細胞焦亡在糖尿病創面愈合中的研究進展

竺仕林，葛星月，楊雅量，李文武，姚明哲，唐乾利

（1.右江民族醫學院研究生院，廣西 百色 533000；2.右江民族醫學院/廣西高校桂西地區高發病防治重點實驗室，廣西 百色533000）

糖尿病患者損傷后創面愈合延緩或終年難愈，是糖尿病比較嚴重的并發癥之一，也是糖尿病患者致殘的重要原因之一，嚴重威脅著患者的健康。糖尿病創面難以愈合的機制之一是過度的炎癥反應，而此與細胞焦亡過程有關。細胞焦亡是一種以Gasdermin 為關鍵介導因子的程序性細胞死亡過程［1］，是機體很重要的一種非特異性免疫機制，其能夠在感知外源性病原體的同時識別內源性危險信號，并拮抗這些危險因素。焦亡的特征是Gasdermin 家族蛋白介導的孔形成、細胞裂解和促炎細胞因子的釋放。當發生細胞焦亡時，細胞膜上會出現1～2 nm 的小孔，并伴隨細胞腫脹，胞內物質（如炎癥因子、炎癥小體復合物等）經由小孔流出，隨后細胞膜裂解，染色質降解，細胞死亡，進而誘發級聯放大的炎癥反應。近年來，許多研究者將細胞焦亡通路作為糖尿病創面治療中的重要關注對象，通過拮抗細胞焦亡以達到促進糖尿病創面愈合的效果。本研究對近兩年來細胞焦亡在糖尿病創面愈合中作用的相關研究進行綜述，討論糖尿病創面中靶向細胞焦亡的分子與通路，以期為臨床治療糖尿病創面提供新的思路和突破口。

1 細胞焦亡的起源和發展

1989 年，Black 等［2-4］首次發現了一種能夠特異性切割白介素1β（IL-1β）前體上特定位點并將其轉變為成熟IL-1β 的蛋白酶。起初研究者將其稱為白細 胞 介 素-1 轉 化 酶（interleukin-1 converting enzyme， ICE），隨后這種特異性蛋白酶被命名為半胱天 冬 酶-1（Caspase-1）［5，6］。1992 年，Zychlinsky 等［7］發現志賀菌能夠誘導巨噬細胞的“凋亡”，并且這種細胞的“凋亡”與Caspase-1 有著密不可分的聯系。2001 年，D'Souza 等［8］認為這種新發現的“凋亡”與之前所認識的細胞凋亡和細胞壞死均有所不同，其特征是在細胞質膜中形成孔，細胞腫脹和破裂以及細胞溶質內容物滲漏，是溶解性和炎性細胞死亡的一種形式，于是將這種炎癥程序細胞死亡定義為“細胞 焦 亡”（pyroptosis）。2015 年，2 篇 發 表 于Nature的文章認為Gasdermin D 被炎性Caspase 裂解然后產生的一個小分子結構能夠使細胞膜上出現孔洞進而導致細胞焦亡［9，10］。在后續的研究中發現焦亡在宿主防御細胞內病原體感染和各種非感染性疾病中起著重要作用，可發生于不同類型的細胞中。此后，關于細胞焦亡的研究進入了高速發展時期，細胞焦亡成為了免疫領域的研究熱點。

2 細胞焦亡相關蛋白分子

2.1 Caspase 家族

最初，有學者發現ICE 和線蟲細胞凋亡基因編碼的cell death mutant 3（CED-3）具有相同的起源［11］，于是將其命名為CED-3/ICE 家族蛋白，但隨后又發現了一系列的同源蛋白，遂將其統一命名為Caspase1～10［12］，其中“c”意味著它們擁有半胱氨酸（cysteine）蛋白酶的催化功能，“aspase”指它們可以作用于天冬氨酸殘基，這也是這類蛋白酶特有的作用機制。之后，研究者們又發現了鼠源Caspase11和Caspase12，牛 源Caspase13，人 源Caspase14。Caspase 家族蛋白在哺乳動物細胞的凋亡和焦亡中起著不可或缺的作用。在細胞凋亡中，一部分Caspase 如Caspase-8/9/10 可以識別來自細胞內外的危險信號進而激活另一部分Caspase 如Caspase-3/6/7，隨后切割和激活下游因子引發細胞凋亡［13］。而在細胞焦亡中起重要作用的Caspase 被稱為炎性Caspase，包括Caspase-1/4/5/11/12/13/14［14］，其中導致細胞焦亡發生最關鍵的因子是Caspase-1 和Caspase-4/5/11［15］。Caspase 家族見圖1。

圖1 Caspase 家族Fig 1 Caspase family

2.2 Gasdermin 家族

Gasdermin 的名字來源于僅在小鼠的胃腸道（局限于食道和胃）和皮膚上皮細胞中低水平表達的基因Gsdma1［16］。其中，在人體各器官中進行表達 的Gasdermin 家 族 成 員 有GSDMA，GSDMB，GSDMC， GSDMD， GSDME（DFNA5）和PJVK（DFNB59），而在小鼠各器官中進行表達的Gasdermin 家 族 成 員 有Gsdma1，Gsdma2，Gsdma3， Gsdmc1， Gsdmc2， Gsdmc3， Gsdmc4，Gsdmd［17］。其中PJVK 只含有一個N 端結構域，其余成員則含有2 個結構域分別為N 端結構域和C 端結構域，這兩個結構域在生理狀態下相互結合抑制。其中N 端結構域的大量表達可以產生細胞膜的破孔作用導致細胞焦亡［18］。被關注最多的是，GSDMD 能被活化的Caspase-1/4/5/11 切斷結構域連接點而產生上述2個結構域［9］，其中N 端可以和多種細胞膜上的脂類物質結合形成寡聚體，然后形成孔洞，進而破壞細胞膜［18］。有報道指出，GSDME 的2 個結構域之間包含一個可以被人為切割的位點，研究者發現可以利用Caspase-3 切割該位點產生活化的N 端結構域從而人為誘導細胞焦亡的發生［19］。

3 細胞焦亡分子機制通路

3.1 炎癥小體激活的焦亡

3.1.1 炎癥小體 炎癥小體是多蛋白復合物，在感知病原體相關分子模式 （PAMP）或危險相關分子模式（DAMP）后聚集在細胞質中，炎癥小體的激活是 焦 亡 的 起 點［20］。2002 年，Martinon 等［21］提 出 了“炎癥小體”的概念，認為這個由納赫特（domain present in neuronal apoptosis inhibitory protein（NAIP）， CIITA， HET-E， TP1， NACHT）家族成員NALP1、含有CARD 的凋亡相關斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein contain a CARD， ASC）和Caspase-1 組成的蛋白復合物介導了Caspase-1 的激活和IL-1β 的成熟，并類比細胞色素-c（Cytochrome-c），凋亡酶激活因子-1（Apaf-1）和Caspase-9 形成的凋亡小體將其命名為炎癥小體。炎癥小體中的模式識別受體（PRRs）主要包含：NLRP1， NLRP3， NLRP6， NLRP7， NLRC4， NLRC5和PYRIN（pyrin and HIN domaintein）以及AIM2（absent in melanoma 2）等［22］。

3.1.2 經典炎癥小體信號通路 胞質中存在的模式識別受體如NLRP3 等可以識別外源微生物相關的保守分子（PAMPs）或損傷相關的內源信號（DAMPs），隨后活化并寡聚，接著結合接頭蛋白ASC 和Caspase-1 組裝形成炎癥小體，然后Caspase-1 會切割GSDMD，加工一些炎癥因子如pro-IL-1β 和pro-IL-18。GSDMD 被 切 割 后 產 生 的N 端結構域會將細胞膜破孔透化形成GSDMD 孔，同時促進成熟的IL-1β 和IL-18 的釋放，之后細胞逐漸裂解，引發細胞焦亡。在細胞膜沒有完全裂解之前，GSDMD 孔還可以釋放許多大分子物質或結合物比如白細胞介素1α（IL-1α），危險分子如高遷移率族蛋白-1（HMGB-1），甚至整個炎癥小體復合物［23，24］。

3.1.3 非經典炎癥小體信號通路 Caspase-4/5/11可以直接識別來自革蘭陰性菌的脂多糖（LPS）隨后活化并寡聚，其切割GSDMD 產生的N 端結構域有細胞膜破孔性并允許鉀離子的釋放，在此期間一些特定的炎癥小體如NLRP3 也能因此活化進而促進炎癥因子的成熟。同時，GSDMD 孔使得細胞膜裂解導致細胞焦亡，許多細胞因子得以釋放［24］。

3.2 非炎癥小體激活的焦亡

在生理狀態下，GSDMD 的2 個結構域能夠互相抑制而不表現出生物學作用，但是被激活的Caspase-1/4/5/11 可以特異性識別其結合位點并破壞從而獲得具有細胞膜破孔性的N 端結構域，進而引發細胞焦亡。研究者發現，將GSDMD 的切割位點改為Caspase-3 識別序列，可以使得原本正在進行的Caspase-3 介導的細胞凋亡轉變為焦亡，說明N 端結構域本身就可以引發細胞焦亡［9］。此外，GSDMD的同族蛋白GSDME 及其切割產生的N 端結構域也具有這樣的生物學特點［19］。

3.3 Gasdermin D-N 端結構域的負反饋調控作用

最新的研究表明，GSDMD 的N 端結構域可以直接靶向作用并抑制Caspase-1/11 從而緩和炎癥小體的激活以抑制焦亡下游環節的觸發。研究者確認了GSDMD 的N 端結構域的β1-β2 環中的RFWK模體為關鍵分子結構，并設計了一種類似分子表現出很強的抗炎作用［25］。

4 糖尿病創面中靶向細胞焦亡的分子與通路

4.1 間隙連接蛋白（Cx43）/活性氧（ROS）信號通路

研究表明，活性氧在NLPR3 炎癥小體的激活過程中起著非常重要的作用［26］，大量的活性氧可誘導硫氧還蛋白相互作用蛋白（TXNIP）從細胞核轉位進入細胞質并結合NLRP3 蛋白從而激活NLRP3炎癥小體［27］促進細胞焦亡。而活性氧是少數幾種可以通過由血管間隙連接通訊的主要連接蛋白Cx43［28］組 成 的Cx43 通 道 來 傳 遞 信 號 的 分 子 之一［29］。近年來，生物活性玻璃在軟組織，尤其是創面修復領域展現出了巨大的前景［30］。有研究團隊結合體內實驗和體外實驗發現生物活性玻璃（bioactive glass，BG）可以通過下調Cx43/ROS 信號通路抑制內皮細胞焦亡來促進創面愈合。生物玻璃與創面體液接觸后，通過離子交換在創面形成碳酸羥基磷灰石（hydroxy-carbonate-apatite，HCA）結構，下調內皮細胞上Cx43 蛋白以降低ROS 活性水平，從而抑制NLRP3 炎癥小體對caspase-1 的激活，減弱GSDMD 的破孔活性，最終抑制內皮細胞的焦亡，促進血管的形成加速創面愈合［28］。而活性氧在作為NLPR3 的“觸發器”的同時，也大量產生于炎癥反應后期免疫細胞激活和浸潤的過程中，是NLPR3 的“效 應 器”［26］。抑 制 活 性 氧 的 生 成 不 僅 可 以減少其對細胞的直接損傷，更可以借此抑制細胞焦亡，減少持續炎癥對機體的損害，促進創面的修復。糖尿病患者皮膚受損后氧化應激加強，成纖維細胞生物學行為改變，修復細胞功能改變，創面修復困難［31］，以活性氧作為糖尿病難愈合創面的治療靶點，應可取到較好療效。

4.2 中性粒細胞胞外陷阱（neutrophil extracellulartraps， NETs）和雙硫侖

被激活的中性粒細胞會將DNA、組蛋白和顆粒酶（如中性粒細胞彈性酶）等釋放到胞外組成一種纖維性細胞外結構，這種結構被稱為中性粒細胞胞外 陷 阱（neutrophil extracellular traps， NETs）［32］。過度的NET 會延緩糖尿病患者的傷口愈合［33］，有團隊通過體外實驗和體內糖尿病創面愈合小鼠模型（寬型、NLRP3-/-、Casp-1-/-和GSDMD-/-小鼠）證明了NLRP3 /Caspase-1/ GSDMD 通路可激活糖尿病創面組織中性粒細胞的釋放，從而導致NET 的形成，而GSDMD基因缺失可避免NET 的形成［34］。同時發現可以直接共價修飾Cys191 的雙硫侖能通過抑制GSDMD 孔的產生來減少NET 的形成從而促進NETs 介導的糖尿病足潰瘍的愈合［35］。該團隊將著眼點放于細胞焦亡下游的通路和因子，提供了一種新的研究思路。

4.3 毛囊間充質干細胞來源的外泌體（HF-MSC-Exo）

近些年來，外泌體成為了再生醫學領域的研究熱點［36］，有研究者發現lncRNA H19 在毛囊間充質干細胞來源的外泌體（HF-MSC-Exo）中高表達，且HF-MSCs-Exo 可促進糖尿病創面愈合。通過體內和體外實驗證實了HF-MSCs-Exo 可以抑制Caspase-1 的激活和GSDMD 的裂解從而抑制細胞焦亡來促進糖尿病小鼠皮膚創面的愈合過程［37］。該研究確定了HF-MSCs-Exo 在NLRP3 介導的細胞焦亡信號通路中的作用，但其作用的具體環節和機制還有待進一步研究，考慮到攜帶lncRNA 的外泌體在再生醫學領域的巨大潛力，筆者認為其將來或可成為糖尿病難愈合創面的一大重要治療方法，值得深入探索和研究。

4.4 穿孔素-2（P-2）和AIM2 炎癥小體

有研究報道駐留在糖尿病足部潰瘍（DFUs）表皮內的金黃色葡萄球菌會觸發AIM2 炎癥小體的激活并誘導焦亡，而穿孔素-2 可以顯著抑制金黃色葡萄球菌在DFUs 的表皮細胞內積聚［38］，但與此同時，金黃色葡萄球菌也能抑制人類皮膚中的P-2［39］。該團隊指出，若在DFUs 組織中P-2 被抑制并且有金黃色葡萄球菌的積聚，即使沒有臨床感染跡象，也可以認為患者具有較高的感染和進一步并發癥的風險［38］。該團隊將著眼點放于金黃色葡萄球菌對細胞焦亡的誘導作用及其共同產生的延長糖尿病創面愈合的生物學效應，證明了以抑制細胞焦亡為目的而靶向于細胞內金黃色葡萄球菌對治療糖尿病難愈合創面有著積極的意義。

4.5 NLRP3 炎性小體的調控

許多研究表明，通過調控NLRP3 炎癥小體的激活可以有效控制糖尿病創面修復過程中細胞焦亡的發生。復旦大學中山醫院劉堅軍團隊發現，去泛素化酶USP30 可以通過去泛素化NLRP3 來激活NLRP3 炎癥小體，而使用USP30 抑制劑MF-094 治療可以導致NLRP3 及其下游的Caspase-1 蛋白水平下降從而促進糖尿病大鼠傷口愈合［40］。同時，也有研究者發現雙鏈RNA 依賴性蛋白激酶（PKR）和NALP3 在高糖+LPS 刺激的巨噬細胞以及糖尿病創面中均表達上調，使用PKR 特異性抑制劑C16 抑制PKR 可以減少巨噬細胞和糖尿病創面中NALP3、Caspase-1、IL-1β 的表達，加速糖尿病小鼠創面愈合的過程［41］。該研究明確了PKR-NLRP3 鏈在糖尿病創面細胞焦亡過程中的生理重要性。此外，一些中藥成分也被發現可以參與調控NLRP3 炎癥小體。在糖尿病小鼠創口愈合早期，染料木素可使NLRP3 炎癥小體恢復到基礎水平，并改善炎癥（TNFα、iNOS、COX2 和NFκB）和抗氧化防御系統（Nrf2、HO-1、GPx 和過氧化氫酶）［42］。薰衣草精油可以通過抑制巨噬細胞的焦亡來減少炎癥因子的產生，改善炎癥反應，從而促進包括LPS 誘導的糖尿病創面在內的慢性創面的愈合［43］。芍藥苷可通過抑制趨化因子受體CXCR2 有效抑制NLRP3 炎癥小體的表達水平，控制炎癥，促進DFUs 大鼠的創面愈合［44］。

5 討論

近年來，許多研究表明細胞焦亡在糖尿病并發癥的發生發展中起著重要的作用，通過抑制細胞焦亡可以有效預防和治療糖尿病的并發癥。在糖尿病的狀態下，累計的晚期糖基化終產物（AGEs）通過產生ROS 促進NLRP3 炎癥小體持續激活可導致角膜傷口愈合延遲和神經再生受損，從遺傳學和藥理學上阻斷AGEs/ROS/ NLRP3 軸可以顯著促進糖尿病角膜傷口愈合和神經再生［45］。而H3 松弛素可以通過抑制P2X7 受體（P2X7R）介導的NLRP3炎癥小體的激活來緩解高血糖引起的視網膜病變［46］。但是在糖尿病創面愈合方向上細胞焦亡的研究才剛剛起步。許多研究通過檢測細胞焦亡相關因子的表達水平變化，來探索某因素對細胞焦亡的影響，但其具體作用的靶點和調控機制很少有進一步研究。遂筆者收集近年來在該領域的研究成果進行綜述，對糖尿病創面中靶向細胞焦亡的分子通路作用機制進行論述，期望對糖尿病難愈合創面的臨床治療和糖尿病創面中細胞焦亡的機制研究提供新的思路與方向。希望各位研究者能進一步探索這些已明確的治療藥物或方式對細胞焦亡的精準作用位點，以尋找更為直接、快速、有效的治療方案，早日攻克糖尿病慢性難愈合創面這一大臨床難題。

作者貢獻度說明：

竺仕林：選題、檢索整理文獻、起草論文、修訂論文；葛星月：選題、提供項目基金支持；楊雅量：整理文獻、修訂論文；李文武：整理文獻、修訂論文；姚明哲：選題、修訂論文；唐乾利：選題、修訂論文、終審論文、提供項目基金支持、指導性支持。

所有作者聲明不存在利益沖突關系。