三七對慢性腎衰竭大鼠Sortilin蛋白、Toll樣受體及血管鈣化的影響

黃志敏 陸良喜 江旖旎 劉曉羽 張知英 吳金玉

1廣西中醫藥大學第一附屬醫院、廣西中醫藥防治醫學分子生物重點實驗室（南寧 530023）；2廣西中醫藥大學研究生院（南寧 530001）

慢性腎臟疾?。╟hronic kidney disease，CKD）已經成為日益嚴重的公共健康問題，到2040 年預計CKD 將成為全球第五大最常見的死亡疾?。?］。心血管疾病被認為是慢性腎衰竭（chronic renal failure，CRF）患者的主要并發癥和死亡原因。血管改變特別是動脈粥樣硬化和血管鈣化（vascular calcification，VC）是CKD相關心血管疾病死亡率的重要影響因素［2］。有研究［3］認為VC 主要出現在腎臟病的終末期或透析患者中，然而最近的動物模型證實VC 可以出現在腎臟病更早的階段，可能在CKD 2 期就已出現VC，并且CKD 3 期以上患者VC 發病率較非CKD 患者高4 倍以上［4］。因此，尋找延緩CRF 血管鈣化的藥物對預防和降低CRF 心血管事件尤為重要。全基因組關聯研究發現編碼Sortilin 蛋白的Sort1 基因位于染色體1p13.3 位點，是血脂異常和冠狀動脈粥樣硬化的致病基因［5］，氨甲?；疭ortilin 可能是CKD 血管鈣化的危險因素［6］。Sort1 介導免疫細胞中相關炎癥因子的表達，可能與Toll 樣受體（Toll-like receptors，TLRs）TLR3、TLR4、TLR7、TLR9 信號通路相關［7］。腎臟替代治療是西醫的優勢，中醫藥治療CRF 的優勢在于延緩早、中期疾病進展。本研究以Sortilin 為切入點，基于Sortilin 與TLRs 的生物學功能探討三七對CRF 血管鈣化的影響，闡明三七抗CRF 血管鈣化的作用機制。

1 材料與方法

1.1 設計 隨機對照動物實驗。

1.2 時間及地點 于2022 年1 - 6 月在廣西中醫藥防治醫學分子生物重點實驗室完成。

1.3 材料

1.3.1 實驗動物及分組 12 周齡清潔級SD 雄性大鼠，體質量（210 ± 39） g，共36只。采購自長沙市天勤生物技術有限公司，許可證號是：SCXK（湘）2019-0014。本研究實驗方案已通過實驗動物福利倫理審查委員會批準（編號：DW20221221-242）。在廣西中醫藥防治醫學分子生物重點實驗室飼養，保持室溫18 ～ 25 ℃，分籠飼養。采用隨機數字表法，把SD 大鼠隨機分為正常組、模型組、三七低劑量組、三七中劑量組、三七高劑量組、骨化三醇組，每組6 只。動物實驗過程中嚴格遵守倫理道德標準。

1.3.2 實驗藥物、主要儀器和試劑 腺嘌呤（A8330，25 g，廠家：Solarbio），三七單味配方顆粒（江蘇省江陰市天江藥業有限公司），骨化三醇膠丸（上海羅氏制藥有限公司，國藥準字J20150011）。

光學顯微鏡（日本OLYMPUS，BX43），透射電子顯微鏡（HITACHI，HT7800/HT7700），酶標儀（BIOTEK，Elx800），核酸蛋白定量儀（美國丹諾爾，DS-11），電泳儀（北京六一公司，DYCZ-24DN型）。茜素紅S染色液（北京索萊寶科技有限公司，G1452），RUNX2 抗體（武漢三鷹，20700-1-ap），BMP2 抗體（affinity，AF5163），SM22α（affinity，AF9266），TLR7抗體（武漢三鷹，17232-1-AP），TLR9 抗體（Affinity，DF2970），Sortilin 抗體（武漢三鷹，12369-1-AP），山羊抗兔的二抗（北京中杉，ZB2301），山羊抗鼠的二抗（北京中杉，ZB2305），白介素-6（interleukin-6，IL-6）（伊萊瑞特，E-EL-R0015c），IFN-γ（聯科生物，EK380），IL-17A（伊萊瑞特，E-EL-R0566c），IL-10（伊萊瑞特，E-EL-R0016c）。

1.4 實驗方法

1.4.1 CRF 血管鈣化模型制備［8］加適當蒸餾水將腺嘌呤制成混懸液，實驗第1 ～ 4 周，除正常組外每日定時給予2.5%腺嘌呤混懸液［250 mg/（kg·d）］灌胃，同時聯合使用1.8%高磷飼料喂養；第5 ～ 8周隔日予腺嘌呤灌胃。正常組普通飼料喂養。HE染色可見模型組大鼠腎小球變性，腎小管擴張、萎縮、變形，腎小管內可見大量炎癥細胞浸潤，間質纖維明顯增生，腎小管及腎間質可見大片腺嘌呤結晶。提示模型成功。

1.4.2 給藥干預 造模當天開始，采用水溶液灌胃方式給藥，正常組和模型組大鼠每天灌胃等體積的0.9%生理鹽水；大鼠中藥給藥劑量根據人-大鼠體表面積（1∶6.25）換算，同時給予成人藥量的1、2、4 倍劑量：即分別以含生藥0.45、0.9、1.8 g/kg三七顆粒水沖劑給三七低、中、高劑量組灌胃。骨化三醇組大鼠（參考陳奇主編《中藥藥理實驗方法學》體表面積等效劑量換算比率按人常用量0.25 μg/d，大鼠劑量0.25 μg × 0.018 = 0.004 5 μg，200 g 體質量大鼠的劑量為0.004 5 μg，0.004 5 μg/0.2 kg=0.022 μg/kg，溶于生理鹽水）每天給予骨化三醇膠丸水溶液灌胃。各組大鼠按1 mL/100 g 體質量灌胃，每天1 次，連續8 周。

1.5 主要觀察指標

1.5.1 主動脈鈣鹽茜素紅染色 剝離胸主動脈，固定組織，石蠟包埋，切片脫蠟至水洗，蒸餾水洗數次；加入茜素紅S 染液染色5 ～ 10 min；蒸餾水沖洗；脫水透明，中性樹膠封片固定。顯微鏡下觀察鈣鹽沉積情況。

1.5.2 透射電鏡觀察主動脈鈣化 4%多聚甲醛灌注，取材4 ℃固定液固定2 h，4 ℃下PBS 漂洗3 次，每次30 min。樣品梯度脫水后，加入丙酮，對樣品滲透、包埋、固化處理。修片樣品厚度60 ～80 nm，用2.6%枸櫞酸鉛溶液避二氧化碳染色，在電鏡下觀察。

1.5.3 生化學指標檢測 紫外比色法檢測血清鈣（Ca）、磷（P）、肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）水平。

1.5.4 Western blot 法檢測主動脈Sortilin、TLR7、TLR9、RUNX2、BMP2、SM22α蛋白表達 取50 mg主動脈組織于液氮中剪碎研磨成細粉末狀，分裝于離心管中，加入500 μL 的RIPA 裂解液，提取總蛋白。按操作步驟進行電泳、轉膜，進行Sortilin（1∶2 000）、TLR7（1∶1 000）、TLR9（1∶1 000）、RUNX2（1∶1 000）、BMP2（1∶800）、SM22α（1∶1 500）免疫檢測，成像儀中曝光、拍照。蛋白表達量=目的蛋白灰度值/內參灰度值。

1.5.5 ELISA 法檢測大鼠血清IFN-γ，IL-6，IL-10和IL-17A 水平 嚴格按照ELISA 試劑盒說明書測定血清中IFN-γ，IL-6，IL-10 和IL-17A 濃度。

1.6 統計學方法 采用SPSS 22.0 軟件做統計分析，服從正態分布并且方差齊計量資料以±s表示，不服從正態分布或者方差不齊計量資料以［M（Q）］表示。服從正態分布且方差齊采用單因素方差分析，事后檢驗采用LSD-t；不服從正態分布或方差不齊的，采用非參數檢驗。以P＜ 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 實驗動物數量分析 實驗所選用36 只SD雄性大鼠，在實驗過程中無脫失，全部納入統計分析。

2.2 各組大鼠主動脈鈣鹽沉積茜素紅染色結果分析 正常組大鼠主動脈未見紅色鈣化點，模型組可見大面積紅色鈣鹽沉積，與模型組相比，三七低、中、高劑量組和骨化三醇組鈣鹽沉積減少，其中三七中、高劑量組、骨化三醇組明顯減少。見圖1。

圖1 各組大鼠主動脈鈣鹽茜素紅染色結果（標尺100 μm）Fig.1 Aortic calcium salt by stained with alizarin red of rats in each group （scale 100 μm）

2.3 各組大鼠主動脈鈣化及平滑肌線粒體超微結構透射電鏡結果 如圖2 所示，正常組主動脈平滑肌線粒體形態大小正常。模型組基質中有大量的鈣化結晶。三七低、中劑量組和骨化三醇組線粒體結構受損。三七低劑量組間質中存在大量鈣結晶。三七高劑量組線粒體結構完整，未發現鈣化。

圖2 各組大鼠主動脈透射電鏡超微結構變化（標尺1μm）Fig.2 Ultrastructural changes of aorta under transmission electron microscope of rats in each group（scale 1μm）

2.4 各組大鼠血清生化指標結果比較 與正常組比較，模型組大鼠血清BUN、Cr、P、TG、TC 含量明顯升高（P＜ 0.01），Ca 含量明顯降低（P＜ 0.01）。與模型組比較，三七中、高劑量組和骨化三醇組大鼠血清BUN、Cr、P、TG、TC含量明顯降低（P＜ 0.05，P＜ 0.01），Ca 含量明顯升高（P＜ 0.05，P＜ 0.01），并且三七高劑量組和骨化三醇組效果更顯著。見表1。

表1 各組大鼠血清BUN、Cr、Ca、P、TG 和TC 含量水平的比較Tab.1 Comparison of serum BUN，Cr，Ca，P，TG，and TC levels of rats in each group n = 6，±s，M（Q）

表1 各組大鼠血清BUN、Cr、Ca、P、TG 和TC 含量水平的比較Tab.1 Comparison of serum BUN，Cr，Ca，P，TG，and TC levels of rats in each group n = 6，±s，M（Q）

注：與正常組比較，ΔP ＜ 0.05，ΔΔP ＜ 0.01；與模型組比較，▲P ＜ 0.05，▲▲P ＜ 0.01

分組正常組模型組三七低劑量組三七中劑量組三七高劑量組骨化三醇組F/χ2值P值TC(mmol/L)1.66（0.21）3.60（0.82）ΔΔ 3.32（0.71）ΔΔ 2.81（0.53）ΔΔ▲▲2.03（0.27）ΔΔ▲▲2.26（0.34）ΔΔ▲▲27.99＜ 0.05 BUN（mmol/L）4.46（1.17）29.09（8.19）ΔΔ 23.49（7.91）ΔΔ 16.02（3.85）ΔΔ▲▲9.92（2.60）ΔΔ▲▲14.17（2.71）ΔΔ▲▲29.31＜ 0.05 Cr（μmol/L）41.85 ± 8.51 165.75 ± 32.41ΔΔ 141.06 ± 20.75ΔΔ▲113.85 ± 19.08ΔΔ▲▲68.32 ± 20.70Δ▲▲97.83 ± 16.68ΔΔ▲▲28.67＜ 0.05 Ca（mmol/L）2.54 ± 0.38 1.56 ± 0.31ΔΔ 1.72 ± 0.23ΔΔ 1.94 ± 0.25ΔΔ▲2.29 ± 0.37▲▲2.01 ± 0.27ΔΔ▲8.18＜ 0.05 P（mmol/L）2.03（0.30）6.13（1.99）ΔΔ 5.01（1.05）ΔΔ 3.95（0.53）ΔΔ▲▲2.92（0.85）ΔΔ▲▲3.75（0.60）ΔΔ▲▲28.19＜ 0.05 TG(mmol/L)0.48（0.07）1.46（0.48）ΔΔ 1.29（0.29）ΔΔ 0.99（0.15）ΔΔ▲0.78（0.22）ΔΔ▲▲0.84（0.14）ΔΔ▲▲27.61＜ 0.05

2.5 各組大鼠BMP2、RUNX2、SM22α、Sortilin、TLR7、TLR9 蛋白表達結果分析 與正常組比較，模型組大鼠主動脈組織BMP2、RUNX2、Sortilin、TLR7、TLR9 蛋白表達顯著升高（P＜ 0.01），SM22α蛋白表達顯著下降（P＜ 0.01）。與模型組相比，三七低、中、高劑量組和骨化三醇組BMP2、RUNX2、Sortilin、TLR7、TLR9蛋白表達下降顯著（P＜ 0.01），SM22α 蛋白表達顯著上調（P＜ 0.05，P＜ 0.01）。詳見表2，圖3、4。

表2 各組大鼠主動脈BMP2、RUNX2、SM22α、Sortilin、TLR7 和TLR9 蛋白的表達Tab.2 Expression of BMP2，RUNX2，SM22α，Sortilin，TLR7 and TLR9 protein in aorta of rats in each group n = 6， ± s，M（Q）

表2 各組大鼠主動脈BMP2、RUNX2、SM22α、Sortilin、TLR7 和TLR9 蛋白的表達Tab.2 Expression of BMP2，RUNX2，SM22α，Sortilin，TLR7 and TLR9 protein in aorta of rats in each group n = 6， ± s，M（Q）

注：與正常組比較，△P ＜ 0.05，△△P ＜ 0.01；與模型組比較，▲P ＜ 0.05，▲▲P ＜ 0.01

分組正常組模型組三七低劑量組三七中劑量組三七高劑量組骨化三醇組F值P值TLR9 0.18（0.04）0.71（0.21）ΔΔ 0.54（0.09）ΔΔ▲▲0.37（0.06）ΔΔ▲▲0.27（0.08）Δ▲▲0.23（0.07）▲▲31.95＜ 0.05 BMP2 0.31 ± 0.11 1.14 ± 0.05ΔΔ 0.83 ± 0.09ΔΔ▲▲0.62 ± 0.13ΔΔ▲▲0.61 ± 0.06ΔΔ▲▲0.49 ± 0.08ΔΔ▲▲59.52＜ 0.05 RUNX2 0.40 ± 0.05 1.14 ± 0.07ΔΔ 0.91 ± 0.05ΔΔ▲▲0.81 ± 0.08ΔΔ▲▲0.58 ± 0.06ΔΔ▲▲0.62 ± 0.03ΔΔ▲▲119.94＜ 0.05 SM22α 0.88 ± 0.04 0.28 ± 0.07ΔΔ 0.36 ± 0.05ΔΔ▲0.56 ± 0.05ΔΔ▲▲0.73 ± 0.04ΔΔ▲▲0.76 ± 0.03ΔΔ▲▲132.51＜ 0.05 Sortilin 0.42（0.06）1.01（0.03）ΔΔ 0.84（0.10）ΔΔ▲▲0.76（0.13）ΔΔ▲▲0.56（0.04）ΔΔ▲▲0.49（0.06）Δ▲▲32.42＜ 0.05 TLR7 0.32 ± 0.04 0.96 ± 0.07ΔΔ 0.72 ± 0.08ΔΔ▲▲0.66 ± 0.06ΔΔ▲▲0.47 ± 0.06ΔΔ▲▲0.50 ± 0.04ΔΔ▲▲79.40＜ 0.05

圖3 各組大鼠主動脈BMP2、RUNX2、SM22α 蛋白的表達Fig.3 Expression of BMP2，RUNX2，SM22αprotein in aorta of rats in each group

圖4 各組大鼠主動脈Sortilin、TLR7、TLR9 蛋白的表達Fig.4 Expression of Sortilin，TLR7 and TLR9 protein in aorta of rats in each group

2.6 各組大鼠血清相關炎癥因子水平分析 與正常組比較，模型組大鼠血清IFN-γ、IL-6、IL-10、IL-17A 含量明顯升高（P＜ 0.01）。與模型組比較，三七中、高劑量組和骨化三醇組大鼠血清IFN-γ、IL-6、IL-10、IL-17A 含量明顯降低（P＜ 0.01），并且三七高劑量組和骨化三醇組降低更顯著。見表3。

表3 各組大鼠血清IFN-γ、IL-6、IL-10 和IL-17A 水平的比較Tab.3 Comparison of serum IFN-γ，IL-6，IL-10 and IL-17A levels of rats in each group n = 6，±s，pg/mL

表3 各組大鼠血清IFN-γ、IL-6、IL-10 和IL-17A 水平的比較Tab.3 Comparison of serum IFN-γ，IL-6，IL-10 and IL-17A levels of rats in each group n = 6，±s，pg/mL

注：與正常組比較，△P ＜ 0.05，△△P ＜ 0.01；與模型組比較，▲P ＜ 0.05，▲▲P ＜ 0.01

組別正常組模型組三七低劑量組三七中劑量組三七高劑量組骨化三醇組F值P值IL-17A 39.99 ± 2.76 85.24 ± 13.05ΔΔ 72.40 ± 7.34ΔΔ▲59.19 ± 7.08ΔΔ▲▲48.16 ± 7.76▲▲55.61 ± 8.51ΔΔ▲▲23.10＜ 0.05 IFN-γ 34.17 ± 10.34 99.67 ± 19.91ΔΔ 90.27 ± 15.39ΔΔ 74.42 ± 11.15ΔΔ▲▲54.16 ± 11.92Δ▲▲62.43 ± 11.31ΔΔ▲▲18.39＜ 0.05 IL-6 80.67 ± 16.07 260.41 ± 57.42ΔΔ 195.63 ± 38.73ΔΔ▲▲163.49 ± 27.88ΔΔ▲▲122.63 ± 21.18Δ▲▲141.43 ± 29.69ΔΔ▲▲19.49＜ 0.05 IL-10 91.58 ± 12.56 170.83 ± 20.93ΔΔ 158.30 ± 16.23ΔΔ 139.14 ± 17.94ΔΔ▲▲103.25 ± 13.56▲▲124.29 ± 10.89ΔΔ▲▲23.12＜ 0.05

3 討論

CKD 發生VC 的機制復雜，目前認為與鈣磷代謝紊亂、血管平滑肌表型轉化、微炎癥、氧化應激、自噬、鈣化促進因子與抑制因子失衡等有關［9］。VC 過程中血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）的表型轉換主要表現為BMP2和RUNX2等骨形成相關蛋白的表達增加，SM22α、α-SMA等VSMC 抑制因子的減少［10-13］。本實驗研究結果提示模型組腎纖維化明顯，鈣磷及血脂代謝紊亂，主動脈大量鈣鹽沉積。模型組主動脈BMP2 和RUNX2 蛋白表達升高，SM22α 蛋白表達減少，提示已發生VSMC 的表型轉換，CKD 血管鈣化動物模型建立成功。延緩CKD 血管鈣化進程可以降低CKD 心血管事件發生率［2］，本研究中三七和陽性藥物處理后，降低大鼠主動脈BMP2 和RUNX2蛋白表達，促進SM22α 蛋白表達，提示三七能延緩CKD 血管鈣化進程。

Sortilin 蛋白具有多種生物學功能，研究發現Sortilin 蛋白通過調節外泌體裝載組織非特異性堿性磷酸酶，加速囊泡內鈣鹽沉積，直接促進動脈鈣化［14-15］。Sortilin 可能通過調節脂質代謝［16］，參與VC 的發生。與具有相同變異的非糖尿病患者相比，攜帶SORT1 變異的糖尿病患者血漿載脂蛋白、超低密度脂蛋白、TG 和LDL 水平下降幅度更大［17］。Sortilin 與CKD 血管鈣化關系密切，在CKD患者中研究發現Sortilin 氨甲?；c冠狀動脈鈣化相關，與年齡和腎功能無關；氨甲?；疭ortilin 可能導致CKD 患者心血管并發癥的升高，是心血管鈣化的危險因素［6］。本研究中模型組Sortilin 蛋白表達明顯升高，脂質代謝紊亂，三七治療后Sortilin 蛋白表達下降，脂質代謝改善，推測三七可能通過調節Sortilin 蛋白的表達影響脂質代謝，與其他學者的研究結論相似。

VC 以動脈壁內鈣和磷酸鹽的積累為特征，CKD 血管鈣化以中膜層為主。持續的慢性微炎癥狀態是VC 形成的病理基礎［18］。CKD 血管鈣化大鼠發生了明顯的炎癥反應失衡，其中促炎因子CINC、IFN-γ、IL-1α、IL-6、MCP-1、ICAM-1、TIMP-1、L-selectin 占主導作用［19］。CKD 患者的慢性微炎癥狀態以TNF-a 和IL-6 水平升高為特征，而IL-6可能促進CKD 中血管鈣化的發生和發展［20］，阻斷IL-6 信號通路可明顯減弱尿毒癥誘導的VSMC 成骨細胞轉變和鈣化［21］。研究［6］發現IL-6 與體外氨基甲?；疭ortilin 的親和力增強，直接作用血管細胞，促進血管鈣化。除與IL-6 結合外，Sortilin蛋白還被證明可與免疫細胞中的其他細胞因子結合，如IFN-α、IFN-γ、IL-17A、IL-10 和IL-12［7］。本研究結果提示CKD 血管鈣化模型存在微炎癥狀態，多種炎癥因子，如IFN-γ、IL-6、IL-10、IL-17A明顯升高，經過三七治療后Sortilin 及炎癥因子水平均下降，推測三七可能通過調節Sortilin 蛋白的表達影響炎癥因子水平，與其他學者的研究結論相似。

TLRs 是固有免疫系統的重要組成部分，可識別不同種類的病原體相關分子模式。TLR9 激活可以刺激血管炎癥反應促進斑塊形成［22］。在CRF大鼠模型中TLR9 激活后促進VSMC 中BMP-2 表達的增加，促進血管鈣化［23］。TLR7 在動脈粥樣硬化斑塊中高表達，即使是癥狀較輕的患者其動脈粥樣硬化斑塊中TLR7 表達仍然較高；進一步研究發現TLR7 激活后，斑塊內巨噬細胞和T 細胞迅速釋放IL-10［24］。另外，TLR7 促進IL-6 分泌在載脂蛋白e 缺陷小鼠的動脈粥樣硬化過程中發揮作用［25］。本研究結果中同樣發現TLR9、TLR7 參與了CKD 大鼠血管鈣化進程。

本研究中CKD 血管鈣化大鼠主動脈鈣鹽沉積，脂質代謝異常，鈣化相關蛋白BMP2、RUNX2、SM22α 表達異常，相關炎癥因子表達升高，這一結果與現有研究［26］Sortilin 通過多途徑調控脂質代謝，促進炎癥反應，導致血管鈣化或動脈粥樣硬化的結論一致，并且這可能與TLR9、TLR7 信號通路相關，這一結論與國外研究［7］結果一致。三七干預處理后，可以改善上述指標的變化。提示三七是延緩CRF 大鼠血管鈣化的有效藥物。為防治CKD 心血管事件的研究提供思路。本研究不足之處在于TLRs 與Sortilin 的關系未能進一步探究，Sortilin 是VC 的關鍵蛋白，其在VC 中的作用機制復雜，還需進一步研究。

【Author contributions】HUANG Zhimin performed the experiments and wrote the article.ZHANG Zhiying，JIANG Yini and LIU Xiaoyu performed the experiments.LU Liangxi revised the article.WU Jinyu designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.