在線固相萃取-超高效液相色譜串聯質譜法快速測定水中10種抗生素

＊蔣昕慶

（湖南水科檢驗檢測有限公司 湖南 410000）

抗生素是生物（包括動物、植物、微生物）自身產生的或者人工合成的，能在低微濃度下有選擇地抑制或影響其他生物功能的有機物質[1]。按照抗生素的化學結構，可以分為6大類：林可霉素類、諾酮類、氨基糖苷類、β-內酰胺類、喹大環內酯類、四環素類[2]。隨著科技發展，近年來常常有濫用抗生素的現象，使大量細菌產生耐藥性，污染水體環境，在水生生物體內富集，通過食物鏈和環境危害人體健康。四環素、土霉素、金霉素、磺胺甲惡唑等抗生素在地表水、地下水、自來水中均有檢出[3-7]。目前，用來檢測殘留抗生素的主要技術有免疫學分析法、微生物法和儀器分析法等，水體中多采用高效液相色譜與串聯質譜聯用（HPLC-MS/MS）技術、高效液相色譜儀與紫外檢測儀/熒光檢測儀聯用技術（HPLC-UV/HPLC-FD）。本文采用在線固相萃取-超高效液相色譜串聯質譜聯用儀（HPLC-MS/MS）測定水中已發現對水體有污染的10種抗生素[8]，操作簡單，測定結果準確，有良好的應用效果。

1.實驗

（1）儀器與試劑。在線固相萃取-超高效液相色譜-串聯四級桿質譜聯用系統（美國Thermo公司），包括二元高壓泵、四元低壓泵、在線脫氣機、柱溫箱、自動進樣器；一體式氮氣發生器；超聲波清洗器。

喹諾酮類、磺胺類、大環內酯類、四環素類4大類10種抗生素標準物質（德國Dr.Ehrenstorfer公司）；乙腈、甲酸均為HPLC級；流動相超純水為屈臣氏蒸餾水。

（2）標準溶液的配制。標準儲備液（100mg/L）：分別稱取10種抗生素標準品1mg，用乙腈分別溶解并定容至10mL，-18℃儲存。

混合標準儲備液（1mg/L）：分別移取0.1mL標準儲備液于10mL容量瓶中，用乙腈定容。

（3）在線固相萃取條件。萃取柱為Hypersil GOLD aQ 20mm×2.1mm，粒徑12μm；流動相：A超純水，B含0.1%甲酸的乙腈，洗脫速率為1.0mL/min，梯度洗脫程序：0～5.5min為0%B，5.51～8.5min為100%B，10.7min為0%B。

表1 在線固相萃取條件

（4）色譜條件。色譜分析柱為Hypersil GOLD 50mm×2.1mm，粒徑3μm；柱溫：30℃；進樣量：1mL；流動相：A超純水，B含0.1%甲酸的乙腈，洗脫速率為0.3mL/min，梯度洗脫程序：0～0.5min為95%A、5%B，2～3.5min為90%A、10%B，4.5～7min為5%A、95%B， 7.01～10.5min為95%A、5%B。

表2 色譜條件

（5）質譜條件。鞘氣壓力：37MPa；輔助氣壓力：12MPa；離子傳輸毛細管溫度：300℃；霧化溫度：350℃；噴霧電壓：（+）3500V；碰撞氣壓力：1.5MPa。采用選擇反應監測模式（SRM）檢測。其他參數見表3。

表3 定量離子選擇

2.結果及討論

(1)樣品前處理條件優化

喹諾酮類、磺胺類、大環內酯類、四環素類4個類別的抗生素分子結構各不相同，同時保證提取效果，難度較大。本實驗比較了超純水提取、純乙腈提取、乙腈-超純水提取的提取效果，結果發現相較于另外兩種提取方式，超純水的提取效果較好，回收率也更高。用純乙腈或者乙腈-超純水提取，磺胺類物質的回收率較低，響應差，很難在液質聯用儀上檢測出來。

(2)質譜參數優化

通過手動進樣針采用連續注射的方式，分別將質量濃度為10mg/L的10種抗生素標準溶液通過管路直接注入電噴霧離子源，在正離子模式（HESI+）下優化鞘氣壓力、離子傳輸毛細管溫度、霧化溫度、噴霧電壓等參數，得到10種抗生素最大響應值以后，通過MRM（多反應監測）系統優化碰撞能，得到相應的母離子、定量子離子和定性子離子。

(3)標準曲線及檢出限

用超純水稀釋混合標準儲備液（1mg/L）制成濃度范圍為1.0～10.0ng/mL的系列標準使用溶液，根據MDL=t(n-1,0.9)×SD計算本方法的檢出限，根據RQL=4×MDL計算測定下限。結果表明10種抗生素在1.0～10.0ng/mL濃度范圍內線性良好，相關系數大于0.99，檢出限范圍0.126～0.227ng/mL，且10種抗生素均能完全分離，分離度高。詳見表4。

表4 標準曲線線性及檢出限

表5 方法精密度（n=7）

幾種典型抗生素質譜圖：

圖1 4ng/mL磺胺嘧啶質譜圖

圖2 4ng/mL頭孢氨芐質譜圖

圖3 4ng/mL氧氟沙星質譜圖

圖4 4ng/mL四環素質譜圖

圖5 4ng/mL羅紅霉素質譜圖

(4)方法的回收率和精密度

①方法空白試驗。采用本文所述方法進行空白試驗，10種抗生素均未檢出。

②方法精密度。分別配制1.00ng/mL、2.00ng/mL和8.00ng/mL的標準使用液，上機測定7次，RSD范圍為0.5%～6.7%。

③方法回收率。加標回收樣品采用從南方某城市采集的無抗生素檢出的出廠水、管網水和原水，分別加入標準混合液，使最終濃度為2ng/mL和8ng/mL，上機測定，結果見表6。兩種濃度的回收率范圍為71.4%～104.8%。

表6 方法回收率

3.結論

本文采用在線固相萃取-超高效液相色譜串聯質譜聯用技術，建立了一種快速檢測水體中多種類抗生素的檢測方法，檢出限低、回收率高、重復性好，可應對不同分子結構的抗生素，為進一步研究水體中抗生素的殘留及去除提供參考依據。