基于質量源于設計（QbD）制備大黃素固體脂質納米粒

李 楠，鄧艷平

福建醫科大學藥學院，福建 福州 350122

納米制劑的發展將帶來更多創新或個性化的療法，為攻克更多重大疾病帶來希望[1]?；诖?，常用納米制劑如脂質體[2-3]、膠束[4-5]、固體脂質納米粒（solid lipid nanoparticle，SLN）[6-7]等已經得到廣泛的應用。但納米制劑的安全性、工藝及質量的可控性、關鍵設備及輔料對國外的過度依賴性等問題仍是需要應對的挑戰[8]。

傳統制劑的開發基于質量的檢測和生產出發，而引入質量源于設計（quality by design，QbD）理念，改進制造過程，可確保最終產品的質量和安全。QbD 已經廣泛應用于美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration，FDA）和歐洲藥物管理局（European Medicines Agency，EMA）。QbD的基本內容（圖1）是：以預先設定的目標產品質量概況（quality target product profile，QTPP）作為研發的起點，在確定產品關鍵質量屬性（critical quality attributes，CQAs）的基礎上，基于風險評估和實驗研究，確定關鍵物料屬性（critical material attributes，CMAs）和關鍵工藝參數（critical process parameters，CPPs），進而建立能滿足產品性能且工藝穩健的控制策略，最終完成設計、完善整體戰略方案，實施產品和工藝的生命周期管理（包括持續改進）。QbD 原則[9-10]在近年來成功應用于開發納米制劑遞藥系統如脂肪乳[11]、納米粒[12]。

圖1 QbD 理念在處方工藝優化中的實施過程Fig.1 Implementation of QbD concept in prescription process optimization

因多酚類藥物具有良好抗氧化、腫瘤預防作用，但大部分具有水溶性低、腸道壁通透性差、胃腸道代謝等缺點，阻礙了該類藥物研發成口服制劑的發展進程[13]。而大黃素屬于典型的多酚類藥物，故本實驗以大黃素為模型藥物，利用QbD 開發大黃素固體脂質納米粒（emodin solid lipid nanoparticle，Emo-SLN）。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1260 型高效液相色譜儀，安捷倫科技（中國）有限公司；DF-101S 型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責任公司；ME104 E型電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Centrifuge 5430 R 型離心機，德國艾本德生命科學公司；ZQTY 50 型震蕩培養箱，上海知楚儀器有限公司；Sonics 型超聲細胞破碎儀，上海書俊儀器設備有限公司；Anton Paar LitesizerTM500 型激光納米粒度/電位儀，安東帕（上海）商貿有限公司。

1.2 樣品與試劑

單辛酸丙二醇酯（CapryolTM90，批號85883-73-4）、油酰聚氧乙烯甘油酯（Labrafil M 1944 CS，批號192796）、單月桂酸丙二醇酯（LauroglycolTM90，批號127903）、單亞油酸甘油酯（MaisineTM，批號125116）、山崳酸甘油酯（Compritol 888 ATO，批號156632）、單雙硬脂酸甘油酯（批號143048）、雙硬脂酸甘油酯（Percirol ATO 5，批號131343）、硬脂酰聚氧乙烯甘油酯（Gelucire 50/13，批號121651）、月桂酰聚氧乙烯-32 甘油酯（Gelucire 44/14，批號125008）、二乙二醇單乙醚（Transcutol?HP，批號145272）均為法國Gattefossé 公司惠贈；聚乙二醇400（PEG 400，批號20101214）、聚山梨酯20（Tween 20，批號20200303）、聚山梨酯80（Tween 80，批號20100502）均為南京威爾集團有限公司所產；曲拉通X-100（Triton X-100，批號20131918）由國藥集團化學試劑有限公司所產；中鏈甘油三酯（MCT，批號 19985）、丙二醇二辛酸酯（propylene dioctanoate，批號131202）、三乙酸甘油酯（triacetin，批號Z16J7Y9191）均由北京鳳禮精求商貿有限責任公司所產；聚乙二醇-15 羥基硬脂酸酯（Solutol?HS15，批號96146968E0）、聚氧乙烯氫化蓖麻油（Cremophor?RH40，批號16894024UO）均為德國BASF 公司惠贈。大黃素對照品，批號518-82-1，質量分數≥98%，購于上海麥克林生化科技股份有限公司；甲醇為色譜純試劑，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 Emo-SLN 的QbD 評價

2.1.1 QTPP 大黃素對光敏感、易氧化分解，為使用和貯存帶來不便；且由于大黃素難溶于水，且存在胃腸道代謝，以口服給藥為途徑，將其制成SLN，可提高其溶解度，使藥物穩定性增加，提高藥物在人體的生物利用度的同時還可減少藥物劑量，提高患者用藥依從性。為改善大黃素難溶和不穩定等一系列問題，以安全、穩定且有效的口服SLN 為目標產品，通過查閱文獻，結合臨床用藥的特點，總結上述目標產品的質量概況，結果如表1 所示。

表1 Emo-SLN 的QTPPTable 1 QTPP for Emo-SLN

2.1.2 CQAs CQAs 是“物理、化學、生物學或微生物學性質或特點，應在適宜的限度、范圍或分布內以保證預期藥品的質量”[17]。根據大黃素的性質和魚骨圖法[18]，得表2 及圖2 中的CQAs 包含的粒徑、包封率、載藥量、體外釋放等參數。

表2 Emo-SLN 的CQAsTable 2 CQAs of Emo-SLN

圖2 Emo-SLN 的魚骨圖Fig.2 Fish bone diagram of Emo-SLN

2.1.3 制劑的風險評估 根據Emo-SLN 的CQAs，對制劑進行風險評估[19]，以評估每種屬性可能對制劑CQAs 的影響。使用故障模式、影響和危害性分析（failure mode and effects criticality analysis，FMECA）方法（表3、4）進行評估[20]。

表3 FMECA 法進行風險評估Table 3 FMECA methods for risk assessment

表4 FMECA 法的風險優先系數 (RPN) 評價標準Table 4 FMECA methods for risk priority number (RPN)evaluation criterion

SLN 主要由原料藥、脂質、表面活性劑（乳化劑）、助表面活性劑（助乳化劑）和水組成。脂質主要作為SLN 的載體，可提高大黃素的溶解度，影響SLN 的安全性和穩定性。表面活性劑作為SLN 中的重要成分，可降低界面勢能，與其穩定性和安全性高度相關。根據相關文獻及制劑經驗，采用FMECA 法對Emo-SLN 的處方變量包括：原料藥、表面活性劑、脂質和助表面活性劑進行風險評估。結果如表5 所示。采用熔融乳化法制備SLN，其中，相轉變溫度、超聲功率、超聲時間是影響該制劑SLN 制備的關鍵因素。對其進行風險評估（表6），并對SLN 進行QbD 評價（圖3）。

表5 處方變量的風險評估Table 5 Risk assessment of formulations

表6 工藝變量的風險評估Table 6 Risk assessment of processes

圖3 SLN 的QbD 評價圖Fig.3 Diagram of QbD evaluation for SLN

2.2 Emo-SLN 的CMAs 篩選

分別于相應的脂質、表面活性劑、助表面活性劑中加入過量大黃素，置于恒溫搖床避光振搖24 h后取出，于37 ℃、10 000 r/min 離心（離心半徑為10 cm）15 min。取上清液，用0.45 μm 濾膜濾過后進樣HPLC 分析，計算大黃素的溶解度。結果如表7、8 所示，選擇CapryolTM90 為脂質，Cremophor?RH40 作為表面活性劑。

表7 大黃素在脂質中的溶解度Table 7 Solubility of emodin in lipids

表8 大黃素在表面活性劑中的溶解度Table 8 Solubility of emodin in emulsifiers

2.3 Emo-SLN 的制備

以50 ℃為制備溫度，選用熔融乳化法，于50℃分別加水及處方量的大黃素與脂質CapryolTM90（質量比1∶160）、表面活性劑Cremophor?RH40、助表面活性劑Transcutol?HP 混勻，攪拌3 min，于超聲細胞破碎儀（功率200 W，超聲時間5 min，工作2 s，暫停2 s）破碎，2～8 ℃保存12 h 后過0.8 μm 的濾膜，即得Emo-SLN。

2.4 SLN 的質量控制研究

2.4.1 含量測定 選用HPLC 法[24]進行測定，色譜條件如下：色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為水-甲醇（10∶90）；體積流量1.0 mL/min；檢測波長265 nm；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。

精密稱取1 mg 大黃素，溶解于甲醇溶液中，作為大黃素對照品溶液。并按“2.3”項下的方法制備空白SLN（除了不加大黃素其余步驟同上）。取適量的空白SLN 按其與甲醇體積比（1∶9）的比例下加入甲醇，渦旋破乳后，以流動相稀釋；同法操作，進樣稀釋后的Emo-SLN 和大黃素對照品溶液，對比3 個樣品的出峰時間，判斷輔料是否會對樣品產生干擾，以及制得的Emo-SLN 檢測到的色譜峰是否為大黃素的樣品峰。如圖4 所示，表明溶劑和輔料在該色譜條件下對藥物大黃素的測定沒有干擾，結果表明藥物大黃素測定的專屬性良好。在100～2 500 μg/mL 呈良好的線性關系；精密度、穩定性、重復性、加樣回收率試驗均符合要求。

圖4 Emo-SLN (A)、大黃素對照品 (B) 和空白SLN (C) 的HPLC 圖Fig.4 HPLC of Emo-SLN (A), emodin reference substance(B) and blank SLN (C)

2.4.2 Emo-SLN 的形態、粒徑和ζ 電位 吸取5 μL Emo-SLN 溶液滴到銅網上，靜置1 h，滴加2%的磷鎢酸至銅網表面，負染1～2 min，室溫自然晾干。置于TEM 下，逐漸放大至30 000 倍，觀察其形態。所制SLN 用超純水稀釋100 倍后，用激光納米粒度儀測定其粒徑、ζ 電位和多分散系數（polydispersity index，PDI）。

2.4.3 包封率和載藥量測定 取一定量體積Emo-SLN 溶液，按其與甲醇體積比（1∶9）的比例加入甲醇進行破乳，用0.45 μm 微孔濾膜濾過，在“2.4.1”項下色譜條件進樣檢測，即可測得W總。再另取1 mL Emo-SLN 溶液于30 000×g、4 ℃下高速離心（離心半徑為10 cm）1 h，取上層乳液，同法測定，即得W游離。按如下公式計算包封率和載藥量。

包封率＝W游離/W總

載藥量＝(W總－W游離)/(W總－W游離＋W脂質)

W游離、W總、W脂質分別為Emo-SLN 的未包載藥物量、總藥物含量和SLN 內除了大黃素以外的所有脂質輔料的質量

2.4.4 穩定性考察 將Emo-SLN 置于2～8 ℃冰箱，于不同時間（0、7、21、32 d）取樣檢測其粒徑和PDI。

2.4.5 安全性考察 以體外溶血實驗考察Emo-SLN 的安全性。選用《中國藥典》2020 年版中的方法測定[25]，取健康家兔的新鮮血液，1 000 r/min 離心（離心半徑為10 cm）10 min，棄去上清液。將所得紅細胞用生理鹽水配成2.0%的混懸液備用；取300 μL 的30、50、70 μmol/L Emo-SLN 溶液加入2.5 mL 該紅細胞懸液后再加入2.2 mL 生理鹽水，均勻混合后，放入37 ℃恒溫水浴孵育60 min，后1 800 r/min 離心（離心半徑為10 cm）10 min。取上清，用紫外分光光度計測定波長540 nm 下的吸光度（A）值。以生理鹽水為空白對照組，以超純水為陽性對照組，每組設3 個平行復孔。按照下列公式計算溶血率。

溶血率＝(A實驗－A生理鹽水)/(A蒸餾水－A生理鹽水)

2.4.6 體外釋放實驗 采用透析袋法[26]進行體外釋放測定。分別取1 mg/mL Emo-SLN 溶液及大黃素溶液1 mL，以200 mL 0.05 g/mL 十二烷基硫酸鈉（SDS）為溶出介質[27]，溫度為37 ℃，轉速為8 r/min，分別于0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、7.0、19.0、24.0 h 取樣1 mL，同時補充超純水1 mL，樣品處理后以HPLC 進行測定。

2.5 Emo-SLN 的處方優化試驗設計

2.5.1 處方優化試驗設計 通過文獻報道[26-29]，綜合考慮上述列出的CMA、CPP，選擇以藥脂比（1∶X1）、表面活性劑用量（X2）、超聲功率（X3）為自變量，并以SLN 的粒徑（Y1）、PDI（Y2）和包封率（Y3）為評價指標，基于單因素實驗結果，確定3個自變量的設計范圍：藥脂比（X1160～300）、表面活性劑用量（X23%～5%）和超聲功率（X3200～300 W）。根據Box-Behnken 設計（BBD）響應面原理[30]，本實驗采用3 因素5 水平的星點設計，并根據響應面試驗進行優化分析。操作步驟同“2.3”項。試驗設計及結果見表9～12?？傻贸隽降幕貧w方程為Y1＝286.49－39 913.53X1＋11.43X2＋0.19X3，R2＝0.702 3，Radj2＝0.633 6，Rpred2＝0.456 0；PDI 的回歸方程為Y2＝140.00－19 834.48X1－31.24X2－0.17X3－2 876.71X1X2＋58.12X1X3－0.05X2X3＋1.70X12＋6.81X22＋2.80×10?4X32，R2＝0.853 7，Radj2＝0.665 5，Rpred2＝0.488 0；模型相關系數R2分別為0.702 3、0.853 7，這說明該試驗模型與實際試驗擬合較好，實際試驗中約70.23%、85.37%的結果可以通過擬合模型進行解釋。校正后的決定系數R2adj分別為0.633 6、0.665 5，與R2相對接近，說明2 模型均有較好的準確性和通用性。

表9 響應面實驗設計及結果Table 9 Design and results of response surface method

而包封率的回歸方程為Y3＝?59.09＋156.46X1＋25.31X2＋0.52X3－4.16X1X2－0.45X1X3－0.10X2X3，R2＝0.5750，Radj2＝0.320 0，Rpred2＝0.108 2；該試驗模型與實際試驗擬合一般，且數據間無顯著性差異，故后續以PDI 為主，判斷不同因素對其影響。由表10 可以看出，對于粒徑影響的因素順序為藥脂比＞表面活性劑＞超聲功率；由表11 可以看出，對于PDI 影響的因素順序為表面活性劑＞超聲功率＞藥脂比。兩模型的P值均＜0.05，響應面回歸模型達到了顯著性水平。

表10 粒徑 (Y1) 的回歸模型方差分析Table 10 Variance analysis of established regression model for particle size (Y1)

表11 PDI (Y2) 的回歸模型方差分析Table 11 Variance analysis of established regression model for PDI (Y2)

表12 包封率 (Y3) 的回歸模型方差分析Table 12 Variance analysis of established regression model for encapsulation efficiency (Y3)

2.5.2 Box-Behnken 響應面交互作用 在回歸模型方差分析結果的基礎上，采用Design-Expert 13 軟件依據Y1、Y2，在回歸模型方差分析結果的基礎上繪制響應面圖及等高線圖，分析藥脂比、表面活性劑用量和超聲功率對Emo-SLN 中大黃素粒徑、PDI的影響（圖5）；3D 響應曲面和等高線圖可直觀反映交互作用對響應值的影響程度，曲面越陡，等高線越密集，則影響越顯著，等高線越接近橢圓，2個因素的交互作用越強[31]。

圖5 藥脂比、表面活性劑用量、超聲功率對PDI 交互影響的響應面圖和等高線圖Fig.5 Response surface diagram and contour plots illustrating interaction effects of drug-lipid ratio, surfactant concentration and ultrasonic power on PDI

藥脂比與超聲功率對PDI 的影響最大，藥脂比與表面活性劑對其影響次之，表面活性劑與超聲功率對其影響最?。▓D5）。在藥脂比較低的情況下，隨著表面活性劑比例的增加，PDI 先減少后增加（圖5）；當藥脂比在較高水平時，反之，響應面的傾斜度較高，坡度較為陡峭，且等高線呈橢圓形，說明藥脂比和表面活性劑的交互作用對PDI 的影響較大；同理，說明超聲功率和表面活性劑的交互作用對PDI 的影響較?。▓D5）；藥脂比和超聲功率的交互作用對PDI 的影響較大（圖5）。

2.6 Emo-SLN 的制備工藝驗證

根據“2.5”項設計所得的最優條件進行實驗：藥脂比為1∶170，表面活性劑比例為4.13%，超聲功率為216.14 W，據此平行制備3 批Emo-SLN，對該處方設計進行驗證，將測定的粒徑、PDI與“2.5”項預期結果進行比較（表13）。由表13 可知，預測值與實測值間的偏差均小于1，二者較為接近，說明該模型較為可靠。綜上，選擇藥脂比為1∶170，表面活性劑用量為4%，超聲功率為216 W 為最優處方，該處方的包封率為（98.28±1.43）%，載藥量為（0.23±0.01）%。實驗發現制備的Emo-SLN為球形，無黏連，大小均一，且粒徑在100～200 nm，ζ 電位（?21.90±0.50）mV（圖6～8），分散性良好（PDI 小于0.3），符合CQAs 要求。

表13 預測值與實際值的比較 (±s, n = 3)Table 13 Comparison of predictive value and actual value(±s, n = 3)

表13 預測值與實際值的比較 (±s, n = 3)Table 13 Comparison of predictive value and actual value(±s, n = 3)

優化指標 Y1/nm Y2預測值 145.90 4.10實測值 146.89±3.41 5.65±1.05偏差 0.50 0.77

圖6 Emo-SLN 的粒徑分布圖Fig.6 Particle size distribution of Emo-SLN

圖7 Emo-SLN 的電位分布圖Fig.7 Potential distribution of Emo-SLN

圖8 Emo-SLN 的透射電鏡圖Fig.8 TEM image of Emo-SLN

根據上述最佳條件制備的Emo-SLN在2～8 ℃儲存32 d 內，其粒徑（RSD 均小于1.5%）和分散系數（RSD 均小于0.01%）變化微?。ū?4），說明其具有良好穩定性。

表14 Emo-SLN 的穩定性 (2～8 ℃,±s, n = 3)Table 14 Stability of Emo-SLN at (2—8 ℃,±s, n = 3)

t/d 粒徑/nm PDI 0 138.90±1.14 0.063±0.006 7 108.63±1.38 0.152±0.005 14 143.87±0.25 0.087±0.007 21 127.77±0.46 0.238±0.006 32 136.30±0.28 0.086±0.003

Emo-SLN 的溶血性實驗結果如表15 和圖9 所示，其在30～70 μmol/L 濃度范圍內無溶血現象（溶血率測定結果均小于5%），從而證明其不會引起體外紅細胞溶血。

表15 Emo-SLN 的體外溶血率 (±s, n = 3)Table 15 In vitro hemolytic rate of Emo-SLN (±s, n = 3)

表15 Emo-SLN 的體外溶血率 (±s, n = 3)Table 15 In vitro hemolytic rate of Emo-SLN (±s, n = 3)

組別 濃度/(μmol?L?1) 溶血率/%水 ? 100生理鹽水 ? 0 Emo-SLN 30 ?0.660±0.085 50 2.027±0.439 70 3.864±0.455

圖9 Emo-SLN 與紅細胞、水、生理鹽水孵育后的圖片Fig.9 Picture of Emo-SLN at different concentrations incubated with red blood cells, water and saline

大黃素原料藥與Emo-SLN 體外釋放結果如圖10 所示，相對原料藥，Emo-SLN 的釋放僅有30%左右（7 h），說明Emo-SLN 具有緩釋的作用。對其進行動力學方程擬合，結果如表16 所示，發現其體外釋藥行為符合一級線性方程，Qt＝80.003 (1－e?0.084t)，R2＝0.988 3。

表16 Emo-SLN 的藥物釋放模型Table 16 Drug release kinetic models of Emo-SLN

圖10 Emo-SLN 和大黃素溶液的體外釋放情況 (±s,n = 3)Fig.10 In vitro release profiles of Emo-SLN and free emodin (±s, n = 3)

3 討論

根據國家藥品監督管理局發布的國家藥品標準關于大黃配方顆粒[32]，1 g 含總蒽醌以蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的總量計，應為10.0～25.0 mg?？梢娔壳笆褂玫奶幏街写簏S素含量較低，且給藥劑量大，故已上市并在臨床上長期使用的大黃素制劑幾乎沒有。開發一個可供臨床使用的大黃素納米制劑迫在眉睫。

2021 年國家藥品監督管理局藥品審評中心（CDE）發布的《納米藥物質量制研究技術指導原則（試行）》中也有引入QbD 的概念，且在該指導原則中提及納米藥物應重點關注可能與體內行為相關的質量指標，如粒徑、藥物釋放度以及與其特性相關的性能指標，如結構形態、包封率、載藥量、納米粒穩定性等，同時也需對納米藥物進行全過程質量控制，包括納米藥物用到的原料藥、輔料、制備的工藝參數等[33]。

故本研究引入QbD 理念對該Emo-SLN 工藝進行全面且深入的分析。首先，確認Emo-SLN 的質量概況，采用魚骨圖法和查閱文獻，確定其CQAs（粒徑、包封率、載藥量、體外釋放），再采用風險管理工具篩選出影響其質量的潛在CMAs（脂質、表面活性劑、助表面活性劑、脂質與藥物質量比）。

實驗發現大黃素在脂質材料CapryolTM90，表面活性劑Solutol?HS 15 中的溶解度比較好，且熔點較低。但因Solutol?HS 15 是一種親水性極強的輔料［親水親油平衡值（HLB）為14～16］，CapryolTM90 為水不溶性的脂質（HLB 值為5），二者無法均勻地混合，混合后靜置即會分層，所以本實驗采用溶解度次之的Cremophor?RH40作為表面活性劑材料，其他皆選用上述藥物在其溶解度最大的材料。經查閱文獻[34]，發現，助表面活性劑Transcutol?HP的溶解度大于PEG 400，所以選擇Transcutol?HP作為助表面活性劑。選用的脂質CapryolTM90[35]可能增加脂質和蛋白質區域的腸脂膜流動性，從而通過跨細胞途徑促進腸道對胰島素的吸收，且CapryolTM90 是一種生物利用度增強劑，因此，此脂質有望促進大黃素在腸道的吸收，增強其在腸道的生物利用度。且有文獻報道[36]Cremophor?RH40有可能影響經細胞色素CYP3A4 轉化的藥物代謝及處置，增加藥物的生物利用度，對藥物的臨床應用產生顯著影響；以Cremophor?RH40 為輔料的大黃素納米乳通過減少在MDCK II 細胞高表達的葡萄糖醛酸轉移酶醛酸化而增加跨細胞滲透，可作為提高大黃素口服生物利用度的一種有前途的策略[37]。Cremophor?RH40 的這一特點可針對大黃素存在的首關消除效應，從而提高大黃素在體內的生物利用度。且Cremophor?RH40 與CapryolTM90 合用，一方面有望提高大黃素在腸道的吸收，另一方面又可降低大黃素在腸道的代謝。

Emo-SLN 中大黃素的溶解度為大黃素溶液的近10 倍，顯著地提高了藥物的溶解度?；赒bD設計，并篩選了CMAs 及CPPs，17 組樣品測得的包封率均大于80%，較其他Emo-SLN 的包封率提高了25%左右[38]，PDI 小于0.5，表面活性劑比例較其他的大黃素納米制劑小[23]，可減少表面活性劑的毒性，安全性更大，以上結果均符合CQAs 的要求。本實驗以QbD 為理論基礎，成功設計Emo-SLN的開發，并為SLN 及其他納米藥物的開發研究提供了思路。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突