精子基因差異表達會導致兩類精子表型發生變化,從而將二者進行分離。X染色體上存在大量蛋白質編碼基因,基因密度約為所有常染色體平均值的一半,大多數為編碼拷貝基因。相比之下,Y染色體只保留了常染色體3%的基因,且Y染色體上的雄性特異區域MSR共包含156個轉錄本,幾乎所有基因都與睪丸發育和精子形成有關。X/Y染色體的特異基因構成了 X/Y 兩類精子間蛋白表達差異的遺傳基礎,從而利用X/Y精子的蛋白表達差異分離出X/Y精子[20]。

H-Y抗原是哺乳動物中最早發現的雄性特異性組織相容性抗原,免疫學分離法(immunomagnetic method)是利用H-Y抗體檢測Y精子質膜上存在的H-Y型抗原(histocompatibility-y-antigen),根據抗原抗體反應來分離家畜的X精子和Y精子[21],再選擇X精子或Y精子進行人工授精從而得到所需性別后代的方法[14]?；谝陨显?羅承浩等[22]應用生殖免疫技術制作性別化冷凍精液,配種受胎試驗結果表明,性別化冷凍精液與正常凍精情期受胎率相似,且奶牛產母犢率可達60.7%。雖然利用此方法分離 X/Y 精子效率較高,但需要制備高效價的 H-Y抗體,且經處理后的精子數目少、活力低,在實際生產中很難得到廣泛應用[23]。SRY基因位于Y染色體短臂(Yp)上,是目前公認的睪丸決定因子,在哺乳動物的性別決定中至關重要[24]。為降低免疫分離方法的應用成本,李蓉和華松[3]通過單克隆抗體技術制作針對關中奶山羊SRY的抗體,制備負載SRY抗體的磷酸鈣納米顆粒,注射到性成熟前的雄性羔羊的睪丸,阻礙Y精子的成熟分化,在體成熟后進行采精,通過離心去除Y精子,能得到高比例的X精子。該技術具有低成本、簡便、快速、易操作等優勢,有望在將來取代流式細胞儀分選法,廣泛應用于家畜生產。

1.1.3 流式細胞儀分選法 研究表明,哺乳動物X精子的DNA含量高于Y精子。Hochest33342作為一種廣泛應用于核酸染色的熒光染料,可以通過與細胞或精子中的DNA結合,在熒光顯微鏡下觀察到細胞核的形態和數量。在細胞活體染色的應用中,Hoechst 33342也被稱為“活染劑”。其結合原理是通過靜電相互作用和氫鍵相互作用與DNA中的GC互補堿基對結合。將Hochest33342與精子核DNA 結合后,會發出藍色的熒光信號,捕捉到的藍色熒光信號與核酸含量成正比例,從而使熒光染料在X/Y精子上的染色程度不同[25]。因此,在流式細胞儀中進行分離時,在紫外激光的照射下,熒光標記的X精子和Y精子會發出不同的熒光信號強度,可以通過檢測精子中的熒光信號來區分X精子和Y精子,從而使它們能夠被區分并分離出來[25-26]。目前,通過流式細胞儀分離動物精子的準確率已高達95%以上,生產的商業化性控精子已廣泛應用于畜牧業中,尤其在奶牛、奶山羊的生產中應用較多[27]。然而,據曾有權等[28]研究表明,利用流式細胞儀分離X/Y精子,精子分離的純度與活力及產量呈負相關關系,并且在分離過程中對 Y 精子的活力損失較大。此外,流式細胞儀分選成本高,對操作技術要求非常嚴格,使得該技術在實際生產應用中受到一定的限制[28-29]。

1.1.4 基于基因編輯的X/Y精子分離方法 在精子發生過程中干擾Y染色體的生成是性別控制技術的一種新的發展方向[30]。從Y染色體中分離出的Y 染色體相關鋅指蛋白轉錄因子(Y chromosome linked zinc-finger protein transcriptional factor,Zfy)被認為是睪丸的決定基因,參與調節其他基因的表達,在精子發生過程中起著重要作用[31-32]。研究表明,在精子發生過程中,采用RNAi技術干擾與精子發生相關的特異性基因Zfy,Zfy基因的沉默會導致在精子形成過程中限制或損壞Y精子的功能發育,從而影響Y精子的形成,最終引起后代性別比例的改變[30-33]。目前,該方法在綿羊、馬鹿、豬及小鼠等動物上取得了一定的性別控制效果[34-38],并且不會影響胚胎發育,具有極大的研究前景[30]。

上述方法中,流式細胞儀分選法是目前最常用、最成熟的X/Y精子分離方法,也是迄今為止唯一公認的家畜性別控制方法,相較于其他方法,流式細胞儀分選的X/Y精子純度較高,可達到75%～90%[39]。然而,利用該方法分離X/Y精子依然存在儀器成本價格過高和專利費昂貴等問題,同時,與普通精液相比,使用流式細胞儀獲取性控精液的效率較低(每小時僅7～12根細管),且每根細管的有效精子數量較少(200萬～400萬),極大限制了其在畜牧業中的應用[40-41]。此外,利用流式細胞儀分選后的精子活率和質膜完整性較低,從而影響受精率和胚胎發育[42]。因此,研究人員致力于挖掘X/Y 精子的差異表達基因或者蛋白,特別是尋找 X/Y 精子間的差異膜蛋白,以期發現分離X/Y 精子的新方法。近年來,在根據X和Y精子之間的蛋白表達差異來分離 X/Y 精子方面取得了新的進展。研究表明,精子具有一些先天的免疫細胞功能,發揮該功能的TLR 家族成員(Toll-like receptors,TLRs)可識別特定病原體,在哺乳動物精子中表達,且相關基因表達較高,能通過降低精子的運動性和受精能力來響應細菌內毒素LPS和肽聚糖[43],在精液或子宮感染細菌和/或病毒時通過改變精子獲能和過度活化運動來損害受精[43-44]。在此基礎上,Umehara等[8]報道了兩種膜相關受體蛋白:Toll樣受體7(Toll-like receptor 7,TLR7)和Toll樣受體8(Toll-like receptor 8,TLR8)。TLR7和TLR8均定位于細胞內膜,在哺乳動物先天免疫和炎癥反應中起關鍵作用[45]。TLR7和TLR8可被RNA病毒釋放的單鏈RNA激活,RNA介導的生殖道中TLR7和TLR8的激活可能會增加XY胚胎與XX胚胎的比例[46]。雷西莫特(R848)是咪唑喹啉的小分子化合物,也是TLR7和TLR8的激動劑,目前臨床上用于治療感染性病毒性疾病和腫瘤[47-48],可用于分離小鼠附睪中的X精子或Y精子。由于在X染色體上編碼的TLR7和TLR8在精子中表達并且兩者都具有共同的配體,將精子與 TLR7和TLR8的配體R848一起進行孵育后,TLR7和TLR8的配體會選擇性地抑制攜帶X染色體的 X 精子的運動能力,而Y精子不受影響,且不會改變精子的質膜和頂體完整性,從而利用X/Y精子運動能力差異分離 X 和 Y 精子,使用該方法分離 X/Y 精子的準確性達到了80% 以上[40]。Umehara等[8]的工作為研究精子表面特異性蛋白差異和進一步控制哺乳動物的后代性別提供了新的技術手段[49]。迄今為止,激活精子中TLR7和TLR8受體的生理相關性尚未得到徹底探索,該方法仍需在其他哺乳動物上進一步研究與驗證,并探索其作用的相關生理機制。解決這一難題后,該方法有望取代流式細胞分選技術用于高效率制備家畜性控精液[8,50]。

1.2 受精后早期胚胎性別鑒定

隨著精卵結合形成胚胎,胚胎的性別已經確定,因而在胚胎移植前,通過對胚胎進行性別鑒定,可以人為篩選出所需性別的胚胎進行移植,從而生產出符合預期性別的家畜后代。目前,常用的胚胎性別鑒定方法主要有 SRY-PCR 法、免疫學法和細胞遺傳學方法。

1.2.1 SRY-PCR法 SRY-PCR 法的原理是針對Y精子的特異性SRY基因,設計特異性引物后進行 PCR 鑒定。近年來,隨著 PCR 技術的快速發展和普及,SRY-PCR 因其靈敏度高、速度快和可重復性好等特點,而被廣泛應用于早期胚胎性別鑒定,是目前最常用的早期胚胎性別鑒定方法[3]。劉俊平等[51]采用 PCR技術對牛體內胚胎和體外胚胎的性別進行鑒定,結果顯示,兩種胚胎移植后母牛的妊娠率無顯著差異,后代犢牛的性別與鑒定結果符合率則高達 100% 。目前,SRY-PCR 性別鑒定技術已成功應用于小鼠、兔、豬、牛和羊等哺乳動物的早期胚胎鑒定,通過使用PCR方法檢測胚胎的SRY基因是否存在,進行早期胚胎的性別鑒定,胎兒出生后的性別符合率可高達100%[3,7,27,52],使用該方法鑒定早期胚胎性別的操作簡便、準確率高,但由于需從胚胎分離部分細胞,可能會對胚胎后期發育造成損傷。此外,由于該方法主要使用胚胎作為樣品,導致起始樣品量少,擴增量大,容易造成污染產生假陽性的結果,從而影響試驗結果的準確性[27,53]。

1.2.2 免疫學法 采用免疫學法檢測早期胚胎性別是利用雄性胚胎有特異性的H-Y抗原,采用H-Y抗血清或 H-Y單克隆抗體進行鑒定,目前最常用的免疫學法主要是指間接免疫熒光法。間接免疫熒光法是將胚胎移入含有 H-Y 抗血清或 H-Y單克隆抗體的液體中,再添加熒光素標記的二抗,以胚胎呈現的特異熒光為標記,熒光陽性則為雄性胚胎,否則為雌性胚胎。該鑒定方法在豬、牛、綿羊等家畜上已有成功示范,準確率均在85% 左右。但是由于 H-Y 抗原的特異性弱,熒光強度的判斷易受主觀性影響,從而容易導致該鑒定方法的準確性偏低[3]。

1.2.3 細胞遺傳學方法 由于雌性胚胎有一條失活的特異性X染色體即巴氏小體,而雄性胚胎沒有,因而可以通過有無巴氏小體來判斷早期胚胎的性別。但該方法首先要用秋水仙素處理胚胎后再進行核型分析,因而會對胚胎造成不可逆轉的損傷,所以不適用于家畜的生產,目前僅僅用于驗證其他性別篩選方法的準確性[3]。

2 TLR7和TLR8在性控技術中的研究進展

2.1 TLR7和TLR8受體在小鼠及家畜睪丸和精子中的定位表達

2019年,Umehara等[8]通過蛋白質免疫印跡分析(Western blot)、流式細胞術(flow cytometry,FCM)和免疫熒光染色(immunofluorescence,IF)分析了TLR7和TLR8在小鼠睪丸、附睪及精子中的表達,發現 TLR7和TLR8存在于小鼠附睪精子、睪丸精子細胞和睪丸間質細胞(leydig cell)中,但在睪丸支持細胞(sertoli cell)中表達較弱。通過從附睪尾部收集的小鼠成熟精子中研究發現TLR7和TLR8是小鼠 X 染色體編碼的蛋白,在小鼠X精子中特異性表達,并定位于小鼠精子中段和鞭毛部分,且陽性精子的比例接近50%[8]。Ren 等[54]研究發現,TLR7和TLR8也是關中奶山羊X染色體的編碼基因,通過對奶山羊睪丸組織和附睪組織進行PNA染色,發現TLR8+信號主要定位在奶山羊精子中段及尾部的連接部分,而TLR7+信號主要定位在奶山羊精子的整個尾部。通過免疫組織化學染色發現,TLR7和TLR8蛋白在睪丸圓形精子細胞、附睪精子和成熟精子中均有表達,且TLR7和TLR8陽性精子比例接近50%[50,54]?；?Umehara等[55]的研究結果:TLR7和TLR8蛋白在公牛X精子中均定位于精子尾部。劉偉東[40]推測,TLR7和TLR8在秦川牛X精子中特異表達,通過對秦川牛睪丸圓形精子、附睪精子和成熟精子分別進行TLR7和TLR8免疫熒光染色,發現TLR7和TLR8在秦川牛的睪丸圓形精子、附睪精子和成熟精子中均有表達,且TLR7和TLR8陽性精子比例接近50% 。與上述研究有所不同的是,吳昌華等[56]利用免疫組化檢測公豬睪丸和附睪中的TLR7和TLR8的定位表達,發現TLR7和TLR8 mRNA在公豬睪丸、附睪頭、附睪體、附睪尾組織以及精子中均有表達。然而,通過細胞免疫熒光驗證發現TLR7和TLR8蛋白在公豬X精子和Y精子中均有表達且表達模式無顯著差異:TLR7蛋白主要表達于豬精子頭部頂體區域,TLR8蛋白主要表達于豬精子尾部。上述研究表明,小鼠、牛和奶山羊TLR7和TLR8在精子中的定位表達相似,均在X染色體上特異性表達。但在豬中的定位表達并未表現出與前者的一致性,且未有特異性表達結果。

2.2 TLR7和TLR8激動劑R848對小鼠及家畜精子活力及運動性能的影響

Umehara 等[8,55]研究發現,在X染色體上的TLR7和TLR8在小鼠精子中表達且具有相同的配體雷西莫特(R848),通過將小鼠精子與R848或TLR7的特異性配體咪喹莫特(R837)共同孵育后,使用精子質量檢測系統分析(CASA),結果表明,用TLR7和TLR8特異性配體(R848/R837)處理小鼠精子后顯著降低了小鼠X精子的運動速度而不影響Y精子的運動速度,導致下層 X 精子百分比顯著降低(P<0.05),上層 Y 精子的百分比顯著增加(P<0.05)。并通過試驗證明,在去除R848后小鼠精子活力恢復,即R848對精子活力的抑制是可逆的[40,54-55],R848處理后的小鼠精子保持受精能力[8]。由于平均路徑速度(average path velocity,VAP)與頂體反應精子的數量之間存在顯著相關性[57];VAP和平均直線運動速率(average straight line velocity,VSL)與生育率呈正相關[58];平均曲線運動速率(average curve line velocity,VCL)與精子濃度相關并影響生育能力[59],Ren等[54]向奶山羊精液中加入 TLR7和TLR8 的配體(激活劑)R848,探究其對奶山羊精子運動性能的影響,試驗表明,在添加R848孵育后,奶山羊的下層精子活力以及VAP、VSL和VCL等精子運動相關參數均顯著下降(P<0.05),而上下層精子的質膜完整率和頂體完整率均無顯著變化(P>0.05)。與該研究結果相似的是,劉偉東[40]為探究TLR7和TLR8激動劑R848對牛精子運動性能的影響,將不同濃度TLR7和TLR8激動劑R848與秦川牛精子共同孵育,分析上游精子的比例,結果顯示,R848處理組處理后上層 X 精子比例顯著低于對照組 (P<0.05),此外,下層 X 精子 VAP 、 VSL 和 VCL 均顯著低于上層 Y 精子和對照組(P<0.05),且下層X精子運動軌跡變短;同時下層 X 精子的活力較上層Y精子和對照組有顯著下降(P<0.05),而上、下層精子的質膜完整率和頂體完整率與對照組相比無顯著變化(P>0.05),表明TLR7和TLR8激動劑R848抑制了下層 X 精子的運動性能,但對上、下層的精子質量無明顯影響。與上述研究結果不同,吳昌華等[56]用TLR7和TLR8配體R848孵育豬精子后,精子活力降低,但上層兩種性別精子的比例沒有顯著變化且與對照組相比無顯著差異(P>0.05)。究其原因,可能是精子的糖酵解途徑被抑制,產生的ATP減少,影響了精子運動,從而使處理后的精子活力降低。由于TLR7和TLR8在豬的X/Y精子中均有表達,使 R848 孵育豬 X/Y 精子后兩種精子的活力均受到影響,但X/Y 精子無法分離?；谪i不同于小鼠、奶山羊、秦川牛的特點,印證了TLR7和TLR8激動劑分離其他家畜 X/Y 精子的可能性。

2.3 TLR7和TLR8激動劑R848對小鼠及家畜精子活力及運動的作用機制

由于精子運動速度受精子細胞內ATP水平的調節,Umehara等[8]探究了TLR7和TLR8 配體對精子中 ATP 產生的影響,用兩種TLR7和TLR8配體(R848、R837)孵育小鼠精子后,精子中的ATP水平顯著降低[8,60]。由于ATP的產生受線粒體三羧酸循環、β氧化和/或細胞質糖酵解的調節[61-62],Umehara等[8]對小鼠精子的線粒體活性和糖酵解活性進行了測定。試驗表明,定位在小鼠X精子中段的TLR8的激活抑制了精子線粒體活性,而定位在小鼠X精子尾部的TLR7的激活抑制了精子細胞質的糖酵解。此外,該研究還表明R848能促進核因子κB(NF-κB)和糖原合成酶激酶3α/β(glycogen synthase kinase 3α/β,GSK 3α/β)的磷酸化,通過GSK 3α/β-己糖激酶途徑抑制X精子產生ATP,從而降低 X 精子運動性能[8]。

基于TLR7和TLR8激活劑影響奶山羊下層精子(X精子)活力且對精子的質膜和頂體完整率無顯著影響的研究結果,Ren等[54]進一步探究了R848對奶山羊精子ATP水平和線粒體活性的影響,結果表明,添加 TLR7和TLR8 激活劑(R848)孵育奶山羊精子后,精子ATP水平和線粒體活性均顯著降低(P<0.05)。經檢測發現,R848處理奶山羊精子后,精子中的NF-κB和GSK 3α/β的磷酸化水平顯著增加(P<0.05);并且下層精子(X精子)的NF-κB和GSK 3α/β的磷酸化水平相較于上層精子(Y精子)有顯著增加(P<0.05)。此外,任發[50]利用流式細胞儀對分選后的上、下層精子分別進行鑒定,發現上層中Y精子和下層中X精子所占比例均在80% 以上。該結果進一步證明了TLR7和TLR8在奶山羊X精子中特異性表達,且R848通過特異性激活TLR7和TLR8信號通路影響奶山羊精子的己糖激酶途徑,從而抑制了X精子的運動性能。該研究通過鑒定出特異表達在奶山羊X精子上的TLR7和TLR8蛋白,初步建立了一種奶山羊精子分離的方法,為奶山羊性別控制技術提供了理論參考,同時也為家畜的性控技術提供了新的理論技術參考。

與上述研究結果相似,劉偉東[40]在確定TLR7和TLR8激動劑 R848 可以抑制 X精子運動性能后,將牛精子與TLR7和TLR8激動劑R848共孵育后,檢測上、下層精子 ATP 、線粒體膜電位后發現,下層 X 精子的 ATP 和線粒體膜電位均顯著低于上層 Y 精子和對照組(P<0.05);對上層精子和下層精子進行Western blot檢測后發現,下層X精子NF-κB和GSK3α/β的磷酸化水平相較于上層Y精子有顯著增加(P<0.05)。劉偉東[40]推測,R848通過與X精子TLR7和TLR8受體結合后,可分別通過GSK 3α/β 和NF-κB信號通路提高GSK 3α/β和NF-κB蛋白磷酸化水平,進而抑制精子線粒體和己糖激酶活性,降低 X 精子的ATP水平和線粒體膜電位,從而導致 X 精子的活力降低。但其具體的分子調控機制仍有待進一步深入研究。同樣,劉偉東[40]同樣驗證了分選后 X 精子和 Y 精子的純度,發現上層的 Y 精子百分比為88.6% ,而下層的 X 精子百分比為72.5% 。由該研究結果可知,用 TLR7和TLR8 特異蛋白激活分選技術能夠有效分離牛的X精子和Y精子,為研發性控精液新技術提供理論參考。同時有助于促進我國肉牛種業發展,加速良種肉牛繁育進程。

上述研究分別發現,TLR7和TLR8 激活劑可通過調控小鼠、關中奶山羊和秦川牛X精子的線粒體活性和ATP水平抑制X精子的運動性能,激活TLR信號通路,通過GSK 3α/β-己糖激酶途徑增加NF-κB和GSK 3α/β磷酸化,從而降低精子活力,但對Y精子無影響[40]。然而,對于TLR7和TLR8調節精子中己糖激酶活性的機制仍有待進一步研究[55]。

3 總結與展望

在精子分離技術的研究中,上游法是一種簡單、經濟的精子分離方法,可使高活力精子上游而聚集在上層,低活力精子或死精子則留于下層,上游法分離出的精子具有更高的活力[63]。然而,該方法的分離結果在物種上存在一定差異[64]。在Umehara等[55]和 Ren等[54]研究的基礎上,劉偉東[40]通過改進上游法,并加入TLR7和TLR8激動劑R848,與牛精子共孵育使得上層精子比例顯著降低,從而使X/Y精子分離。該方法利用TLR7和TLR8激動劑激活TLR7和TLR8受體,使 X 精子的活力及運動性能降低,從而分離出X/Y精子。這使得激活TLR7和TLR8成為分離出家畜X/Y精子的一種可能,有望為家畜的性控技術提供新方法。該方法目前在牛、奶山羊及豬中有進一步的研究,發現該方法在家畜生產中可能適用于牛和羊的X/Y精子分離,但并不適用于豬的X/Y精子分離。吳昌華等[56]研究結果表明,TLR7和TLR8蛋白在豬的兩種性別精子中都有表達,說明在精子發生過程中,由 X 染色體編碼的TLR7和TLR8蛋白在兩種性別精子中可能得到了共享,從而使二者對TLR7和TLR8的定位表達表現出相似性。另外,將豬精子經R848孵育后,X/Y精子的活力均降低,但上層兩種性別精子的比例沒有顯著變化[56]。李志強[65]關于豬X精子和Y精子蛋白質組學的研究顯示,在公豬的X/Y精子差異蛋白中并未發現 TLR7和TLR8蛋白,即TLR7和TLR8在豬的兩種性別精子中都有表達,因此使得R848孵育后 X/Y精子活力都受到影響而無法將其分離[56]。豬精子的TLR7和TLR8蛋白表達模式與小鼠、牛和奶山羊精子存在著很大的差異,這可能是不同物種間的差異性導致同一蛋白表達模式差異的結果,因而使得該方法在不同物種之間的應用有所差異。因此,利用該方法分離 X/Y 精子目前有待進一步研究,在不同家畜中的應用仍具有較高的研究價值。由于TLR7和TLR8基因的表達在哺乳動物 X 染色體上高度保守[66],因此使用TLR7和TLR8配體活化的新型方案有望適應哺乳動物生殖技術,以便在短時間內分離X/Y精子,且無需使用昂貴、有害和耗時的細胞分選系統。

隨著科學技術的不斷發展和人類對畜產品經濟效益追求的提升,人們對特定性別家畜的需求量不斷增加,將來,對X/Y精子進行準確、完全、無損害的分離和對家畜進行簡便、經濟、安全、快速的性別篩選將會成為動物生產的未來趨勢。因此,研究和發展性控技術將為高效、快速培養新的優良品種和高效的動物生產提供更有力的技術手段。后續,課題組將展開對激活TLR7和TLR8受體分離灘羊X/Y精子后X精子的代謝途徑以及 X/Y 精子染色質開放性研究,以期取得進一步研究成果,為TLR7和TLR8分離 X/Y 精子的進一步研究做出貢獻。目前,利用TLR7和TLR8進行X/Y精子分離成為具有極大前景的研究方向。本綜述將為接下來在家畜中激活TLR7和TLR8進行精子分離技術提供更多的理論參考,以促進現代畜牧產業快速高質量發展。