基于代謝組學研究生地黃對寒證大鼠的藥性

張文森，崔 娜，蘇發智，張轉轉，賈晨宸，孫延平，楊炳友，匡海學*，王秋紅

1.黑龍江中醫藥大學 教育部北藥基礎與應用研究重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040

2.廣東藥科大學 廣東省中藥飲片規范化炮制工程技術研究中心，廣東 廣州 510006

中藥藥性理論是中醫藥體系的重要組成部分，對臨床給藥和辨證論治進行高度概括，包括四氣、五味、升降浮沉、歸經和毒性等內容[1]。四氣又稱為四性，具體分為寒、熱、溫、涼[2]。在藥性的本質上，只有寒熱之分。中藥藥性理論是區分天然藥物和中藥的重要指標之一，因此其深入研究對了解中藥內部結構及其寒熱藥性的本質至關重要，對指導臨床合理用藥具有重要意義。

本研究基于匡海學教授創新的中藥性味理論，將中藥的寒、熱、溫、涼四性定義為藥物通過不同途徑主要影響機體能量代謝的生物學效應。具體而言，對機體能量代謝呈促進作用的中藥被歸為溫熱性，呈抑制作用的中藥被歸為寒涼性，而對機體能量代謝無明顯改變的中藥則具有平性[3]。本研究以匡海學教授提出的中藥性味理論為理論基礎，選擇生地黃RehmanniaeRadix為研究對象，以探討其藥性屬性。通過揭示生地黃不同成分的分離手段，并運用寒證大鼠模型，闡明其寒熱藥性的科學內涵。本研究進一步證實了匡海學教授提出的中藥性味理論的客觀性和科學性，深入研究了中藥寒熱藥性的本質。對生地黃及其拆分組分的寒熱藥性進行了詳實的評價和歸屬，為中藥性味理論的進一步發展提供了有力的支持。

1 材料

1.1 動物

SPF 級雄性SD 大鼠，體質量180～220 g，購自遼寧長生生物技術有限公司，動物許可證編號SCXK（遼）2020-0001。動物在溫度18～22 ℃、相對濕度40%～60%的動物房中適應性喂養3 d。動物實驗經過黑龍江中醫藥大學倫理委員會審批（批準號2019121101）。

1.2 藥材

生地黃飲片購自哈爾濱市三棵樹藥材公司，產地為河南焦作市，經過黑龍江中醫藥大學藥學院樊銳峰副教授鑒定為玄參科植物地黃Rehmannia glutinosaLibosch.的新鮮或干燥塊根，符合《中國藥典》2020 年版規定。

1.3 藥品與試劑

95%乙醇購自天津市化學試劑一廠；乙腈（質譜純）購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；甲酸（質譜純）、D101 大孔樹脂（批號C13946107）、棉子糖標準品（批號C14871971）均購自上海麥克林生化科技有限公司； 去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）測試盒（批號CK-E30587）、丙酮酸（pyruvic acid，PA）測試盒（批號CKE31069 ）、三碘甲狀腺原氨酸（ 3,5,3′-triiodothyronine，T3）測試盒（批號CK-E310615）、甲狀腺素（thyroxine，T4）測試盒（批號 CKE310616）、多巴胺（dopamine，DA）測試盒（批號CK-E30237）、Na+,K+-三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）酶測試盒（批號CK-E30909）、乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AchE）測試盒（批號 CK-E30063）、琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase，SDH）測試盒（批號CK-E31014）購自科諾迪生物科技有限公司；水蘇糖標準品（批號 J04D10R104841 ）、蔗糖標準品（ 批號J19A11C121891）購自上海源葉生物科技有限公司。

1.4 儀器

AcquityTMUPLC 超高效液相色譜系統、Waters e2695 型高效液相色譜儀、2424 ELS 型檢測器（美國Waters 公司）；UPLC Sciex-Triple TOF/MS 質譜系統（美國AB Sciex 公司）；Milli-Q 純水器（密理博上海貿易有限公司）；N1100 小型旋轉蒸發儀（日本EYELA 公司）；KQ-500DB 型超聲波清洗劑（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.5 數據庫及軟件

人類代謝組學數據庫（ HMDB，https://hmdb.ca ）；京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG，https://www.kegg.jp）；Progenesis QI（美國Waters 公司）；SIMCA 14.1（瑞典Umetrics 公司）。

2 方法

2.1 生地黃水煎液及其拆分組分的制備

取500 g 生地黃飲片，加入6 L 蒸餾水浸泡2 h，然后在回流裝置中加熱提取2 h。使用8 層醫用紗布濾過，重復3 次。將3 次濾液合并，得生地黃水煎液。

在40 ℃條件下，將合并后的濾液減壓濃縮成浸膏。將95%乙醇倒入濃縮液中，當溶液體積分數達到80%時，靜置沉淀24 h。4 000 r/min 離心15 min 分離沉淀，重復3 次后，將收集到的沉淀使用無水乙醇、丙酮洗脫小分子物質后，得到的固體物質為多糖組分。

將洗脫溶液與離心剩余的溶液合并，在30 ℃條件下減壓濃縮。通過D101 大孔樹脂柱色譜法分離，使用水-乙醇溶劑系統洗脫。使用高效液相色譜儀檢測合并相近成分，分離出低聚糖組分和環烯醚萜苷部分。

2.2 生地黃的質量控制

2.2.1 色譜條件 XBridge@BEH Amide 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為水-乙腈（30∶70），等度洗脫；柱溫35 ℃；蒸發光散射檢測器檢測，漂移管溫度100 ℃，增益值100；進樣量20 μL?；旌蠘藴势芳皹悠返腍PLC 圖見圖1。

圖1 生地黃樣品 (A) 和混合標準品 (B) 的HPLC 圖Fig.1 HPLC of Rehmanniae Radix sample (A) and mixed reference substances (B)

2.2.2 標準品儲備液的制備 分別取棉子糖、蔗糖和水蘇糖標準品適量，精密稱定，置于1 mL 量瓶中，加60%乙腈溶解并稀釋至刻度，制成質量濃度分別為1 mg/mL 的標準品儲備液，備用。

2.2.3 供試品溶液的制備 取“2.1”項中合并后的溶液1 mL，55 ℃旋轉蒸發至干燥，加8 mL 60%乙腈溶解干燥產物，即得供試品溶液。

2.2.4 標準曲線的繪制 分別精密量取“2.2.2”項下單一標準品儲備液，棉子糖和蔗糖的進樣體積為1、3、5、10、15、20 μL；水蘇糖的進樣體積為5、10、20、40、80、100 μL。按照“2.2.1”項下的色譜條件進行測定，測定各自峰面積，并以峰面積的常用對數值為縱坐標（Y），進樣量的常用對數值為橫坐標（X），繪制標準曲線。結果表明，3 個糖類成分在各自線性范圍內呈現出良好的線性關系（表1）。

表1 生地黃中3 個主要成分的回歸方程、線性范圍及相關系數（R2）Table 1 Regression equation, linear range and correlation coefficient (R2) of three main components in Rehmanniae Radix

2.2.5 精密度試驗 取棉子糖、蔗糖和水蘇糖的混合標準品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件連續進樣測定6 次，計算得到上述成分峰面積的RSD 分別為3.1%、2.4%和2.9%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩定性試驗 取供試品溶液于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h 后，按“2.2.1”項下色譜條件進樣，計算棉子糖、蔗糖和水蘇糖峰面積的RSD分別為2.1%、3.9%和3.9%。表明供試品溶液在24 h內基本穩定。

2.2.7 重復性試驗 取生地黃飲片各6 份，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，計算得到棉子糖、蔗糖和水蘇糖的平均質量分數分別為2.05%、16.69%和70.57%，RSD 分別為1.84%、2.51%和2.91%，表明該方法重復性良好。

2.3 動物分組、造模與給藥

將大鼠隨機分成對照組、模型組、水煎液（7.56 g/kg）組、多糖（0.144 g/kg）組、低聚糖（2.431 g/kg）組和環烯醚萜苷（0.218 g/kg）組，每組8 只。其中，生地黃的劑量均以生藥量計，并按臨床等效劑量的約14 倍劑量計，其他組分按分離出的質量占比計。除對照組外，其余各組大鼠每日9: 00 時在水溫為0 ℃的冰水混合物中游泳至四肢僵硬，迅速撈出并且擦干，連續游泳21 d。大鼠游泳后2 h，各組大鼠ig 相應藥物的水溶液，對照組和模型組ig 等體積的生理鹽水，連續給藥21 d。

2.4 大鼠尿液代謝組學分析

2.4.1 尿液樣本的采集 末次給藥后，大鼠禁食不禁水，收集19: 00 時至次日7: 00 時的尿液。加入等體積的去離子水，渦旋1 min 后，4 ℃、13 500 r/min 離心15 min，取上清液，使用0.22 μm 微孔濾膜濾過。

2.4.2 色譜條件 Waters Acquity UPLC HSS T3 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈（B），梯度洗脫：0～10 min，2%～46.8% B；10～13 min，46.8%～98%B；13～13.5 min，98%～2% B；13.5～14 min，2%～98% B；14～15.5 min，98% B；15.5～16 min，98%～2% B；柱溫40 ℃；體積流量0.3 mL/min；進樣量為2 μL。

2.4.3 質譜條件 采用 UPLC SCIEX-Triple TOF/MS 質譜進行代謝物的分析與鑒定，采用正、負離子模式檢測。離子噴霧電壓4 500 V；源溫500 ℃；霧化氣體壓力344.75 kPa；干燥氣壓413.7 kPa；簾氣體壓力206.85 kPa；去簇電壓100 V；碰撞能40 eV；掃描范圍m/z50～1 500。

2.4.4 數據處理 利用Progenesis QI 將代謝數據進行處理，將數據導入EZinfo 3.0 軟件和SIMCA 14.1軟件，采用主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘-判別分析（ orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）進行數據多元統計分析，篩選出P＜0.05 且變量投影重要性（variable importance in the projection，VIP）＞1 的變量為潛在生物標記物，將潛在生物標記物信息導入工作站，進行物質鑒定。同時借助KEGG、HMDB 和MetaboAnalyst 5.0 等數據庫得到與寒熱藥性關系密切的代謝通路。

2.5 大鼠血清和肝組織中能量代謝相關酶活性的檢測

末次給藥后，大鼠禁食不禁水過夜，ip 10%水合氯醛麻醉，使用含有EDTA 的采血管采集血液。3 500 r/min 離心15 min，分離血漿，于?80 ℃保存。檢測各組大鼠血漿中NE、PA、T3、T4、DA 水平和AchE、SDH 活性。

取50 mg 的肝組織，加入1.5 mL 預冷的PBS溶液，隨后進行充分的研磨，4 ℃、2 000 r/min 離心20 min，取上清液，檢測各組大鼠肝組織中Na+,K+-ATP 酶活性。

2.6 統計學分析

實驗數據采用GraphPad Prism 9 軟件進行單因素方差分析（ANOVA），以±s表示。

3 結果

3.1 生地黃中棉子糖、蔗糖、水蘇糖的含量測定

按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進行測定，記錄峰面積并按外標法計算生地黃中棉子糖、蔗糖、水蘇糖的質量分數分別為2.3、13.8、197.1 mg/g。

3.2 大鼠尿液代謝組學分析

3.2.1 大鼠尿液樣本檢測 對寒證模型大鼠尿液樣本進行正、負離子模式全掃描，得到總離子流圖（圖2）。采用PCA 研究生地黃及其拆分組分對寒證大鼠尿液代謝譜的影響，如圖3-A、B 所示，與模型組比較，生地黃及其拆分組分大鼠尿液樣本發生了變化，兩者明顯分離。OPLS-DA 模型響應的置換檢驗結果如圖3-C、D 所示，觀察到所有排列的R2和Q2均低于原始點，而且Q2的回歸線帶有負截距，這表明所有原始的OPLS-DA 模型都是有效的。

圖2 正 (A)、負離子 (B) 模式下生地黃及其拆分組分的大鼠尿液總離子流圖Fig.2 Total ion chromatograms of Rehmanniae Radix and its split components in urine of rats under positive (A) and negative ion (B) modes

圖3 正、負離子模式下生地黃及其拆分組分的大鼠尿液PCA 圖 (A、B) 及permutation 檢驗圖 (C、D)Fig.3 PCA diagram (A, B) and permutation test chart (C, D) of Rehmanniae Radix and its separated components in urine of rats under positive and negative ion modes

3.2.2 標志物篩選 通過對各組間各離子點量的變化趨勢進行分析，篩選出P＜0.05 且VIP＞1 的代謝物，利用HMDB 數據庫對代謝物進行鑒定。在模型組中鑒定出27 個差異代謝物（表2），水煎液組有16 個差異代謝物（表3），多糖組有36 個差異代謝物（表4），低聚糖組有32 個差異代謝物（表5），環烯醚萜苷組有29 個差異代謝物（表6）。

表2 模型組與對照組大鼠的差異代謝物Table 2 Differential metabolites of rats in model group and control group

表3 水煎液組干預模型大鼠的差異代謝物Table 3 Differential metabolites after intervention with water decoction in model rats

表4 多糖組干預模型大鼠的差異代謝物Table 4 Differential metabolites after intervention with polysaccharide in model rats

表5 低聚糖組干預模型大鼠的差異代謝物Table 5 Differential metabolites after intervention with oligosaccharide in model rats

表6 環烯醚萜苷組干預模型大鼠的差異代謝物Table 6 Differential metabolites after intervention with iridoid glycoside in model rats

3.2.3 代謝途徑的富集分析 通過 KEGG、MetaboAnalyst 5.0 數據庫對生地黃及其拆分組分影響的代謝途徑進行富集分析，結果如圖4 所示，這些代謝物與檸檬酸循環（三羧酸循環），咖啡因代謝，色氨酸代謝，類固醇激素生物合成，戊糖和葡萄糖醛酸相互轉化，嘌呤代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，甘油磷脂代謝，糖酵解/糖異生，乙醛酸和二羧酸代謝，果糖和甘露糖代謝，維生素B6代謝，鞘脂代謝，煙酸和煙酰胺代謝，丙酮酸代謝和纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解等多條能量代謝通路、氨基酸代謝和脂質代謝通路相關。

圖4 模型組 (A)、水煎液組 (B)、多糖組 (C)、低聚糖組 (D)、環烯醚萜苷組 (E) 代謝通路氣泡圖Fig.4 Metabolic pathway bubble diagram in model group (A), Rehmanniae Radix decoction group (B), polysaccharide group (C), oligosaccharide group (D) and iridoid glycoside group (E)

3.3 生地黃及其拆分組分對大鼠肝組織和血漿中物質代謝和能量代謝的影響

如表7 所示，與對照組比較，模型組大鼠肝組織中Na+,K+-ATP 酶活性和血漿中PA、DA、NE、T3、T4水平及SDH 活性顯著降低（P＜0.05），血漿中AchE 活性顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，生地黃水煎液組大鼠肝組織中Na+,K+-ATP 酶活性和血漿中PA、DA、T3、T4水平及SDH 活性均顯著降低（P＜0.05、0.01），血漿中AchE 活性顯著升高（P＜0.05）；多糖組大鼠肝組織中Na+,K+-ATP 酶活性和血漿中PA、T3、T4水平顯著降低（P＜0.05），血漿中AchE 活性顯著升高（P＜0.05）；環烯醚萜苷組大鼠血漿中PA、DA、NE 水平及SDH 活性顯著降低（P＜0.05）；低聚糖組大鼠肝組織中Na+,K+-ATP 酶活性和血漿中PA、DA、NE、T3、T4水平及SDH 活性顯著升高（P＜0.05、0.01），血漿中AchE活性顯著降低（P＜0.05）。

表7 生地黃及其拆分組分對寒證大鼠生理生化指標的影響 (±s, n = 8)Table 7 Effects of Rehmanniae Radix and its split components on physiological and biochemical indicators in rats with cold syndrome (±s, n = 8)

表7 生地黃及其拆分組分對寒證大鼠生理生化指標的影響 (±s, n = 8)Table 7 Effects of Rehmanniae Radix and its split components on physiological and biochemical indicators in rats with cold syndrome (±s, n = 8)

與對照組比較：#P＜0.05；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01。#P < 0.05 vs control group; *P < 0.05 **P < 0.01 vs model group.

組別 劑量/(g·kg?1) Na+,K+-ATP 酶/(μmol·mL?1) PA/(μmol·mL?1) SDH/(U·mL?1) AchE/(pmol·mL?1)對照 — 128.713±6.794 0.259±0.024 24.629±4.367 401.930±60.384模型 — 118.674±9.026# 0.223±0.031# 18.437±6.691# 477.437±66.570#生地黃水煎液 7.560 101.015±9.589** 0.180±0.039* 11.212±5.983* 551.212±65.104*多糖 0.144 108.174±8.318* 0.178±0.037* 13.619±6.443 549.619±66.839*環烯醚萜苷 0.218 110.976±11.236 0.181±0.038* 10.563±6.468* 550.563±79.095低聚糖 2.431 129.615±10.851* 0.268±0.040* 30.618±5.039** 400.618±64.865*組別 劑量/(g·kg?1) DA/(pg·mL?1) NE/(pg·mL?1) T3/(ng·mL?1) T4/(ng·mL?1)對照 — 471.263±63.404 685.245±77.792 2.098±0.174 76.127±11.204模型 — 401.437±65.679# 601.729±75.389# 1.412±0.223# 63.565±12.011#生地黃水煎液 7.560 329.204±61.944* 529.549±78.408 1.023±0.289* 47.356±11.863*多糖 0.144 349.682±66.039 578.865±86.174 1.114±0.213* 48.631±10.122*環烯醚萜苷 0.218 330.112±64.842* 512.874±82.950* 0.991±0.191 52.035±11.301低聚糖 2.431 489.260±68.583* 689.362±78.384* 2.361±0.232** 79.971±10.631*

4 討論

基于匡海學教授創新的中藥性味理論，可以區分中藥性與味的差異，揭示寒熱藥性差異的根本所在，解釋寒熱藥性理論的科學內涵，系統地應用一整套的科學研究模式，通過國家重大基礎研究計劃（973 計劃）項目的課題研究，實現中藥藥性的重大突破。選擇臨床常用的傳統中藥，但是性味和歸經不同具有利水功效的中藥進行理論驗證。并且基本闡明16 種具有利水功效的中藥藥性、藥味、歸經、功效、應用之間的關系，總結歸經規律。構建出主要基于系統生物學的中藥寒（涼）、熱（溫）藥性的評價體系[4]。其中，孫傳鑫[5]依據性味物質基礎可拆分性的理論，采用水煎煮法、水提醇沉法和大孔吸附樹脂等方法的綜合應用，建立川牛膝性味物質基礎可拆分的方法。實驗結果表明多糖組分和脂肪酸酯組分具有促進機體物質代謝和能量代謝的作用，并且影響神經系統和內分泌系統的指標，歸為溫熱性成分。大孔樹脂20%醇洗脫組分和甾酮組分具有抑制機體能量代謝和物質代謝的作用，并且影響內分泌系統和神經系統的指標，歸為寒涼性成分。水煎液組分幾乎無影響。楊欣[6]基于蛋白質組學對熱性中藥（花椒、附子、干姜）和寒性中藥（黃芩、黃連、黃柏）進行系統性研究。熱性中藥通過調節127 個差異蛋白，顯著影響糖代謝和脂質代謝等途徑，并且增加機體能量代謝和物質代謝。寒性中藥通過調節85 個差異蛋白，顯著影響糖代謝和脂質代謝等途徑，減少機體能量代謝和物質代謝。

代謝組學、基因組學和蛋白質組學被科研工作者稱為3 大組學。其中代謝組學是基因組學和蛋白質組學之后用來系統分析包括尿液、血液等多種體液代謝物的組學技術。其主要分析相對分子質量小于1 000 的化合物[7]。代謝組學通過差異代謝物含量的變化能夠客觀地反映整體的變化狀況，能夠很好地應用于中藥具有多靶點的研究領域[8]。

通過代謝組學富集分析，發現生地黃及其拆分組分與寒證大鼠的氨基酸代謝、脂質代謝與能量代謝之間存在密切關聯。在這一關聯中，氨基酸的代謝包括2 個主要方面。首先，它主要用于合成機體自身的蛋白質、多肽及其他含氮物質。其次，氨基酸可以通過轉氨作用、脫氨作用等途徑分解成α-酮酸、胺類和二氧化碳。氨基酸分解后生成的α-酮酸可以轉變為糖、脂類，或者在合成某些非必需氨基酸時，通過檸檬酸循環形成二氧化碳和水，釋放能量。脂質代謝在這一關聯中也扮演著重要的角色。甘油磷脂的分解由多種磷脂酶催化完成。在磷脂酶的作用下，甘油磷脂逐步水解生成甘油、脂肪酸、磷酸以及各種含氮化合物，如膽堿、乙醇胺和絲氨酸等[9-10]。磷脂酶A2 存在于各組織細胞膜和線粒體膜，其作用是催化甘油磷脂中2 位酯鍵水解生成溶血磷脂和多不飽和脂肪酸[11-12]。脂肪酸合成的主要底物是乙酰輔酶A[13]。在供氧充足的情況下，體內脂肪酸分解為二氧化碳和水，釋放大量能量，是體內脂肪酸分解代謝的主要形式。細胞內的 Na+,+K -ATP 酶在水解ATP 的過程中推出3 個Na+離子，同時將2 個+K 離子引入細胞，以維持細胞內外的離子平衡，這是能量代謝的關鍵步驟[14]。同時，PA和SDH 在三羧酸循環中作為關鍵靶點，也在能量代謝中發揮重要作用[15]。實驗結果顯示，水煎液組，環烯醚萜苷組和多糖組的含量較模型組低，具有寒涼性，而低聚糖組較高，具有溫熱性。

在神經-內分泌系統中，乙酰膽堿通過調節多個生理過程直接涉及到對能量代謝的調控，而DA在運動神經系統中對運動的調節和執行有直接影響[16-18]。結果顯示，水煎液組和環烯醚萜苷組的含量較模型組低，具有寒涼性，而低聚糖組較高，具有溫熱性。NE 通過激活脂肪細胞表面的腺苷酸環化酶促使脂肪分解，甲狀腺激素T3和T4通過增加氧耗和產生熱量提高基礎代謝率，共同構成了細胞和整體機體內的復雜而協調的能量代謝網絡[19]。結果顯示，水煎液組、多糖組和環烯醚萜苷組的含量較模型組低，具有寒涼性，而低聚糖組較高，具有溫熱性。

綜上，通過對生地黃及其拆分組分的研究，我們發現符合寒藥作用表達規律的差異代謝物。這些差異代謝物對相關代謝通路產生影響，與之前通過代謝組學方法得出的結論一致，即寒藥/熱藥主要在抑制/促進糖代謝（包括糖異生和磷酸戊糖途徑、花生四烯酸代謝、三羧酸循環、氨基酸代謝等方面發揮作用）。這項研究基于代謝組學的方法，不僅拓展了對所研究中藥功效范圍的認識，同時進一步驗證了中藥性味理論的客觀性。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突