側孢短芽孢桿菌和中藥對綿羊腸道線蟲的影響及應用

王 巖，秦淑杰，李洪根，李 娟，于洪敏，王 剛，劉 艷,★，單春喬★

（1.大連三儀動物藥品有限公司 116036；2.江蘇三儀科研質量控制中心 221300；3.遼寧省農業發展服務中心110003）

隨著我國經濟高速發展，養殖業規模逐漸擴大，由于綿羊肉的營養價值較高，環境適應能力較強，從家庭散養式向規?；?、集成化發展，但在養殖中，不可避免地受到寄生蟲的侵害。綿羊易感染球蟲、線蟲、絳蟲和肝片吸蟲，會對機體造成感染，帶來一系列危害[1-2]。目前驅蟲方法主要有化學合成藥品 （伊維菌素、丙硫咪唑、多拉菌素、氯氰碘柳胺鈉、左旋咪唑等）、抗生素、中藥材、外用殺蟲劑和消毒劑等[3-4]，其中中藥由于毒副作用小、不容易產生耐藥性等特點越來越受到關注[5]，中藥對綿羊驅蟲研究漸多[6-8]。此外，側孢芽孢桿菌菌株可通過產生細菌毒素接觸控制宿主動物中的線蟲，該毒素能夠抑制線蟲卵的孵化和/或幼蟲的發育[9]，目前研究較多的是側孢芽孢桿菌的蛋白酶對植物線蟲的殺蟲作用，其代謝物酶等對動物寄生性線蟲作用還較少研究。本實驗從中藥、側孢短芽孢桿菌對綿羊寄生線蟲的影響研究出發，分析其影響規律，并開展應用配伍實驗，為綿羊選擇更好的驅蟲方式。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 實驗藥品

側孢短芽孢桿菌發酵罐發酵菌液、中藥均由大連三儀動物藥品有限公司提供，共5 份樣品，分別為側孢短芽孢桿菌發酵液、側孢短芽孢桿菌發酵液上清液、5%中藥、10%中藥、側孢短芽孢桿菌發酵液和終濃度10%中藥配伍，中藥主要成分為常山、白頭翁等，121℃，20 min 滅菌后使用。

1.1.2 試劑與材料

氯化鈉、氯化鉀、硫酸鎂、磷酸二氫鈉、葡萄糖、碳酸氫鈉和氯化鈣均來源于天津市科密歐化學試劑有限公司。碘化鉀和碘來源于天津市大茂化學試劑廠。試劑均為分析純，試驗用水為純化水。

飽和鹽水配制：將400 g 食鹽在1000 mL 沸水中溶解，制成飽和鹽溶液，冷卻后備用。配置Earle’s 平衡液和魯哥氏(Lugol’s)溶液[10]。

1.1.3 設備

分析天平（FA2004，上海舜宇恒平科學儀器有限公司）、光學顯微鏡（NIKON 100，沈陽儀豐鋮實驗設備有限公司）、生物安全柜（Hfsafe 1200LC，上海力申科學儀器有限公司）、離心機（TG16-WS，長沙高新技術產業開發區湘儀離心機儀器有限公司）、恒溫培養箱 （BXS-250S，上海博迅醫療生物儀器股份有限公司）、改良麥克馬斯特計數板（廈門登訊儀器設備有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 蟲卵孵化實驗

蟲卵收集：利用飽和鹽水漂浮法收集蟲卵，將糞樣加入飽和鹽水充分粉碎，紗布過濾，濾液倒入1000 mL燒杯，漂浮30 min 后，用吊環取一環于載玻片，蓋上蓋玻片計數，計數后取10 mL Earle’s 平衡液反復將載玻片和蓋玻片上的蟲卵洗入小燒杯，直至10 mL 無菌水中含有5000 個蟲卵[10]。

蟲卵孵育：將24 孔培養板按列（4 孔）分為5 組編號，其中第6 組為對照組，每孔添加200 μL Egerl’s液、400 μL Egerl’s 液蟲卵懸浮液（約含200 個蟲卵）；第1 至第5 組每孔依次加入5 種樣品各200 μL、400 μL Egerl’s 液（約含200 個蟲卵），每組2 個平行。

孵育后計數：48 h 后用Lugol 氏液終止孵化，計數已孵出的幼蟲數和未孵化的蟲卵數，計算孵化率和蟲卵抑制率。

1.2.2 側孢短芽孢桿菌活菌數的穩定性實驗

配置中藥終濃度為10%的中藥、側孢短芽孢桿菌混合液，室溫靜止放置，每24 h 取樣進行涂布活菌計數。

1.2.3 綿羊驅蟲實驗

針對蟲卵孵化實驗結果，選取對寄生蟲影響較大的樣品進行動物實驗。具體為于河北省張家口市張北縣圣達養殖場選取未做驅蟲、散養為主要飼養方式的羊群進行試驗，年齡在1.5～2.5 歲。

試驗選取前期確定的寄生蟲感染陽性羊120 只，隨機分為兩組，對照組和實驗組，每組60 只。于給藥前0 d、給藥后第4 d、第7 d 和第14 d 隨機取若干只羊取糞便并計數每克糞便中蟲卵數 （eggs per gram，EPG）；同時進行第二次給藥。

給藥具體過程：實驗場地有三個飲水槽，每個飲水槽放50 L 水，每個水槽加產品30 mL，首先放15 只羊進去自由飲水，最后剩約10 L 左右的水，再蓄滿，繼續加產品20 mL，讓另15 只羊進來飲水。以此類推，直至全部完成飲水，對照組給予同產品等量的生理鹽水。

1.2.4 鏡檢寄生蟲判定

飽和鹽水處理的糞便，于載玻片或麥克馬斯特氏計數板上觀察蟲卵形態特點，鑒定寄生蟲蟲卵[3]。

1.2.5 綿羊糞便寄生蟲檢測

糞便采集后置于冷藏箱，快遞2 d 內寄到實驗室，立即展開實驗。采用飽和水漂浮法分離寄生蟲，采用麥克馬斯特氏計數法對感染陽性糞便進行計數，每克糞便蟲卵數（EPG）計算公式為：

N1、N2：麥克馬斯特兩個計數室蟲卵數；

60：總體積60 mL；

0.15：計數室體積，1 cm×1 cm×0.15 cm；

m：稱樣質量。

1.3 數據統計與分析

利用EXCEL 進行數據整理，SPSS 21 數據分析。

2 結果與分析

2.1 側孢短芽孢桿菌、中藥對蟲卵孵化的影響

側孢短芽孢桿菌、中藥對蟲卵孵化的影響如表1 所示，對照組、5%和10%中藥組存在幼蟲孵化，其中對照組孵化率最高，為18.67%，其次是5%中藥組。10%中藥組孵化率比5%中藥組低說明中藥具有一定抑制蟲卵孵化作用。含有側孢短芽孢桿菌的實驗組沒有幼蟲孵化，表明該菌株有抑制蟲卵孵化的作用。

表1 側孢短芽孢桿菌、中藥對蟲卵孵化影響的結果

由蟲卵抑制率可知，對照組出現36.88%抑制率，由于對照組為孵化液，此值代表了蟲卵自然死亡率。與對照組相比，5%中藥組抑制蟲卵發育、生長能力最低，其次是10%中藥組、發酵液上清組。發酵液組、發酵液和10%中藥配伍組差異性不大，但發酵液和10%中藥配伍組能力最強，表明起到了一個協同增效作用，排除自然死亡率影響后，實際抑制率為59.21%。

由發酵液上清和發酵液的抑制能力，初步可分析抑制能力物質來源，發酵液上清主要為菌株代謝產物，包括蛋白酶、幾丁質酶等代謝產物，發酵液中除以上成分外還包括菌體蛋白及孢子等，發酵液蟲卵抑制率為87.38%，發酵液上清為82.67%，發酵液的抑制能力較上清液強，表明發酵液中起抑制作用物質較多，但上清液抑制能力比發酵液稍低，因此上清液物質起主要作用，即代謝產物蛋白酶、幾丁質酶等代謝產物，其次是菌體蛋白及孢子等。

2.2 10%中藥對側孢短芽孢桿菌活菌數的影響

從表2 可看出，配伍菌株活菌數為1.57×109CFU/mL，96 h 內10%中藥對側孢短芽孢桿菌活菌數無影響，中藥未體現對該菌株的殺菌、抑菌作用，配伍應用不會影響菌株對寄生蟲的作用效果。同時菌株未增加或減少，說明產品較穩定。

表2 10%中藥對側孢短芽孢桿菌活菌數影響的結果

2.3 側孢短芽孢桿菌配伍中藥對綿羊寄生蟲的影響

側孢短芽孢桿菌配伍10%中藥對綿羊感染寄生蟲的影響如表3 所示，由陽性率可知，相比對照組，實驗組陽性率呈逐漸降低趨勢，第14 d 降到10%，陽性率降低90%。由平均感染強度可知，實驗組也呈現逐漸降低趨勢，與給藥前（0 d）相比，降低約87.74%，而對照組總體呈現升高趨勢。

表3 側孢短芽孢桿菌配伍中藥對綿陽驅蟲結果

2.4 鏡檢蟲卵

線蟲和孵化幼蟲如圖1 所示，采用飽和鹽水法收集的蟲卵和臨床實驗檢測出的蟲卵基本都是線蟲，主要為細頸線蟲卵，捻轉血矛線蟲卵和食道口線蟲，孵化的幼蟲為蟲卵孵化篩選實驗中孵化得到。

圖1 綿羊線蟲卵及幼蟲（顯微鏡10 x 40）

3 討論

胃腸道寄生蟲感染是反芻動物生產的重要制約因素之一，化學藥物的預防和控制造成了寄生蟲抗藥性的增加，再加上某些農作物可以從施用于土壤的牲畜糞便中吸收抗生素，這對人類健康有影響，新的控制寄生蟲方法急需研究。

微生物殺蟲劑作為活的有機體或其產品或副產品，是一種具有目標特異性的環境友好型替代品，通過對害蟲的致病性來控制它們。芽孢桿菌科的研究最多的是蘇云金芽孢桿菌。除此之外，還有一些細菌被報道為有效的生物防治，如球形芽孢桿菌、日本金龜芽孢桿菌、緩病芽抱桿菌和側孢短芽孢桿菌等。Zheng 等[11]收集了30 個種共120 株芽孢桿菌和類芽孢桿菌，研究表明蘇云金芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、堅硬芽孢桿菌、球形賴氨酸芽孢桿菌、側孢短芽孢桿菌和短芽孢桿菌具有很強的殺線蟲活性，由基因組測序分析推導出了四種可能的機制，包括晶體蛋白的成孔機制，蘇云金素抑制類似的機制和蛋白酶和/或幾丁質酶的降解機制，不同家族的120 種產芽孢桿菌均具有可能有助于其殺線蟲能力的毒力因子，每個菌株平均有10 個假定的毒力因子。

其中側孢短芽孢桿菌是一種無脊椎動物病原體和抗菌物種，其形態特征是典型的孢子被牢固附著的獨木舟狀副孢體包圍，其全基因組測序揭示了它產生聚酮化合物、非核糖體肽和毒素的潛力，被列入用于哺乳動物和鳥類的益生菌，以及從中提取的特定抗生素已在醫學中得到應用。生物防治研究領域研究有蠅、蚊子、鞘翅目害蟲和線蟲等無脊椎動物。對線蟲作用機制研究有兩種，即堿性蛋白酶BLG4 殺線蟲和低分子量(2900 Da) 蛋白質殺線蟲[18]。堿性蛋白酶殺線蟲主要研究在植物方面，動物寄生性線蟲研究較少。低分子量蛋白對牛腸道線蟲作用效果研究表明，側孢芽孢桿菌殺線蟲的毒素是孢子提取物，它的特點是溶菌酶可增強其活性，加熱也可增加其殺傷力[9]，有研究表明孢子表面蛋白是一組復雜的毒素和毒力因子的一部分。

本次蟲卵孵化實驗與上述研究結果稍有不同，菌株發酵液與上清液抑制蟲卵孵化的能力沒有顯著性差異，但發酵液抑制能力稍強，表明該菌起主要作用的不是孢子，極有可能是胞外分泌物，如蛋白酶、幾丁質酶或其他代謝物等，孢子作用次之。對其堿性蛋白酶酶活進行檢測，酶活約為756 U/mL（發酵罐發酵約45 h，根據GB/T 23527-2009 方法檢測，標準曲線Y=0.01X+0.0054，R2=0.9996），高于郭菁[12]等研究的620 U/mL，具體起到抑制蟲卵孵化作用的物質需要進行酶純化或代謝物分析、提取后去驗證。

除對無脊椎動物的致病性外，側孢短芽孢桿菌還表現出對細菌和真菌廣譜抗菌活性。飼喂芽孢桿菌可以增加雛雞體重和抑制病原菌生長，側孢短芽孢桿菌以106孢子/g 成品飼料飼喂雛雞，可以顯著減少盲腸沙門氏菌。于道德等[13]研究表明側孢短芽孢桿菌能夠促進對蝦生長、激活免疫系統、提高抗病力、抑制周圍環境弧菌生長，推薦對蝦養殖飼料中使用量為105CFU/g。

植物產品或中藥材也可控制寄生蟲，減少土壤中的抗生素污染，減少某些寄生蟲中正在形成的抗菌素耐藥性。如從大蒜、五倍子、青蒿、棕櫚花、仙鶴草、石榴等植物中提取物能對寄生蟲引起的氧化應激表現出保護作用，杜松和黃松對體內寄生蟲治療有效，英屬哥倫比亞省用艾草、蒲公英、異株蕁麻和牛蒡等藥用植物治療兔和家禽體內、體外寄生蟲。在我國中藥控制寄生蟲的研究較多，復方中藥中常山應用的最多，常山堿是有效抗球蟲成分[14]，其次是白頭翁，白頭翁總皂苷對體外不同發育階段的日本血吸蟲有殺滅效果[15]，對球蟲的孢子化抑制效果較好[16]。宮新城等[17]研究表明青蒿、常山、秦皮、鴉膽子、白頭翁、地錦草、仙鶴草、金雞納和黃芪組成的中藥方劑通過抑制球蟲孢子化，殺滅球蟲。李峰等[18]用中藥組成的蒙獸藥方劑驅蟲研究表明，每日飼喂育肥羔羊至出欄，有明顯驅蟲效果，對寄生蟲重度感染的羊連續飼喂21 d 也表現出良好的驅蟲效果。韓楠等[19]研究表明常山、苦參等中藥與芽孢桿菌、乳酸桿菌及雙歧桿菌組成的中草藥微生態制劑對羊球蟲病治療具有較好效果，還可提高免疫力。由蟲卵孵化實驗可知，中藥對綿羊寄生蟲有顯著的抑制作用，與側孢短芽孢桿菌配伍后，可以提高抑制能力，動物驅蟲實驗表明使用中藥與菌株配伍產品后較使用前有明顯的驅蟲效果。

4 結論

本實驗研究表明側孢短芽孢桿菌對蟲卵孵化有抑制作用，發酵液與發酵液上清對蟲卵孵化有顯著性差異，發酵液強于發酵液上清，根據發酵液及上清成分推測主要起作用物質為菌株代謝產物蛋白酶、幾丁質酶等，目前有關側孢短芽孢桿菌蛋白酶對線蟲的殺蟲研究主要集中在植物線蟲，該研究表明菌株代謝物對動物腸道線蟲也同樣具有毒力作用。不同濃度中藥對蟲卵孵化有顯著性差異，10%濃度具有更強的抑制能力。側孢短芽孢桿菌和中藥配伍后起到協同增效，增強抑制能力的作用，用于臨床實驗也驗證了配伍后具有對綿羊寄生蟲的驅蟲作用，側孢短芽孢桿菌和中藥對綿羊寄生蟲治療具有較好效果。