肺祖細胞抑制博來霉素誘導的小鼠肺纖維化

陳 佳 黃燕霞 馮玉麗 劉貝珠

廣州市番禺區何賢紀念醫院，廣東 廣州 511400

肺纖維化（pulmonary fibrosis，PF）是一種慢性、進行性的肺部疾病，目前幾乎沒有治愈的方法，而且預后不良[1]。肺泡上皮的損傷和再生能力下降是肺纖維化的機制之一[2]。本研究通過體外誘導人胚胎干細胞（human embryonic stem cell，HESC）分化為肺祖細胞（lung progenitor cells，LPC），移植至健康及博來霉素誘導PF 的免疫缺陷小鼠體內，發現LPC 可以在小鼠體內長期存活并抑制PF 的程度。在PF 小鼠中，LPC 可以降低α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）和細胞外基質蛋白-1（extracellular matrix protein 1，ECM-1）的表達，同時抑制細胞凋亡。但未找到LPC 在體內表達表面活性物質C（surfactant associated protein C，SPC），分化為肺泡上皮的證據。本研究提示LPC 可以抑制小鼠PF 的程度，為PF 的治療提供一種可行的策略。

1 材料與方法

1.1 材料

NCG（NOD/ShiLtJGpt-Prkdcem26Cd52IL2rgem26Cd22/Gpt）小鼠購自江蘇集萃藥康生物科技有限公司，雌性，6 ～8 周齡。4%多聚甲醛固定液、免疫染色強力通透液、凋亡檢測試劑盒和Triton X-100 購自碧云天。人胚胎干細胞H9 系（HES H9）購自廣州徠智生物科技有限公司。DMEM 培養基、F-12 培養基購自Gibco公司。mTeSR1 干細胞培養基、ReLeSRTM 和StemDiff Definitive Endoderm Kit 購自StemCell Technologies 公司。蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色試劑盒、Masson 染色試劑盒、細胞膜橙色熒光探針（1，1’-dioctadecyl-3，3，3’，3’-tetramethylindocarbocyanine perchlorate，DiI）和羥脯氨酸（hydroxyproline，HYP）檢測試劑盒購自索萊寶。防熒光淬滅封片劑（含DAPI）購自白鯊易。

1.2 HES H9體外培養并分化為LPC

HES H9 細胞體外培養并分化為LPC，培養方法參考StemCell Technologies 公司技術手冊，分化方案參考Hawkins 等[3]和Peng 等[4]的方法。

1.3 NCG小鼠肺纖維化造模及分組

NCG 小鼠隨機分為對照組10 只、造模組20 只和治療組20 只。對照組只通過氣管灌注LPC[1×106個細胞/只，重懸于40 μl 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）]；造模組通過氣管灌注博來霉素（2 μg/10 g）；治療組氣管灌注博來霉素（2 μg/10 g）后2 周再灌注LPC（1×106個細胞/只，重懸于40 μl PBS）。LPC 移植前使用DiI細胞膜橙色熒光探針標記。小鼠每2 天記錄體重，4 周后犧牲，取肺組織進行冰凍切片，檢測α-SMA、ECM-1 的表達，肺細胞凋亡和LPC 分化為SPC 成熟肺上皮的情況。病理切片進行HE、Masson 染色，并檢測HYP 的表達。

1.4 相關指標檢測方法

1.4.1 胚胎分化各階段免疫熒光和細胞流式術 各階段細胞提前接種于共聚焦培養皿，去除培養基，用PBS 清洗2 次，固定10 min，破膜5 min。使用叉頭框轉錄因子A2（forkhead box transcription factor A2，FOXA2）和甲狀腺轉錄因子-1（thyroid transcription factor-1，TTF-1/NKX2.1）抗體進行孵育，二抗孵育后加入DAPI 防熒光淬滅劑，使用共聚焦顯微鏡拍照記錄。細胞流式術處理基本同免疫熒光，處理完畢后上機。DE 階段使用流式檢測趨化因子受體4（chemokine receptor-4，CXCR4）和免疫熒光檢測FOXA2 評估分化率。LPC 階段使用流式檢測和免疫熒光檢測NKX2.1 評估分化率。

1.4.2 肺組織的冰凍切片免疫熒光 處死小鼠后剪開胸腔，暴露肺和心臟，剪開左心耳，從右心室注射冰凍PBS 灌洗肺部，減少紅細胞影響。分離肺組織后固定24 h，脫水24 h。肺組織包埋后，-80℃冰凍2 h 后進行切片。切片解凍后破膜處理，洗滌后使用免疫組化筆標記組織區域。對照組孵育SPC 抗體，造模組和治療組孵育α-SMA 和ECM-1 抗體。使用共聚焦顯微鏡拍照記錄，使用凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡情況。每個切片隨機選取3 個視野（放大倍數為400 倍）。陽性面積為熒光面積占所檢查的總組織面積的百分比（%Pixel）。

1.4.3 肺組織的石蠟切片HE 和Masson 染色 小鼠肺部取材方法同冰凍切片。取得小鼠肺部組織后使用4%多聚甲醛固定液浸泡48 h，使用全自動脫水機脫水處理后石蠟包埋。石蠟切片經二甲苯脫蠟后，使用HE 染色試劑盒、Masson 染色試劑盒染色。樹漆封片后在光學顯微鏡下拍照記錄。使用Ashcroft score 評估肺纖維化程度，分為0 ～8 個等級，其中0 表示無纖維化，8 表示最嚴重的纖維化。每個切片隨機選取3 個視野（放大倍數為100 倍）。

1.4.4 肺組織HYP 含量測定 取0.2 g 小鼠肺部置于2 ml EP 管中，剪碎，加入1.5 ml 的6 mol/L 的鹽酸溶液，置于煮沸的水浴鍋中3 h。12 000 g 離心10 min，取上清液待測。按照HYP 檢測試劑盒說明書制訂標準曲線以及加入相關試劑。測定吸光度，計算HYP 含量。

1.5 統計學處理

使用SPSS 24.0 統計學軟件進行數據處理。計量資料用均數±標準差（±s）表示，行方差齊性檢驗。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。圖片采用Image J 處理，圖表采用GraphPad Prism 制作。P< 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LPC體外分化以及在NCG小鼠體內定植情況

HES H9 在體外分化為LPC 是需要經過DE 階段，此階段的標志物為FOXA2 和CXCR4，免疫熒光和細胞流式術顯示，FOXA2 和CXCR4 的表達率能達到90%。而LPC 的主要標志物為NKX2.1，免疫熒光和細胞流式術顯示，LPC 的分化效率為70%（圖1A ～D）。將LPC 分別移植至對照組NCG 小鼠及造模組肺纖維化NCG 小鼠肺后4 周取材，通過冰凍切片依舊能找到預染Dil 染料LPC，提示LPC 能在正常肺部和纖維化肺部定植（圖1E ～F）。但通過免疫熒光染色，發現LPC 細胞并不表達成熟肺上皮的標志物SPC，提示LPC 只能在肺內定植，但不能分化為成熟肺上皮。

圖1 LPC 體外分化以及在NCG 小鼠體內定植情況（n ≥10）

2.2 LPC對肺纖維化NCG小鼠肺部結構影響

HE 染色和Masson 染色結果顯示，與對照組的肺組織相比，造模組出現了明顯的肺纖維化，肺泡正常結構被破壞，取而代之的是致密的膠原組織。而治療組與造模組肺纖維化程度相比明顯減輕，但與對照組相比，仍然有一定程度的肺纖維化（圖2A ～B）。對照組、造模組、治療組反映肺纖維化程度的Ashcroft score 分別為（2.79±0.18）、（6.25±0.30）、（3.94±0.11），各組之間的差異有統計學意義（圖2C，F=1009.559，P=0.000）。

圖2 LPC 對肺纖維化NCG 小鼠體重及肺部結構影響（n ≥10）

2.3 LPC對肺纖維化NCG小鼠α-SMA、ECM-1和SPC表達的影響

α-SMA 和ECM-1 是肺纖維化組織的主要成分，也是反映纖維化嚴重程度的指標[5]。通過肺組織的冰凍切片，行免疫熒光觀察上述成分的表達量，通過計算熒光面積，從而對其進行半定量評估。結果顯示在灌注LPC 后，治療組α-SMA 和ECM-1 表達量均比造模組低，但不能低至與對照組相似水平（圖3A ～B）。對照組、造模組、治療組α-SMA 熒光面積分別為（1.19±0.15）、（13.50±0.65）、（2.34±0.06）%Pixel，各組之間的差異有統計學意義（F=4553.080，P=0.000）；ECM-1 熒光面積分別為（0.77±0.11）、（23.50±0.65）、（1.34±0.07）%Pixel，各組之間的差異有統計學意義（F=17123.305，P=0.000）。SPC 為Ⅱ型肺泡上皮分泌的蛋白，能反映肺上皮的功能[6]，結果顯示在灌注LPC 后，治療組SPC 表達量比造模組高，提示肺上皮功能有所恢復，但不能恢復與對照組相似水平（圖3C）。對照組、造模組、治療組SPC 熒光面積分別為（24.90±1.03）、（4.38±0.15）、（13.90±0.49）%Pixel，各組之間的差異有統計學意義（F=4677.085，P=0.000）。

圖3 LPC 對肺纖維化NCG 小鼠α-SMA、ECM-1 和SPC 表達的影響（n ≥10）

2.4 LPC對肺纖維化NCG小鼠羥脯氨酸（HYP）表達量和細胞凋亡的影響

HYP 是膠原特有的氨基酸，其含量直接反映膠原水平的高低[7]。與對照組比較，造模組HYP含量顯著升高，經過LPC 灌注治療后，HYP 水平下降，但不能降至正常水平（圖4A）。對照組、造模組、治療組HYP 濃度分別為（346.20±10.18）、（705.20±32.72）、（442.30±12.11）μg/mg，各組之間的差異有統計學意義（F=1079.647，P=0.000）。而反映細胞凋亡的原位末端轉移酶標記技術（TdTmediated-dUTP nick end labeling，TUNEL）染色實驗中，造模組細胞凋亡水平明顯高于其他組，對照組、造模組、治療組熒光面積分別為（1.94±0.22）、（31.90±1.70）、（4.83±0.22）%Pixel，各組之間的差異有統計學意義（圖4B，F=3962.008，P=0.000）。

圖4 LPC 對肺纖維化NCG 小鼠HYP 表達量和細胞凋亡的影響（n ≥10）

3 討論

間充質干細胞和胚胎干細胞在肺纖維化治療方面取得了顯著的進展，許多研究表明它們可以減輕肺纖維化的程度[8-9]。然而，這些研究大多數顯示間充質干細胞無法替代和修復受損的上皮細胞[10]，而直接移植胚胎干細胞則存在形成畸胎瘤的風險[11]。為了解決這些問題，本研究將胚胎干細胞分化為肺系祖細胞，減少畸胎瘤形成的風險，并采用同系的細胞進行移植，以期望實現原位修復，為臨床應用提供實驗室支持。通過在實驗室中進行此項研究，為肺纖維化的治療提供了一種新的方法。然而，盡管本研究在實驗室環境中取得了一定的成功，但在臨床應用中仍需進一步的研究和驗證。

目前，關于使用LPC 移植治療肺疾病的研究較少，主要是因為LPC 的誘導和產量存在困難[12-13]。最近，一種商業方案出現，可以從HT2 陽性肺細胞中提取并誘導成成熟的肺上皮細胞[14]。本研究采用了一種從胚胎干細胞開始的LPC 誘導方案，該方案成熟且產量較大，適用于移植研究。有研究發現[15]，移植的LPC 能在肺中存活4 周的時間，但不能分化為能夠分泌SPC 的成熟肺上皮細胞，可能與缺乏分化因子和適宜的微環境有關。這一發現表明，LPC 可能通過旁分泌的方式緩解肺纖維化，而不是通過分化成成熟的上皮細胞替代原受損細胞。LPC 更接近于肺系細胞，可能具有更好的組織相容性。盡管本研究為LPC 在肺纖維化治療中提供了理論基礎，但仍需要進一步研究LPC 的分化機制和提高治療效果的方法，特別是解決LPC 分化受限的問題，需要探索提供適宜的分化因子和微環境的策略。

本研究結果顯示，治療組的細胞凋亡率較低，同時治療組中纖維化水平的代表性蛋白α-SMA、ECM-1 和HYP 的表達顯著增加。此外，代表肺上皮細胞功能的蛋白SPC 在治療組中也呈現出恢復的趨勢。研究結果表明低劑量肺上皮細胞（LPC）可能通過旁分泌途徑減少細胞凋亡，從而降低α-SMA、ECM-1 和HYP 的水平，保護肺上皮細胞，并達到緩解肺纖維化的目的。這些發現為干細胞轉化醫學領域提供了實驗基礎，為進一步研究LPC 在緩解肺纖維化中的作用提供了依據。然而，LPC 在體內未能成功分化為肺上皮細胞，無法替代受損的肺上皮細胞。為了克服這一局限性，可以考慮在體外繼續將LPC 分化為上皮細胞，然后再進行體內移植。這種方法可能有助于突破LPC 無法替代原生肺上皮細胞的限制，并進一步提高其在肺纖維化治療中的效果。然而，這一策略的實施需要更多的實驗和臨床研究來驗證其可行性和安全性。

綜上所述，本研究結果揭示了LPC 在減少細胞凋亡、降低纖維化指標蛋白水平、保護肺上皮細胞以及緩解肺纖維化方面的潛力。然而，進一步的研究仍需要探索LPC 的分化機制以及提高其在治療肺纖維化中的效果的方法。這將有助于推動干細胞轉化醫學的發展，并為肺纖維化患者提供更有效的治療選擇。