腫瘤內皮標記物1通過絲裂原活化蛋白激酶途徑介導內皮細胞對血管新生及對心力衰竭心肌重塑

徐婷 黃薇 楊力 余浩

武漢市第一醫院（武漢市中西醫結合醫院）心血管內科（武漢 430022）

心肌梗死（myocardial infarction，MI）是冠心病最重要和最嚴重的表現之一，并最終導致心力衰竭（heart failure，HF）［1］。HF 的基本病理生理機制是心室重構，特別是過度的心臟纖維化和細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的積聚［2］。MI 引起的心臟纖維化主要是由于心臟成纖維細胞（cardiac fibroblasts，CFs）的激活，然后分泌大量的ECM［3］。CFs 的起源細胞已被廣泛研究，除了心臟常駐成纖維細胞外，也可以來源于內皮細胞［4］。內皮細胞經歷表型轉化并獲得間充質表型，這一過程稱為內皮-間充質轉化（endothelial-mesenchymal transition，EndMT）［4］。在此過程中，內皮細胞失去其內皮特性，并通過表達α-SMA 和波形蛋白獲得遷移和侵襲性間充質表型，最終促進CFs 的過程［5］。然而，EndMT 如何參與MI 后心肌纖維化的詳細分子機制仍不完全清楚。腫瘤內皮標記物1（tumor endothelial marker 1，TEM1）是一種跨膜糖蛋白，在胚胎發生期間出現在間充質譜系來源的細胞上，但其表達在出生后大大降低［6］。在腫瘤血管生成、器官纖維化和傷口愈合中發現TEM1 的再上調，表明其在組織重塑和修復中的潛在作用。有研究［7］發現，TEM1 在心臟損傷后上調并參與心臟重塑。然而，TEM1 的表達是否通過調節內皮細胞的細胞行為參與心臟纖維化尚不清楚。本研究的主要目的是探討小鼠MI 后心臟組織TEM1 表達的變化以及TEM1 對心臟重構過程中心肌細胞生物學功能的影響。

1 材料與方法

1.1 動物模型和體內實驗 本研究使用的野生型C57BL6 小鼠（6 ～ 8 周齡）購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。參照文獻［8］方法，通過冠狀動脈左前降支的永久性結扎在雄性小鼠中產生MI 模型。動物實驗經本院倫理委員會批準（編號：EI-20-1041）。體內實驗分為兩個階段。

在第一階段，在第1、3、7 和28 天收集MI 小鼠心臟的梗死邊緣、梗死和遠端組織（每個時間點n= 4）。通過實時PCR（RT-PCR）評估在不同時間點MI 小鼠的每個測定的心臟區域中TEM1 表達水平。建立了一個假手術組，其中小鼠進行了類似的外科手術，但沒有結扎冠狀動脈的左前降支。此外，在第1、3、7 和28 天（每個時間點n= 4），通過CD45+CD31+磁珠分選MI 小鼠梗死邊緣區的血管內皮細胞［9］，并通過Western blot 檢測TEM1 的表達水平。

在第二階段，將小鼠隨機分成4 組，包括假手術組、MI 組、MI+sh-NC 組和MI+sh-TEM1 組，每組16 只。除假手術組，其他組建立MI 模型。MI+sh-NC 組和MI+sh-TEM1 組分別在建模后進行TEM1 shRNA 慢病毒注射。然后，在第28 天評估小鼠的心臟功能（每組n= 6）。每組4 只小鼠用于在第7 天通過免疫熒光染色檢測梗死邊緣區EndMT 的變化。此外，在第7 天收集3 組中梗死邊緣區的心肌，并分選內皮細胞以通過Western blot 試驗檢測EndMT 和信號傳導途徑的變化（每組n= 6）。

1.2 細胞分離和培養 參照文獻方法［10］，從C57BL6 小鼠（8 ～ 12 周齡）的腹主動脈獲得小鼠主動脈內皮細胞（mouse aortic endothelial cells，MAECs）。將MAECs 在ECM（美國science cell 公司）中培養，培養溫度為37 ℃，取第2 ～ 4 代細胞用于實驗。為了評估TEM1 對MAECs 的作用，將細胞實驗分為3 組：對照組、Vector 組和rTEM1 組。對照組未經任何處理，Vector 組加入溶媒DMSO，rTEM1 組用濃度為250 nmol/L 重組TEM1（Recombinant TEM-1，rTEM-1，上海碧云天公司）處理細胞48 h，然后通過Western blot 評估內皮細胞中EndMT 和MAPKs 信號通路的變化。此外，在經DMSO 或MAPK 抑制劑SB203580（1 μmol/L；美國Selleck 公司）預處理的MAECs 中，用rTEM1（250 nmol/L） 處理細胞48 h，然后用Western blot檢測EndMT、MAPKs 信號通路的水平。

1.3 標本采集和組織制備 根據實驗需要，在不同時間點從MI 小鼠收集心臟組織。收集MI 小鼠的梗死邊緣、梗死區和遠端區，提取mRNA，通過RT-PCR 檢測TEM1 表達。將心室組織依次浸入3 mL 肝素鈉（0.15 mg/mL）、冷心臟停搏緩沖液（3% KCl）、PBS 和4% PFA 溶液中，之后將樣品包埋在OCT 化合物中，并從心室組織的心尖到基部切成橫切面。將每個心臟切成5 等份，其中3 個切片用于免疫熒光染色。

使用CD45+CD31+微珠（德國MiltenyiBiotec 公司）從MI 小鼠心臟的心肌組織中分離內皮細胞。然后，提取細胞的蛋白質以檢測EndMT 和MAPKs信號通路的水平。

1.4 細胞活力測定 CCK-8 分析用于計算內皮細胞的存活力。將MAECs（1 000/孔）接種在96 孔板中，培養過夜，然后用 rTEM1（250 nmol/L）處理不同的時間間隔（12、24、48 h）。隨后，向細胞中加入10 μL CCK-8 溶液（日本DOJINDO 公司）。再孵育4 h 后，使用酶標儀（美國BioTek 公司）檢測每個孔在450 nm 的光密度（OD）值。

1.5 實時 PCR 分析 使用TRIzol 試劑（日本Takara 公司）從心臟組織和細胞中提取總RNA，和使用PrimeScript RT Master Mix 試劑盒（日本Takara公司）將1 μg 總 RNA 逆轉錄成cDNA。然后使用SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒（日本Takara 公司）進行qRT-PCR，并將數據標準化為GAPDH 表達。使用ABI 7500 儀器（美國 Applied Biosystems 公司）在標準qRT-PCR 條件下（95 ℃ 30 s，隨后95 ℃ 5 s和60 ℃ 34 s 的40 個循環）測定樣品的表達。靶基因的引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，如下：TEM1：F：5′-CATTATGCAGCTGCTTTGGA-3′，R：5′-GTCGTAGTCCCCTGTGGAGA-3′；GAPDH：F：5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′，R：5′-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3′。

1.6 蛋白質印跡分析 使用放射免疫沉淀測定緩沖液（北京Solarbio 公司）提取細胞和組織中的蛋白質。通過BCA 測定法定量蛋白質樣品的濃度。等量的蛋白質（40 ～ 60 μg）在8% ～ 12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠上運行，并轉移到聚偏二氟乙烯膜上。然后使用以下針對指定靶蛋白的一抗進行探測：抗TEM1 抗體（1∶1 000，美國Thermo Fisher 公司），抗VE-cadherin 抗體、α-SMA 抗體、Vimentin 抗體（1∶1 000，美國Cell Signaling Technology 公司），抗p38、p-p38、p-JNK、JNK抗體（1∶1 000，美國Abcam 公司）和抗GAPDH 抗體（1∶5 000，武漢Proteintech 公司）。將細胞與過氧化物酶偶聯的抗小鼠或抗兔IgG 抗體一起孵育。最后，用ECL plus 試劑（美國Cell Signaling Technology 公司）觀察條帶。

1.7 跨孔遷移分析 用涂有基質膠的8 μm Transwell 室（美國Corning Costar 公司）評估細胞侵襲。在無血清培養基中以1 × 104細胞/mL 的密度將MAECs 接種到孔中，將600 μL 補充有10% FBS 的DMEM 加入到下室中。遷移48 h后，擦去膜上表面的細胞，在下表面的細胞用4%多聚甲醛固定并用0.01%結晶紫染色。最后，在顯微鏡下，在5 個隨機區域對侵襲細胞進行計數。

1.8 劃痕試驗 為了評估TEM1 刺激后MAECs 的遷移，進行了劃痕試驗。將MAECs 以每孔5.0 ×105個/mL 的密度接種在6 孔板中。當細胞達到90%匯合時，使用無菌200 μL 移液管尖端劃一道劃痕。在板的底部做不同的標記，以保證同一視野中的細胞被連續分析遷移。通過Image-Pro Plus 6.0 確定細胞遷移的距離。

1.9 超聲波心動描記術 使用帶有Ms-400 線性換能器的Vevo 2100 系統（加拿大Visual Sonics 公司）產生經胸超聲心動圖，以測量小鼠在MI 后第28 天的心臟功能。獲得來自5 個連續心動周期的數據，用于計算LVEF（%）、LVFS（%）值。

1.10 免疫熒光染色 將來自MI 小鼠的心臟切片（5 μm）與 CD31（英國Abcam 公司，1∶250）或波形蛋白（英國Abcam 公司，1∶200）在4 ℃下孵育過夜，之后載玻片與二抗在室溫下孵育1 h，細胞核用DAPI 染色。使用蔡司熒光顯微鏡對載玻片進行成像。每只小鼠取3 個不同心臟切片用于CD31 和波形蛋白的共染色計算。

1.11 統計學方法 使用SPSS 19.0 進行統計分析，計量數據表示為均數±標準差。兩組比較采用獨立樣本t檢驗，多組比較采用單向方差分析和事后Tukey 檢驗或雙向方差分析和事后Bonferroni 檢驗。以P＜ 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MI 小鼠梗死邊緣區內皮細胞TEM1 表達增強 在梗死邊緣區的心肌中，TEM1 mRNA 水平在MI 后第1 天輕微增加，在第7 天顯著達到峰值，然后在第28 天降低。然而，在MI 后28 d，TEM1 的表達在梗死和遠端區域沒有顯示出明顯的變化（圖1A-C）。在第1、3、7 和28 天從小鼠中分離MI后梗死邊緣區的內皮細胞，然后提取總蛋白。WESTERN BLOT 測定結果顯示，內皮細胞中的TEM1 蛋白水平在第1 天上調，在第7 天顯著增加，然后回到基線（圖1D-E）。

圖1 MI 后梗死邊緣心肌的內皮細胞中 TEM1 表達增強Fig.1 The expression of TEM1 in endothelial cells of myocardial infarction margin increased after MI

2.2 TEM1 促進內皮細胞增殖和 EndMT 與Vector組相比，rTEM1組MAECs在 48 h的OD值顯著增加（P＜ 0.001），見圖2A。Western blot分析EndMT的結果顯示，與Vector 組相比，rTEM1 組MAECs 中VE-Cadherin 蛋白表達顯著下降（P＜ 0.05），和α-SMA和波形蛋白水平顯著增加（P＜ 0.05），見圖2B。

圖2 TEM1 促進內皮細胞間充質轉化和膠原合成Fig.2 TEM1 promoted mesenchymal transition and collagen synthesis of endothelial cells

2.3 TEM1 誘導內皮細胞遷移、侵襲和血管生成 與Vector 組相比，rTEM1 組MAECs 的相對遷移距離、侵襲細胞數和形成分支數量顯著增加（P＜ 0.001），見圖3。

圖3 TEM1 在體外誘導內皮細胞遷移、侵襲和血管生成Fig.3 TEM1 induced migration，invasion and angiogenesis of endothelial cells in vitro

2.4 MAPKs通路部分參與介導TEM1誘導的內皮細胞EndMT 與Vector 組相比，rTEM1 組MAECs中p-P38/P38 和p-JNK/JNK 蛋白表達增加（圖4A）。為了進一步研究MAPKs 信號通路的激活是否與TEM1 對內皮細胞EndMT 的調節作用有關，進行了挽救實驗來測試TEM1 誘導的內皮細胞EndMT與MAPK 抑制劑SB203580 之間的關系。結果表明，SB203580 逆轉了由rTEM1 誘導的VE-Cadherin蛋白表達下降，和降低α-SMA 和波形蛋白水平（圖4B）。此外，與rTEM1+DMSO 組相比，rTEM1+SB203580 組MAECs 的相對遷移距離、侵襲細胞數和形成分支數量顯著降低（P＜ 0.01），見圖4C-E。

圖4 TEM1 激活內皮細胞中的MAPKs 信號通路Fig.4 TEM1 activated MAPKs signaling pathway in endothelial cells

2.5 TEM1 敲除部分消除了EndMT 和心臟纖維化，并增強了MI 后的心臟功能 與MI+sh-NC 組相比，在第7 天MI+sh-TEM1 組小鼠中TEM1 mRNA和蛋白質表達水平均顯著降低（圖5A、B）。與Sham組相比，在MI 后第7 天，在其他3 組中波形蛋白和CD31 共染色的水平都顯著增強。相反，與MI 組相比，MI+sh-TEM1 組中的CD31+Vimentin+共染色水平顯著降低（P＜ 0.01），見圖5C。在第28 天，通過超聲心動圖測量心臟功能，MI+sh-TEM1 組小鼠的LVEF 和LVFS 均較MI 組顯著增強（P＜ 0.05），見圖5D。與MI 組相比，MI+sh-TEM1 組小鼠的內皮細胞中p-P38/P38 和p-JNK/JNK 蛋白表達降低（圖5E）。

圖5 在MI 小鼠中通過慢病毒敲除TEM1 基因減少了心臟纖維化并改善了心臟功能Fig.5 Knockout of TEM1 gene by lentivirus in MI mice reduced cardiac fibrosis and improved cardiac function

3 討論

本研究發現小鼠MI 后，在梗死邊緣區域的TEM1 表達發生改變，在遠端區域和梗死區域沒有觀察到顯著變化。此外，TEM1 上調誘導內皮細胞EndMT 和膠原合成，敲低TEM1 可通過減輕EndMT改善MI 小鼠的心功能。這些結果表明，心臟損傷后TEM1 在心臟中的表達增加，并作為參與心臟重塑的功能蛋白發揮作用。

TEM1 在胚胎發育、癌癥的基質和新生血管期間廣泛表達，但在成人正常組織中沉默［11］。在這種情況下，TEM1 已被證明定位于幾種細胞類型，包括腫瘤基質的血管周細胞、內皮前體細胞、成纖維細胞以及惡性細胞［12-13］。有研究［14］證實TEM1是一種對損傷有反應的功能蛋白，并參與包括心臟在內的器官損傷的病理生理學過程。MI 后，受損心臟組織含有多種細胞，包括浸潤性免疫細胞，尤其是巨噬細胞、心肌細胞、成纖維細胞和內皮細胞［15］。本研究中從MI 后28 d 內的小鼠梗死邊緣區提取內皮細胞，并進行Western blot 和RT-PCR分析以測量TEM1 表達。結果表明TEM1 表達在第7 天顯著增強。

內皮細胞通過釋放多種細胞因子在維持心血管系統的體內平衡方面發揮著關鍵作用［16-17］。內皮依賴性功能障礙已被證明存在于多種類型的心血管疾病中，其能分泌許多細胞因子，如NO、ET-1和TGF-β1，進而促進多種病理生理過程，包括炎癥反應、組織重塑、內質網應激和其他過程［18］。因此，內皮細胞作為旁分泌細胞，在心血管疾病中起著關鍵作用。在這項研究中，內皮細胞在MI 后高度表達TEM1。此外，通過rTEM1 體外誘導內皮細胞上調TEM1，可促進細胞遷移、侵襲和血管生成。同時，體內數據顯示，TEM1 敲低減少了MI 后血管內皮細胞標記物如CD31 和VE-鈣粘蛋白在小鼠心臟中的表達。有研究［19］證實，TEM1 缺陷小鼠的膠原蛋白含量比野生型小鼠低。在腎纖維化中，TEM1 基因敲除小鼠的腎纖維化程度較低。筆者認為，MI 后體內的自發代償機制導致血管內皮細胞活化和增殖，進而導致梗死心臟血管密度增加。因此，TEM1 可以通過直接激活心臟成纖維細胞誘導CFs，這為未來的研究提供了方向。

本研究結果表明，TEM1 激活MAPKs 通路，并增強MAECs 中P38 和JNK 蛋白的磷酸化水平。EndMT中涉及的信號通路已得到廣泛研究，研究［18］表明EndMT 中涉及的信號通路與調節EndMT 的信號通路高度相似。與EndMT 相關的主要信號通路包括MAPKs、PI3K/AKT 和Wnt 信號通路［20］。此外，研究［21］表明，在不同的疾病模型中，MAPKs 通路的磷酸化可以誘導這些信號通路的激活。因此，結合本研究結果，可以推測，通過TEM1 刺激激活MAPKs 通路是促進內皮細胞EndMT 的主要分子機制。為了進一步證明TEM1誘導的EndMT與MAPKs 通路激活相關，用MAPK 抑制劑SB203580處理內皮細胞，然后用rTEM1 刺激內皮細胞，結果顯示SB203580 逆轉了由rTEM1 誘導的EndMT 和血管生成。此外，使用攜帶TEM1 的慢病毒敲除心梗小鼠中TEM1，導致P38 和JNK 蛋白的磷酸化水平均部分下調。這些結果表明，TEM1 激活MAPKs通路參與了MI 后EndMT 的發病機制。

總之，本研究結果表明，TEM1 誘導的EndMT和血管生成參與了MI 誘導心肌重塑的發病機制，其作用機制與MAPKs 信號通路激活有關。因此，靶向TEM1 可能是一種降低心肌纖維化和改善MI后心臟功能的新的治療選擇。然而，TEM1 是否通過激活其他通路促進內皮細胞EndMT 有待于未來進一步研究。

【Author contributions】XU Ting performed the experiments and wrote the article.HUANG Wei performed the experiments.YANG Li revised the article.YU Hao designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.