S100A12在小鼠膿毒癥繼發急性肺損傷的表達及功能研究

顏才榮 朱景法 康麗萍 陳偉文

1.福建醫科大學附屬泉州第一醫院急診科，福建 泉州 362200；2.福建醫科大學附屬泉州第一醫院產科，福建 泉州 362200；3.福建醫科大學附屬泉州第一醫院重癥監護室，福建 泉州 362200

膿毒癥（sepsis）是病原微生物感染機體導致的全身炎癥反應綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS），膿毒癥患者病情發展到后期可能會引發膿毒癥休克（septic shock）、多器官功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）等多種情況，對患者的生命安全造成嚴重影響[1]。近年臨床治療水平在不斷提升，但是全球老齡化程度加重等因素導致膿毒癥的發病率仍舊呈現增高趨勢[2-3]。S100 鈣結合蛋白A12（S100 calcium binding protein A12，S100A12）是目前研究的一個重點，S100A12 與機體細胞增殖分化、炎癥反應、鈣離子穩態等都有一定的關系，研究結果顯示S100A12可以通過參與多種信號通路調節對機體炎癥反應產生作用。S100A12 當前主要是與自身免疫性疾病、腎病等疾病的研究相關，而與膿毒癥等急性感染病癥的相關研究相對較少。本文將研究S100A12在小鼠膿毒癥繼發急性肺損傷的表達及功能，探究S100A12 在小鼠膿毒癥繼發急性肺損傷中的作用和可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組

48 只雄性C57BL/6 小鼠（年齡7 ～8 周，體重20 ～25 g），隨機分為兩組：假手術（sham group，SHAM）組24 只、盲腸結扎穿孔（cecal ligation and puncture，CLP）組24 只。每組按實驗后4、8、12、24 h 分為4 個時間點亞組，每亞組各6 只。小鼠在12 h 晝夜循環、22℃～25℃溫度下飼養，可自由獲得食物和水。實驗動物許可證號：SCXK（豫）2019-0002。

1.2 小鼠膿毒癥模型建立

通過參閱文獻建立小鼠膿毒癥模型，即采用CLP。小鼠禁食8 h，用1%戊巴比妥鈉溶液（碧云天Beyotime，25 mg/kg，批號：S1872）腹腔內注射麻醉，常規手術消毒腹部，脫毛膏去掉右下腹部鼠毛。選擇正中偏下位置切開小鼠腹部，打開小鼠腹腔尋找盲腸末端。將大腸系膜和盲腸分離，盡量避免傷害小鼠大腸組織。在小鼠盲腸尾端0.5 cm 處使用無菌絲線緊緊系上，在結扎的盲腸部位中央使用無菌針頭刺穿，需要貫穿盲腸組織。結束后將小鼠盲腸回歸原位，進行縫合。SHAM 組分離盲腸末端后，不進行結扎穿孔，直接關閉腹腔，逐層縫合。所有動物均在術后背后注射無菌磷酸鹽緩沖液（PBS，國藥集團化學試劑有限公司，批號：10016318）1 ml，行液體復蘇治療。整個實驗過程在室溫下進行，術后小鼠自由飲食、飲水。置于動物實驗室內分籠飼養，每籠各6 只，記號分組。

1.3 小鼠處死及組織標本收集

在設定的目標時間點，即實驗后4、8、12、24 h，用1%戊巴比妥鈉溶液（25 mg/kg）腹腔內注射麻醉，將小鼠固定在鼠板上，沿胸腔中線剪開皮膚，接著剪斷肋骨開胸，露出心臟，用注射器從心尖部進針，穿刺進入左心室后進行心臟取血（0.5 ml/只），將收集到的血液樣本置于1.5 ml Ep 管中，室溫靜止2 ～4 h。血液中的血清析出之后，離心機設置4℃低溫，500 g/10 min離心處理，將上層血清取出，放置在新的Ep 管中，12 800 g/10 min 繼續離心處理。再次取血清，-80℃保存。

采血后在操作臺上用剪刀將胸主動脈剪斷，放血，將整個右肺用4 號絲線結扎，用剪刀剪下右上葉（右側最大的肺葉），小心取出，置于無菌平皿中，用磷酸鹽緩沖液沖洗后立即置液氮凍存，保存于-80 ℃液氮直至RNA 被提??；取右下肺葉用4%多聚甲醛（國藥集團化學試劑有限公司，批號：100092683）固定24 h。SHAM 組小鼠在麻醉后，同樣方法進行標本的采集。

1.4 酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbnent assay，ELISA）法測定血清S100A12蛋白水平

閱讀ELISA 法試劑盒（科艾博生物，批號：CB10001-Ra）說明書，按照步驟對微量反應板進行編號和分組（空白孔、標準孔和待測樣品孔），經過洗滌、加抗體、加酶結合物、加底物、加終止液、測吸光值，最終繪制標準曲線圖，根據曲線查出相應的濃度，再乘以稀釋倍數即為S100A12 蛋白的實際濃度。

1.5 逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）法檢測肺組織中S100A12、晚期糖基化終末產物受體（receptor for advanced glycation end products，RAGE）、核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）的mRNA表達水平

提取肺組織總RNA，經過RNA 定量、cDNA 反轉錄，運用Light Cyler480 自帶的軟件進行實時數據收集和定量分析。

1.6 肺組織病理學觀察及分析

小鼠相應時間點放血處死后，取右下肺葉用4% 多聚甲醛固定24 h，進行石蠟包埋、切片，蘇木精- 伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，在普通光鏡下觀察：按Zegdi R 法對急性肺損傷進行評分，綜合肺泡水腫、間質水腫、肺泡內白細胞聚集數量、出血、肺泡壁厚度等情況，把肺損傷程度分為5 級：0= 無損傷，1= 輕度損傷，2= 中度損傷，3=重度損傷，4=極重度損傷。并尋找合適的視野，拍照存檔。

1.7 統計學方法

所有數據均由SPSS 26.0 統計學軟件處理，不符合正態分布、方差齊性的計量資料采用[M（P25，P75）]表示，采用Mann-WhitneyU檢驗，多組相關數據之間的比較采用Friedman 秩和檢驗。P< 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料

CLP 組小鼠在實驗后4 h，活動度下降，呼吸頻率加快，情緒不穩定，出現躁動、目光呆滯、精神不振等情況。在實驗后12 h，小鼠癥狀加重，開始出現寒戰、呼吸窘迫、對外界反應遲鈍、活動不靈活等現象，口鼻眼角均有分泌物出現，停止進食。之后小鼠癥狀加重，有死亡情況出現。SHAM 組小鼠情況良好，呼吸、精神、進食情況良好，無明顯分泌物，活動度高、無異常排泄物。

2.2 病理學觀察及評分

2.2.1 標本肉眼觀察 CLP 組小鼠肺部有淤血、腫脹表征，隨著實驗時間的加長，情況越發嚴重。小鼠肺部顏色偏向暗紅，肺部表面有明顯的出血點。SHAM 組小鼠肺部組織完整，表面無明顯出血點，肺部色澤偏向紅潤，質地相對柔軟。

2.2.2 HE 染色光鏡下觀察肺組織形態結構 CLP組小鼠肺細胞腫脹、廣泛性空泡變性、核濃縮，胞漿疏松呈絲網狀、著色深淺不一，纖維組織彌漫性增生，少量肺細胞萎縮、壞死。SHAM 組小鼠肺部結構清晰，無變性、壞死，肝細胞形態結構無異常，結構明晰，無炎性細胞浸潤。見圖1。

圖1 兩組小鼠病理切片（HE 染色，10×）

2.3 兩組小鼠肺組織病理學評分結果比較

在實驗過程中，對兩組48 只小鼠進行組織病理學評分。經正態性檢驗發現數據不符合正態性，采用Mann-WhitneyU檢驗比較兩組之間的差異性，經檢驗發現，不同時間點CLP 組小鼠的肺組織病理學評分明顯高于SHAM 組，評分在實驗后12 h 開始明顯升高，在實驗后24 h 到達最高值，差異有統計學意義（P< 0.05）。見表1。

表1 兩組小鼠肺組織病理學評分比較[分，M（P25，P75）]

2.4 血清指標的ELISA檢測分析

在實驗過程中，經正態性檢驗發現數據不符合正態性，采用Mann-WhitneyU檢驗比較兩組之間的差異性，同時采用Friedman 秩和檢驗比較同一組不同時間濃度是否存在差異。經檢驗發現，CLP 組小鼠的S100A12 ELISA 檢測水平明顯高于SHAM 組，在實驗后4 h 開始明顯升高，在實驗后12 h 到達最高值，之后稍有回落，差異有統計學意義（P< 0.05）。見表2。

表2 兩組小鼠血清指標的S100A12 ELISA檢測結果比較[ng/ml，M（P25，P75）]

2.5 組織各指標 RT-PCR 檢測分析

經正態性檢驗發現數據均不符合正態性，采用Mann-WhitneyU檢驗比較兩組之間的差異性，同時采用Friedman 秩和檢驗比較同一組不同時間濃度是否存在差異。經檢驗發現，CLP 組小鼠RAGE mRNA、NF-κB p65 mRNA、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α mRNA 相對表達量相較于SHAM 組明顯增高，其中RAGE mRNA 在實驗后8 h 開始升高，至24 h到達最高值，差異有統計學意義（P< 0.05），見表3。NF-κB p65 mRNA、TNF-α mRNA 相對表達量在實驗后4 h 即明顯升高，并明顯高于SHAM 組，差異有統計學意義（P< 0.05），見表4 ～5。

表3 兩組小鼠RAGE RT-PCR檢測結果比較（×10-3）[μg/μl，M（P25，P75）]

表4 兩組小鼠NF-κB RT-PCR檢測結果比較[μg/μl，M（P25，P75）]

表5 兩組小鼠TNF-α RT-PCR檢測結果比較[μg/μl，M（P25，P75）]

3 討論

成人流行病學研究表明[4-5]，全球每年有超過1800 萬例嚴重膿毒癥，發病率為0.001%，且患者例數仍持續上漲，患者例數增長速度約為年均1.5%[6-8]。膿毒癥屬于急性感染疾病，患者一般機體水平相對較低，常有合并高血壓、腦卒中等疾病的情況，目前臨床上尚未有統一的有效治療方案[9]。臨床治療膿毒癥一般采用常規替代治療、抗生素使用、單一細胞因子拮抗等治療方案[10]。臨床治療和相關研究顯示，這些治療方案均不能獲得較為理想的治療效果，對患者預后水平的改善不利。進一步解析膿毒癥的發病機制，通過明確膿毒癥的具體病理機制來尋求新的治療方案是當前膿毒癥相關研究的重點之一。在過去的研究中[11-13]，膿毒癥被認為是過度炎癥反應，一般采取拮抗過度炎癥的治療方式進行治療。但是隨著研究的不斷深入，膿毒癥的病理機制進一步明確。膿毒癥發病過程中，患者體內的各種細胞因子水平會持續升高，各種細胞因子互相作用，會導致患者血液中多種炎癥因子水平過高，對患者造成一系列損傷級聯反應[14]。膿毒癥病情發作過程中的炎性因子反應是一個復雜的交互的網絡作用，采用單一炎性因子拮抗治療并不能取得較好的治療效果。因此不少研究學者轉向生物分子學[15]，試圖從膿毒癥的病理機制和炎癥反應信號通路及相關蛋白入手，探究膿毒癥的治療方案。膿毒癥發展過程中會引發全身炎癥反應，患者機體中的多組織多器官都會受到一定程度的影響，患者很有可能會出現多種并發癥。膿毒癥繼發急性肺損傷是膿毒癥治療過程中較為常見的一種并發癥。當前針對膿毒癥繼發急性肺損傷還沒有較好的治療方案，原因在于膿毒癥無法短期治愈，患者肺部會持續遭受損傷。本研究主要是針對膿毒癥導致的急性肺損傷，結果顯示隨著膿毒癥的加重，小鼠肺部組織受到損壞，肺部出現明顯損傷，S100A12、RAGE、NF-κB、TNF-α 表達水平上升，S100A12 水平與促氧因子、肺部損傷存在正相關性，提示S100A12可能與膿毒癥后急性肺損傷存在一定的關系。

結合已有的研究，可以合理推測在膿毒癥小鼠急性肺損傷中S100A12 的表達與小鼠急性肺損傷病情發展存在一定的關系，S100A12 表達水平可能可以用于膿毒癥患者診斷中，改善膿毒癥患者急性肺損傷診斷水平不易、預后水平較低的問題。