奧拉西坦對尼莫地平大鼠體內藥動學影響

張在美 周偉 付常芳 李玉琴

1. 山東第一醫科大學（山東省醫學科學院）藥學院，山東 濟南 250117；2. 沈陽藥科大學藥學院，遼寧 沈陽 117004； 3. 菏澤衛生學校醫藥技術系，山東 菏澤 274000

血管性癡呆是由腦血管病變或血管危險因素引起的腦損傷所導致的癡呆，主要表現為記憶喪失、認知能力嚴重減退，嚴重影響患者的正常生活［1-2］。研究認為，血管性癡呆的發生與腦組織中膽堿能系統功能異常、突觸改變、血管相關基因異常等有關［3］。目前尚未上市治療血管性癡呆的特效藥，臨床上常用尼莫地平、奧拉西坦和鹽酸多奈哌齊等藥物改善血管性癡呆患者的癥狀。但血管性癡呆發病機制復雜，單一用藥存在起效較慢，療效較差等缺點，因此常采用聯合用藥的方式治療血管性癡呆。

根據這種分配模式，引用鏈末端的最終獲獎方案的作者將獲得該方案全部獎金的1/3，剩余2/3則被鏈上所有作者(包括最終獲獎方案作者)均分。如果一個作者重復出現在不同的鏈環中，則其獎金數額將被累加。

航飛數據獲取后，采用內業數據處理軟件如Pix4Dmapper、ContextCapture等進行無人機數據處理，主要流程為：導入航飛的原始影像數據、POS數據，進行影像預處理，修正影像畸變和相機檢校；自動進行連接點提取和自由網平差，進行影像相對定向；加入外業控制點，進行區域網平差、糾正，進行絕對定向；生成正射影像圖(DOM)、數字表面模型(DSM)、點云、實景三維模型等數據；數字高程模型(DEM)、數字線劃圖(DLG)則要借助立體測圖軟件、地理信息系統軟件以及外業調繪等進一步生產。無人機航測內業數據生產流程，如圖2所示。

尼莫地平作為二氫吡啶類鈣通道阻滯劑，通過阻斷鈣離子內流從而發揮擴張血管、解除血管痙攣的作用［4］。尼莫地平的脂溶性較強，可通過血腦屏障，對腦血管具有較強的選擇性，因此尼莫地平可調節腦血流量，改善腦血液循環，從而改善腦神經狀態［5］。奧拉西坦作為神經營養性藥物，對神經細胞的存活具有調節作用，其可促進神經生長，恢復神經功能，并可通過激動乙酰膽堿系統，提高腦部代謝功能，促進腦神經細胞的修復和激活［6］。

式中：Δy為屈服位移，用能量法確定[10]；Δu為極限位移，取骨架曲線上水平荷載下降至最大荷載的85%時對應構件的位移.

有研究比較了尼莫地平單獨給藥與奧拉西坦聯用尼莫地平兩種不同治療方案下患者的認知水平、癡呆程度、日常生活能力、氧化應激水平、血液流變學等指標，結果表明奧拉西坦與尼莫地平聯合給藥治療血管性癡呆效果優于尼莫地平單獨給藥［7-8］。但目前有關奧拉西坦對尼莫地平藥動學影響的相關研究未見報道。因此，本實驗擬建立測定大鼠血漿中尼莫地平含量的超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography， UPLC）法，并研究奧拉西坦對尼莫地平在大鼠體內藥動學影響，以期為臨床上兩藥的合理聯用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

1.4.5 穩定性 取大鼠空白血漿100 μL，分別精密加入“1.3.1”尼莫地平系列工作液100 μL，配制成低、中、高（100、500、3 000 mg·L-1） 3個質量濃度的血漿樣品，考察在自動進樣室8 h、-20 ℃凍融循環3次、-20 ℃放置7 d的穩定性。

1.1.2 實驗儀器 Waters Acquity UPLC H-class超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；KQ3200 E型數控超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）；SHIMUADZU AUW220D電子天平（日本島津公司）；Thermo Scientific Fresco21微量離心機（賽默飛世爾科技中國有限公司）；XW-80A旋渦混合儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；HP-5016SY氮吹儀（上海濟成分析儀器有限公司）。

1.1.3 實驗試劑 尼莫地平對照品（100 mg∕支，批號112886，南京森貝伽生物科技有限公司）；尼莫地平原料藥（純度98%，批號C12229356，上海麥克林生化科技有限公司）；奧拉西坦原料藥（純度95%，批號K1816245，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；羧甲基纖維素鈉（純度99%，批號140701，重慶天潤生物制品有限公司）；甲醇（賽默飛世爾科技中國有限公司）；乙腈（賽默飛世爾科技中國有限公司）；甲酸（上海麥克林生化科技有限公司）。

作為首家進入云南的外資法人銀行分行，恒生銀行昆明分行早在2008年11月就已開業，這也是恒生銀行在西部地區設立的首家分行。隨后幾年，匯豐銀行（中國）有限公司昆明分行、東亞銀行昆明分行、渣打銀行（中國）有限公司昆明分行等相繼開業。

林德認為，國際貿易是國內貿易的延伸，產品的出口結構、流向及貿易量的大小決定于本國的需求偏好，而一國的需求偏好又決定于該國的平均收入水平。這是因為三個方面的原因：

1.2 色譜條件

1.3.3 尼莫地平灌胃液的配制 精密稱取尼莫地平原料藥0.1 g，置于10 mL棕色容量瓶中，加入適量0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，定容至刻度，充分振搖，使尼莫地平均勻地分散于0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，得10 g·L-1尼莫地平灌胃液，在4 ℃下冷藏備用。

1.3 溶液配制及血漿樣品處理

1.3.1 尼莫地平對照品溶液配制 精密稱取尼莫地平對照品10 mg，置于50 mL棕色容量瓶中，用適量甲醇溶解，定容至刻度，搖勻，得200 μg·mL-1尼莫地平對照品溶液。精密量取尼莫地平對照品溶液適量，將其用甲醇分別稀釋成濃度為50、100、200、500、1 000、3 000、5 000 mg·mL-1的對照品工作液。以上溶液均于4 ℃下冷藏保存備用。

1.3.2 0.5%羧甲基纖維素鈉溶液的配制 精密稱取羧甲基纖維素鈉0.5 g，置于100 mL容量瓶中，用適量熱水溶解，冷卻到室溫，用純水定容至刻度，搖勻，得0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，在4 ℃下冷藏備用。

使用Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm × 100 mm， 1.7 μm），0.1%甲酸水-乙腈（40∶60）作為流動相，檢測波長235 nm，柱溫35 ℃，進樣室溫度10 ℃，進樣量2 μL，流速0.25 mL·min-1。

1.4.3 精密度 取大鼠空白血漿100 μL，分別精密加入“1.3.1”項下尼莫地平系列工作液100 μL，配制成低、中、高（100、500、3 000 mg·L-1） 3個質量濃度的血漿樣品，按照“1.3.5”項下處理后，按照“1.2”項下色譜條件，測定尼莫地平的峰面積，考察日內精密度，連續測3 d，考察日間精密度。

1.3.5 血漿樣品處理 取100 μL大鼠空白血漿置于具塞離心管中，加入300 μL甲醇，渦旋2 min，于4 ℃，13 000 r·min-1下離心10 min，取上清液于離心管中，在40 ℃水浴中用溫和氮氣吹干，加100 μL甲醇復溶，渦旋2 min，于4 ℃，13 000 r·min-1下離心10 min后，將上清液經0.22 μm微孔濾膜過濾后，進樣分析。

1.4 方法學驗證

1.4.1 選擇性 取100 μL大鼠空白血漿，加入“1.3.1”項下尼莫地平對照品溶液適量，配制成500 mg·L-1的模擬血漿樣品，將空白血漿樣品、模擬血漿樣品和大鼠灌胃給藥后0.5 h的血漿樣品，按照“1.3.5”項下方法處理后，按照“1.2”項下的色譜條件進行測定，記錄色譜圖。

1.4.2 標準曲線與定量下限 分別于100 μL大鼠空白血漿加入“1.3.1”項下尼莫地平系列工作液100 μL，再加入200 μL甲醇后，其余按“1.3.5”項下方法處理，得到尼莫地平濃度分別為50、100、200、500、1 000、3 000、5 000 mg·L-1的血漿樣品溶液，照“1.2”項下色譜條件，記錄色譜圖與峰面積，以血漿中尼莫地平濃度為橫坐標（X），以尼莫地平峰面積為縱坐標（Y），用加權最小二乘法（權重w = 1∕X2）進行線性回歸，得到標準曲線方程。

每一個分布式的標準RFID網關最多可連接兩個Q80U讀寫頭，并設置4路I/O信號接口，從而將光電開關等傳感器信號就近接入，以便系統對RFID讀寫頭實現精細化控制。

1.3.4 奧拉西坦灌胃液的配制 精密稱取奧拉西坦原料藥1.25 g，置于25 mL棕色容量瓶中，用適量生理鹽水溶解后定容至刻度，搖勻，得50 g·L-1奧拉西坦供試品試液，在4 ℃下冷藏備用。

除社會環境外，家庭環境對當代大學生就業觀念的形成也具有重要影響。家庭是學生學習生活的重要場所，父母是學生人生道路上的第一任指導老師，大學生的就業觀念極易受到家庭教育觀念及家長教育思想的影響。由于大學生涉世未深，對社會就業實踐也缺乏一定經驗，在進行就業選擇的時候，往往會在很大程度上聽取家長的意見?，F實當中，即使部分學生沒有征求家長的意見，大多數家長也會干預學生的就業選擇，而不同家庭的教育背景及文化程度等都會給大學生就業觀的形成帶來直接性影響。

1.4.4 提取回收率 取3份大鼠空白血漿100 μL，分別精密加入“1.3.1”項下尼莫地平系列工作液100 μL，配制低、中、高（100、500、3 000 mg·L-1）濃度的血漿樣品，按“1.3.5”項下處理后，照“1.2”項下色譜條件，測定血漿樣品中尼莫地平的峰面積 A；另取低、中、高（100、500、3 000 mg·L-1）濃度的尼莫地平對照溶液，照“2.2”項下色譜條件，測定峰面積 B，提取回收率= A∕B × 100%。

1.1.1 實驗動物 清潔級SD雄性大鼠，體質量230 ～ 250 g，由遼寧長生生物技術股份有限公司提供［許可證號SCXK（遼）2020-00001］。

1.5 藥動學

使用DAS 2.0藥動學分析軟件，采用統計矩模型，對藥動學參數進行擬合處理，結果以表示。使用SPSS 26.0 軟件對兩組間藥動學參數的均值進行獨立樣本t檢驗分析。檢驗水準α= 0.05。

1.5.2 血漿樣品測定和數據處理 將“1.5.1”項下于不同時間點采集的血漿樣品，按照“1.3.5”項下方法處理，按照“1.2”項下條件進行測定，記錄血漿中尼莫地平峰面積。將血漿中尼莫地平峰面積代入標準曲線方程，計算得到不同時間點血漿中尼莫地平的濃度。以時間為橫坐標，以血漿中尼莫地平的濃度為縱坐標，繪制血藥濃度-時間曲線。

1.6 數據處理與統計學分析

1.5.1 給藥方案和血漿樣品采集 健康雄性SD大鼠12只，隨機分成尼莫地平組（對照組）和奧拉西坦聯用尼莫地平組（聯合用藥組），每組6只。對照組灌胃生理鹽水，聯合用藥組灌胃奧拉西坦200 mg·kg-1，連續7 d。第7天給藥完成后，各組均禁食不禁水。第8天常規給藥后，立即灌胃尼莫地平（20 mg·kg-1），于給藥后0.083、0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8、10、12、24 h經眼內眥取血，置于含有肝素的離心管中，于4 ℃，3 000 r·min-1離心10 min，吸取上清于離心管中，于-20 ℃冷凍保存。

教育心理學告訴我們，相容的師生關系直接影響著學生的學習情緒，師生心理相容能提離教學效果。學生喜歡這位老師，就相信老師講授的道理，愿意學習老師講授的知識，自然就對老師講的課表現出濃厚的興趣，這就是我們常說的”愛屋及烏”。相反，如果學生不喜歡，甚至害怕這位老師，要想他們對這位老師所授的課程感興趣是很困難的?？梢?，激發學生的學習興趣，必須在教學中培養學生對老師的親切感，創造一個師生心理相容的良好環 境。教師要做學生的知心朋友，建立起相互信任、尊重、幫助、團結、友愛、共同進步的良好關系。學生親其師，才能信其道，樂其道。

2 結果與分析

2.1 方法學驗證

2.1.1 專屬性 選擇性結果如圖1所示，尼莫地平峰形較好，血漿中的內源性物質不干擾尼莫地平的測定，表明分析方法的專屬性良好。

圖1 尼莫地平專屬性色譜圖

2.1.2 標準曲線與定量下限 線性回歸結果如圖2所示，回歸方程為? = 26.061X－307.974，R2=0.991，標準曲線各濃度點的計算值與標示值之間的偏差在±15%以內，定量下限的偏差在±20%以內。結果表明，尼莫地平在50 ～ 5 000 mg·L-1濃度范圍內與其峰面積線性關系良好，其中尼莫地平的定量下限為50 mg·L-1。

所有人都唏噓起來。細婆把面放在桌上，對阿東說：“給阿里宵個夜。這伢傷了心?！苯疰ひ步兄骸鞍⒗锔绺?，明天跟我玩哦!”老巴向鄰居們的關心表達著謝意，一一送他們出門。

圖2 線性回歸圖

2.1.3 精密度 精密度結果如表1所示。結果表明，尼莫地平低、中、高（100、500、3 000 mg·L-1） 3個濃度質控樣品的日內、日間精密度的相對標準偏差(relative standard deviation， RSD)均在15%的范圍內，表明該分析方法的精密度良好。

表1 尼莫地平精密度考察結果

2.1.4 提取回收率 尼莫地平低、中、高（100、500、3 000 mg·mL-1） 3個濃度質控樣品的提取回收率結果如表2所示，各濃度的質控樣品的提取回收率在83.53% ～ 87.52%范圍內，RSD ＜ 15%，尼莫地平的提取回收率較高。

表2 尼莫地平提取回收率考察結果

2.1.5 穩定性 計算置于自動進樣室8 h內、-20 ℃凍融循環3次、-20 ℃放置7 d 3種不同條件下大鼠血漿中的尼莫地平濃度與標示濃度的比值。結果顯示，在上述條件下各濃度質控樣品的濃度與標示濃度的偏差均在±15%范圍內，表明尼莫地平血漿樣品在上述3種條件下穩定性良好（表3）。

表3 尼莫地平血漿樣品穩定性考察結果（）

表3 尼莫地平血漿樣品穩定性考察結果（）

濃度∕（mg·L-1）100 500 3 000進樣室8 h內93.49 ± 1.02 92.12 ± 1.45 86.88 ± 2.87凍融循環85.14 ± 1.50 86.53 ± 5.52 87.89 ± 3.07凍7 d 92.16 ± 1.67 90.78 ± 3.26 87.19 ± 4.32

2.2 藥動學結果

藥動學結果如圖3和表4所示，與對照組相比，聯合用藥組大鼠AUC（0-24）、Cmax顯著升高（P＜ 0.01、P＜ 0.05），Tmax、Vz∕F顯著降低（P＜ 0.01、P＜ 0.05），AUC（0-∞）略有升高，MRT（0-24）、MRT（0-∞）、CLz∕F、t1∕2z略有降低，但AUC（0-∞）、MRT（0-24）、MRT（0-∞）、t1∕2z和CLz∕F的變化無統計學意義。

表4 大鼠灌胃尼莫地平后的主要藥動學參數

圖3 大鼠體內尼莫地平血藥濃度-時間曲線

3 討 論

3.1 血漿樣品處理方法的選擇

生物樣品常用的預處理方法有：（1）直接沉淀法：該法操作簡單、快速，是血漿樣品預處理最常用的方法，常用的沉淀劑為甲醇和乙腈［11］；（2）固相萃取法：該法可同時完成樣品富集與凈化，可大大提高檢測靈敏度，但固相萃取小柱成本較高；（3）化學衍生化法：該法能夠提高檢測的靈敏度，但衍生化試劑較貴且操作較為繁瑣。

直接沉淀法具有操作簡單、快速的優點，因此本實驗采用直接沉淀法對血漿樣品預處理。因尼莫地平不溶于水，易溶于甲醇、乙腈，所以分別考察了甲醇、乙腈的提取回收率。結果顯示，用甲醇、乙腈作沉淀劑時的提取回收率分別為84.4%、79.2%，因此選擇甲醇作為本實驗的沉淀劑。但在實際樣品含量測定過程中無法準確測定血漿樣品中尼莫地平的含量，分析原因為使用直接沉淀法對血漿樣品進行處理會稀釋血漿中尼莫地平的濃度。因此為提高方法靈敏度，用甲醇將蛋白沉淀后，將上清液使用氮氣吹干濃縮，再使用溶劑復溶。

復溶溶劑對峰形美觀程度具有一定影響。在尼莫地平藥動學相關研究中，一般采用流動相作為復溶溶劑，如甲醇∶4 mmol·L-1醋酸銨水溶液（含0.4%甲酸） = 80∶20［9］、乙腈∶水 = 43∶57［10］、甲醇∶水 = 71∶29［11］等，也有研究采用甲醇作為復溶溶劑［12］。Wang等［13］研究了用甲醇作為沉淀劑沉淀后用不同比例的甲醇-水溶液的復溶效果，結果發現，使用30%甲醇作為復溶溶劑效果最好。因此，本實驗考察了純甲醇、流動相（乙腈∶0.1%甲酸水溶液 = 60∶40）、30%甲醇作為復溶溶劑時尼莫地平的峰形。結果顯示，純甲醇作為復溶溶劑時的尼莫地平的峰形優于流動相和30%甲醇作為復溶溶劑時的峰形，而且以純甲醇作為復溶溶劑時的提取回收率最高，因此選擇純甲醇作為本實驗的復溶溶劑。

3.2 藥動學

藥動學研究結果顯示，與對照組相比，聯合用藥組AUC（0-24）、Tmax、Vz/F、Cmax等藥動學參數均有所改變，表明奧拉西坦影響了尼莫地平在大鼠體內的藥動學。與對照組相比，聯合用藥組Vz∕F顯著增加（P ＜0.01），Vz∕F代表藥物在體內達到動態平衡后體內藥量與血藥濃度比值，在體內藥量相同的情況下，Vz∕F減小表明血藥濃度增大，這與聯合用藥組Cmax顯著增大（P ＜0.01）的結果一致。與對照組相比，聯合用藥組AUC（0-24）顯著增加（P＜ 0.05），表明尼莫地平與奧拉西坦聯合使用后，尼莫地平在大鼠體內生物利用度有所增加。P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）是一種外排蛋白，它可以將細胞內藥物排到細胞外，使細胞內的藥物濃度降低，如腸上皮細胞膜上的P-gp可將腸上皮細胞內的藥物排出到腸腔，導致藥物的吸收減少，生物利用度降低［14］。研究表明，尼莫地平是外排轉運蛋白P-糖蛋白（P-gp）和細胞色素P450酶（CYP3A4）的底物，P-gp抑制劑可通過抑制腦中尼莫地平的消除來提高大鼠腦中的濃度，表明P-gp抑制劑對尼莫地平藥動學具有一定影響［14-16］。但目前尚未有文獻報道有關奧拉西坦對P-gp的調控作用，因此奧拉西坦促進尼莫地平在大鼠體內的吸收、提高生物利用度的機制有待進一步研究。MRT代表藥物分子在體內駐留時間的平均值，聯合用藥組較對照組的MRT（0-24）、MRT（0-∞）、t1∕2z有所縮短，表明奧拉西坦可加速尼莫地平在大鼠體內的代謝，縮短其在體內作用時間。尼莫地平在體內的代謝主要與CYP3A4有關，但目前只有奧拉西坦對經肝微粒體酶CYP2C9代謝的藥物的相關研究［17］，尚未有文獻報道有關奧拉西坦對CYP3A4代謝酶影響的研究，因此奧拉西坦加速尼莫地平在大鼠體內代謝的機制有待進一步研究。

本實驗以大鼠為實驗對象，研究了奧拉西坦對尼莫地平藥動學的影響。藥動學結果提示，奧拉西坦對尼莫地平在大鼠體內藥動學產生了影響，奧拉西坦可加快尼莫地平的吸收速度、增加尼莫地平的生物利用度，在一定程度上加快了尼莫地平在大鼠體內的代謝。但人與大鼠間藥物吸收代謝機制有所不同，存在種屬差異，因此奧拉西坦對尼莫地平在人體內的藥動學影響有待進一步研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突