Nicastrin、N1ICD及hes1蛋白在小鼠肝臟及肝癌組織中的表達

嚴璐 史天威，2

1河南中醫藥大學第五臨床醫學院、河南中醫藥大學人民醫院、鄭州人民醫院（鄭州 450000）；2鄭州大學人民醫院、河南省人民醫院、河南大學人民醫院（鄭州 450003）

Nicastrin 是NCSTN 基因編碼的Ⅰ型跨膜蛋白，其在家族性化膿性汗腺炎中研究較多［1-2］。Nicastrin 作為γ 分泌酶復合物中重要以及最大的亞基，可識別底物［3］，阻止大底物與γ 分泌酶活性位點結合［4］。γ 分泌酶復合物是一種膜內天冬氨酸蛋白酶，催化單跨1 型跨膜蛋白在膜內蛋白水解調控的最后一步，研究最多的底物是β-淀粉樣肽前體蛋白（APP）與notch 受體［5］。

Notch 信號通路是一條進化保守的通路，決定細胞命運，參與胚胎、組織發育，器官形成以及組織修復等生物學過程［6］，該信號通路突變與多種遺傳性疾病及腫瘤性疾病相關［7］，其在肝臟中作用復雜，參與各種肝臟疾病的生理病理過程，在肝細胞癌（HCC）中發揮促癌［8］或抑癌作用［9］，而對于notch1 受體而言，國內研究大多認為notch1 在肝癌組織中表達增多［10-11］，國外研究［12］發現notch1 在肝癌組織中有表達降低的現象，為了明確這種矛盾現象，我們通過檢測小鼠肝癌組織中相關蛋白的表達情況試圖找到答案。

以notch1 通路為基點，其與NCSTN 基因調控相關［13］，且近年來研究者發現NCSTN 基因在HCC中作為促癌基因［14］，在HCC 患者中，癌組織中的NCSTN mRNA 相對與正常肝臟組織表達增高［15］，而目前有關nicastrin 在小鼠肝臟組織如何表達研究較少。另有Notch 通路下游靶基因hes1 也參與肝臟腫瘤的進展［16］，同樣目前有關hes1 在動物肝臟組織中如何表達以及如何參與肝細胞癌的研究較少。綜上，本研究欲通過檢測nicastrin、N1ICD 及hes1 蛋白在小鼠肝癌組織及正常肝臟組織中的表達進一步明確這3 種蛋白在小鼠HCC中的作用，再通過免疫組化實驗觀察nicastrin、N1ICD 及hes1 蛋白在小鼠肝臟組織中的定位表達，為后續的相關研究提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和細胞株 本課題使用的野生型（WT）C57BL/6 小鼠為我們前期課題所獲取，Hepa 1-6 細胞株購自富衡生物。所有的動物實驗均按照《實驗動物護理和使用指南》進行，并得到了河南中醫藥大學第五臨床醫學院科研倫理委員會的批準（編號：KY2021-004-011-D）。

1.2 主要試劑 1640 培養基、PMSF 以及BCA 定量試劑盒購自中國Solarbio 公司，胎牛血清購自中國Bio-Ind 公司，胰酶購自中國Servicebio 公司，RIPA 裂解液及SDS-PAGE 凝膠試劑盒購自中國晶彩公司，粉劑型抗原修復液、HRP 試劑和DAB 染色液購自中國邁新生物公司，一抗稀釋液購自中國賽諾特公司，anti-NCSTN、Cleaved-Notch1、Hes1、GAPDH 以及二抗購自中國Proteintech 公司。

1.3 主要儀器 生物安全柜（美國Thermo 公司），超凈工作臺（蘇州安泰技術公司），CO2培養箱（上海力申科學儀器公司），離心機（美國Thermo公司），數顯恒溫水浴鍋（上海力辰邦西儀器公司），顯微鏡（德國徠卡儀器公司），電泳儀（美國Bio-Rad 公司），蛋白凝膠成像儀（美國Azure Biosystems 公司），Tissue-Tek Prisma Plus染色機（櫻花醫療科技公司）。

1.4 實驗方法 從12 只日齡為6 周的正常野生C57BL/6 小鼠中隨機挑選6 只小鼠用于構建小鼠肝癌模型（模型組），剩余6 只實驗小鼠作為對照組，注射肝癌細胞及生理鹽水前對所有實驗小鼠進行稱重記錄。

1.4.1 構建小鼠肝癌模型 Hepa 1-6 肝癌細胞在37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中培養，取對數生長期細胞，0.25%胰蛋白酶消化后，用PBS 緩沖液調整細胞懸液濃度至5×107/mL 用于實驗，每只小鼠注射20 μL。

腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉小鼠，濃度0.2% ～0.3%，注射劑量0.4 mL/20 g。麻醉后仰臥位并固定四肢于實驗板上，參考文獻［17］對實驗小鼠注射肝癌細胞，對照組小鼠注射同等量的生理鹽水，造模周期為14 d。

1.4.2 組織樣本的獲取 造模結束后分別留取對照組正常肝臟組織及模型組肝臟癌變組織，一部分置于7 ～ 10 倍留取組織體積的10%中性緩沖福爾馬林固定液中進行IHC 實驗，剩余部分保存于-80 ℃冰箱中用于Western blot 實驗。

1.4.3 肝組織HE 染色 HE 染色在Tissue-Tekr Prisma 儀器上進行操作的。石蠟包埋、切片處理后，烤片2 h，放置儀器中進行HE 染色，結束后經中性樹膠封片。

1.4.4 肝組織免疫組化實驗（IHC） 石蠟切片經脫蠟、水化后，用檸檬酸抗原修復法進行抗原恢復，切片上滴加3% H2O2室溫孵育10 min，PBS 沖洗3 次，每次3 min，滴加anti-nicastrin，anti-notch1（Val1744）及anti-hes1，比例同說明書，室溫下孵育1 h，PBS 沖洗后，HRP 試劑室溫孵育30 min，PBS 沖洗同上，滴加新鮮配置的DAB 顯色劑顯色，流水沖洗停止染色，蘇木精復染，分化液分化，PBS 返藍，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性膠密封，顯微鏡下觀察。

1.4.5 Western blot 實驗 使用RIPA+PMSF 法提取組織總蛋白，每管按1∶100 比例依次向2 mL 研磨適配管中加入RIPA 裂解液、蛋白酶抑制劑和PMSF 共1 mL 進行肝臟蛋白的提取，按照BCA 蛋白試劑盒說明書定量。制備SDS-PAGE 凝膠電泳分離（80 V，30 min；120 V，1.5 h），轉膜（100 mA，2 h），5%的脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗4 ℃過夜（抗體同1.4.4 實驗），二抗室溫孵育2 h，1×TBST 漂洗后滴加發光液后進行成像，用ImageJ 分析灰度值，用目的灰度值/GAPDH 灰度值的比值進行統計分析。

1.4.6 生物信息學分析 應用UALCAN數據庫分析NCSTN、notch1 和hes1 在肝癌和正常組織中轉錄和蛋白水平的表達。

1.5 統計學方法 本實驗結果均以均數±標準差（SD）表示，統計學分析采用graphpad prism 8.3 軟件進行分析，結果使用t-test表示，以P＜ 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 原位肝癌模型小鼠肝臟肉眼觀和HE 染色鏡下觀 注射肝癌細胞2 周后，肝臟變化如圖1a、b、c所示，肉眼觀小鼠肝臟均長出肝癌組織團塊，相比正常肝臟組織，觸之質硬。HE 染色如圖1 a1、b1、c1 黃色箭頭所示，低倍鏡下可見肝小葉結構消失，中央靜脈及匯管區消失，代之以大小不等排列不規則的癌細胞，圖1 a2、b2、c2 為相對應的高倍鏡視野，可見正常肝細胞及肝竇內皮細胞消失，代之核漿比例增大的肝癌細胞。

圖1 肝癌肉眼觀圖及HE 染色結果Fig.1 Hepatocellular carcinoma macroscopic view and HE staining

2.2 Nicastrin、N1ICD 及hes1 蛋白在小鼠正常肝臟組織及肝癌組織中的表達 IHC 結果顯示，nicastrin、N1ICD、hes1 蛋白的表達在正常肝臟組織中（圖2 a1、b1、c1）均定位于肝竇內皮細胞，肝細胞基本不表達；相比正常肝臟組織，nicastrin（a2）蛋白在肝癌組織中表達增加，N1ICD（b2）和hes1（c2）蛋白在肝癌組織中表達降低。WB 結果顯示（圖3），相比正常肝臟組織，nicastrin 蛋白在肝癌組織中表達增高（P＜ 0.01），N1ICD、hes1 蛋白在肝癌組織中表達下降（N1ICD：P＜ 0.05）（hes1：P＜ 0.01）。

圖2 Nicastrin、N1ICD 和hes1 在小鼠肝細胞及肝癌細胞中的表達Fig.2 Expression of nicastrin，N1ICD and hes1 in mouse hepatocellular carcinoma cells and hepatocytes

圖3 Nicastrin、N1ICD 和hes1 蛋白在小鼠正常肝臟組織及肝癌組織中的表達Fig.3 Expression of nicastrin，N1ICD and hes1 proteins in normal liver tissue and liver cancer tissue of mice

2.3 NCSTN、notch1 和hes1 在肝癌患者中的表達情況 UCLCAN 數據庫檢索結果顯示，相比正常肝臟組織，NCSTN mRNA 在肝癌組織中表達增高（P＜ 0.05），notch1 mRNA 和hes1 mRNA 在正常肝臟組織和肝癌組織中的表達無差異（P＞ 0.05）；相比正常肝臟組織樣本，NCSTN 表達的蛋白在肝癌組織中表達增多，notch1 蛋白在肝癌組織中表達降低（圖4）。

圖4 肝細胞癌不同樣本中NCSTN 和notch1 轉錄及蛋白表達水平和hes1 轉錄表達水平Fig.4 NCSTN and notch1 transcription and protein expression levels and hes1 transcription expression levels in different hepatocellular carcinoma samples

3 討論

肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，也是全球癌癥死亡的第三大原因［18］，其起病隱匿、缺乏早期診斷和預防方法［19］，晚期肝癌難以治愈且容易復發，嚴重影響患者的生存質量。HCC 是肝癌中最常見的類型，其占比可達90%，發病率在全球范圍內處于不斷增長中，仍然是全球性的健康挑戰［18］。

NCSTN 基因在HCC 中發揮致癌作用［14-15，20］，但現有研究較少記錄nicastrin 蛋白在小鼠肝細胞及肝癌細胞中的定位表達，大多研究應用人肝癌細胞株進行研究，且nicastrin 在不同肝癌細胞株中表達不一致［20］，目前缺少nicastrin 在hepa1-6 細胞構建的小鼠肝癌組織中表達的研究。本研究顯示nicastrin 在肝癌組織中表達增多，生信分析支持在肝癌組織中NCSTN 的表達增高，故本實驗認為NCSTN 在以hepa1-6 細胞構建的小鼠肝癌中發揮促癌作用。

Notch1 是notch 家族成員之一，參與多種癌癥的發?。?1］，其在肝癌組織中常常高表達［11，22］，發揮促癌作用［23-24］，也有研究［12，25］觀察到notch1與NICD1在HCC 組織中表達下降。就現有的研究而言，尚未確定notch1 在HCC 中的具體作用，本實驗結果與notch1 在小鼠肝癌組織中表達降低的結果一致，認為notch1 作為抑癌分子參與小鼠肝細胞癌的生長，且目前尚無notch1 在使用hepa1-6 細胞構建小鼠肝癌模型中如何表達的研究，生信分析顯示存在notch1 低表達肝癌患者，因此應用hepa1-6細胞構建的小鼠肝癌模型可作為notch1 低表達患者的肝癌動物模型用于實驗研究。

Hes1 是螺旋-環-螺旋（bHLH）蛋白家族的一份子，其作為抑制因子或激活因子在細胞分化、存活和凋亡中發揮作用［26］。在HCC 中，hes1 可通過調節CDKN1C/P57 的表達誘導人HCC 的衰老［16］，KK-LC-1 還可通過激活notch1-hes1 信號通路促進HCC 的進展［27］，研究［28］還發現hes1 在人肝癌組織中呈現高表達狀態，但在本實驗中，我們觀察到hes1 在小鼠肝癌組織中表達下降，hes1 受notch 信號通路的調控，在大多研究中我們發現hes1 與notch1 常呈現表達一致性［29-30］，生信分析顯示存在hes1 在HCC 中低表達的患者，基于此，我們認為在以hepa1-6 細胞構建小鼠肝癌組織中hes1 發揮抑癌作用。

綜上所述，本課題認為nicastrin、N1ICD 和hes1 蛋白主要在小鼠肝竇內皮細胞中表達，肝細胞中表達較少；相比正常肝組織，nicastrin 蛋白在小鼠肝癌組織中表達增多，N1ICD 及hes1 蛋白表達減少；且以hepa1-6 細胞構建的小鼠肝癌模型可作為notch1-hes1 低表達肝癌患者的動物模型用于基礎研究。因本實驗小鼠數量較少，下一步需擴大數量進一步證實實驗結果，并結合相關臨床病例進行深入研究。

【Author contributions】YAN Lu performed the experiments and wrote the article.YAN Lu performed the experiments.YAN Lu revised the article.SHI Tianwei designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.