轉錄因子SOX3對卵巢顆粒細胞增殖和雌二醇分泌的影響

蔡 睿,張 浩,劉 壯,陳遠華,謝芬芬,洪 強

卵泡作為脊椎動物卵巢的結構和功能單位,主要由卵母細胞、顆粒細胞和卵泡膜細胞組成[1]。卵母細胞可通過分泌一些旁分泌因子來調節顆粒細胞的發育,而顆粒細胞分泌類固醇激素并產生促進卵母細胞發育的生長激素,為卵母細胞的生長發育提供能量和物質需求[2]。因此,顆粒細胞的功能正常對卵泡正常發育和卵子發生至關重要。研究[3]表明顆粒細胞的增殖和凋亡失衡以及雌激素合成紊亂是導致卵泡閉鎖和卵巢早衰的主要原因。

性別決定區Y框蛋白3(sex determining region Y-box3,SOX3)作為性別決定區Y框蛋白B1(sex determining region Y-box B1,SOXB1)亞家族一員,參與調控骨肉瘤、卵巢癌細胞的增殖活化,促進腫瘤發生[4-6]。前期研究[7]發現,斑馬魚中SOX3的缺失下調性腺型芳香化酶(Cyp19a1a)基因,導致卵巢中雌二醇合成能力下降,卵泡發育阻滯,生殖能力下降。該研究通過構建SOX3過表達慢病毒載體,感染并篩選獲得SOX3穩定過表達的人卵巢顆粒細胞(human ovarian granulosa cells,KGN)細胞系,探討SOX3對KGN的增殖活化和雌激素分泌的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞、質粒 人胚腎細胞系(HEK 293T)為本實驗室保藏;人卵巢顆粒細胞(KGN)細胞購于武漢普諾賽生命科技有限公司;慢病毒熒光標簽載體(pLV-EF1a-GFP-2A-Puro)以及包裝質粒(pGag/Pol、pRev、pVSV-G)購于上海吉瑪制藥技術有限公司。

1.1.2主要試劑 轉染試劑RNAi-Mate(上海吉瑪制藥技術有限公司,貨號:G04001);嘌呤霉素(上海碧云天生物技術有限公司,貨號:ST551);NotI、BamHI限制性內切酶(上海玉博生物科技有限公司,貨號:Fermentas FD0594、Fermentas FD0054);DNA聚合酶(上海生工生物股份有限公司,貨號:B600001-0001);ClonExpress?Entry One Step Cloning Kit(南京諾唯贊生物科技股份有限公司,貨號:C112-01);質粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒(北京天根生化科技有限公司,貨號:DP103-02、DP204-02);RNA提取試劑盒(山東思科捷生物技術有限公司,貨號:AC0205-A);反轉錄試劑盒(湖南艾科瑞生物科技有限公司,貨號:AG11711);TB Green?Fast qPCR Mix(大連寶生物工程有限公司,貨號:RR430S);BCA蛋白濃度測定試劑盒、RIPA裂解、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)(上海碧云天生物技術有限公司,貨號:P0012、P0013B、P0015、A0208);DMEM/F12培養基、胰酶、胎牛血清(美國Gibco公司,貨號:12634028、15090046、12484028);SOX3抗體(成都正能生物技術有限責任公司,貨號:862515);GAPDH抗體(武漢愛博泰克生物科技有限公司,貨號:AC001);山羊抗兔IgG二抗(武漢三鷹生物技術有限公司,貨號:SA000001-2);ECL化學發光劑( 美國 Thermofisher,貨號:34580);CCK-8試劑盒(北京蘭杰柯科技有限公司,貨號:BS350A);ELISA雌二醇檢測試劑盒(武漢酶免生物科技有限公司,貨號:MM-12505H1);PCR引物合成和目的基因測序(北京擎科生物科技股份有限公司),大腸埃希菌DH5a(德國merck公司,貨號:CMC0007)。

1.1.3主要儀器 PCR儀(杭州朗基科學儀器有限公司,型號:4484075);熒光顯微鏡(日本尼康公司,型號:EVOS M7000);實時熒光定量PCR儀(美國SYGENE公司,型號:CFX Connect);化學發光檢測儀(上海天能公司,型號:Tanon 2500);酶標儀(美國BioTek Epoch公司,型號:AMG-2201-020)。

1.2 方法

1.2.1PCR擴增獲得SOX3基因 在NCBI數據庫Gene-Bank中搜索人SOX3(NM_005634.3)基因的序列,根據數據庫中搜索到的人SOX3基因序列來設計并合成PCR引物(表1),依據克隆需要,在正向引物和反向引物中分別加上慢病毒載體pLV-EF1a-GFP-2A-Puro的Not I和Bam HI限制酶兩側同源序列(表1下劃線部分)。以KGN細胞的cDNA為模板,按照試劑操作說明進行PCR擴增,反應體系為50 μl,反應條件:95 ℃預變性3 min;94 ℃,30 s;55 ℃,30 s;72 ℃,1 min;30個循環;72 ℃延伸5 min。PCR反應完成后,經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后回收SOX3基因。

表1 SOX3基因PCR擴增引物序列

1.2.2SOX3過表達慢病毒載體的構建 取pLV-EF1a-GFP-2A-Puro慢病毒載體2 μg,用Not I和Bam HI限制酶對其進行雙酶切,37 ℃酶切2 h,0.8%瓊脂糖凝膠電泳,當酶切產物電泳到適當的位置,用刀片將目的條帶區域切下,DNA凝膠回收試劑盒回收線性化載體。按照ClonExpress?Entry One Step Cloning Kit的操作說明,將回收的SOX3片段同源重組克隆到線性化的載體中,將重組產物轉化到大腸埃希菌DH5a涂抹在氨芐青霉素抗性的平板上,37 ℃恒溫箱培養過夜,從平板上挑取單個菌落置于10 ml的溶菌肉湯液體培養基中,37 ℃、220 r/min搖床培養過夜,隨后進行質粒提取,用Not I和Bam HI進行雙酶切鑒定,將雙酶切正確的質粒進行測序。挑選測序完全正確的質粒用于后續實驗。

1.2.3慢病毒轉染和滴度測定 慢病毒轉染:選取長勢良好的HEK 293T細胞接種到10 cm的培養皿中,在37 ℃、5% CO2培養箱中培養至細胞密度達到70%～80%時進行轉染。設置pLV-NC組(轉染pLV-EF1a-GFP-2A-Puro、pGag/Pol、pRev、pVSV-G)和pLV-SOX3組(轉染pLV-EF1a-GFP-2A-Puro-SOX3、pGag/Pol、pRev、pVSV-G),按照RNAi-Mate轉染試劑的說明,轉染到HEK 293T細胞,轉染6 h后更換為新的完全培養基,繼續培養48 h后收集含有慢病毒顆粒的細胞上清液,1 200 r/min離心30 min過濾收集慢病毒濃縮液,分裝后凍于-80 ℃冰箱備用。滴度測定:將收集到的慢病毒原液,按101、102、103、104進行梯度稀釋后接種到KGN細胞中,在37 ℃、5% CO2培養箱中培養72 h,通過熒光顯微鏡計數綠色熒光細胞的數量,結合稀釋倍數計算病毒的滴度。

1.2.4篩選和建立穩定過表達SOX3的KGN細胞系 KGN細胞按照1.0×105細胞/孔接種于24孔板,待細胞密度達到70%～80%時,根據感染復數分別加入pLV-NC組和pLV-SOX3組的慢病毒和嘌呤霉素(5 μg/ml),培養12 h后更換為新的完全培養

基,繼續培養48～72 h后在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光的表達情況。由于慢病毒載體帶有嘌呤霉素抗性基因,故將培養基更換為含有嘌呤霉素(1 μg/ml)的培養基進行篩選,篩選2周后,帶有綠色熒光的細胞即為穩定轉染的細胞,將含有嘌呤霉素的培養基更換為新的不含嘌呤霉素的培養基,擴大培養直至獲得穩定轉染的細胞系。

1.2.5RT-qPCR檢測細胞中SOX3mRNA的表達 收集pLV-NC組和pLV-SOX3組的細胞置于冰上,用RNA提取試劑盒提取細胞的總RNA,反轉錄為cDNA,以該cDNA為模板,進行RT-qPCR擴增,檢測各組細胞中SOX3mRNA的表達情況,以β-actin為內參基因,采用2-ΔΔCT計算SOX3mRNA表達水平,引物序列見表2。

表2 RT-qPCR引物序列表

1.2.6Western blot法檢測細胞中SOX3蛋白表達水平 收集pLV-NC組和pLV-SOX3組的細胞,PBS緩沖液洗滌2次,冰上用RIPA裂解液裂解60 min,期間每隔10 min顛倒混勻1次,離心收集上清液,加入5×Loading buffer后于100 ℃水浴10 min。隨后進行12% SDS-PAGE電泳,半干法轉移至PVDF膜上。采用封閉液(5%脫脂奶粉)室溫封閉2 h后,分別加入SOX3一抗(1∶5 000)和GAPDH一抗(1∶7 000),4 ℃孵育過夜,TBST洗滌3次,加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶10 000),室溫搖床孵育2 h,TBST洗滌3次,將ECL化學發光試劑盒中的顯影液覆蓋至PVDF膜上,凝膠成像系統顯影成像。用ImageJ軟件對圖像進行灰度掃描,進行統計學分析。

1.2.7CCK-8法檢測細胞增殖能力 胰酶消化并收集pLV-NC組和pLV-SOX3組的細胞,進行計數。按照每孔體積100 μl,細胞密度為3 000細胞/孔接種到96孔板中,后置于細胞培養箱中培養,每組細胞設置6個復孔。在細胞接種后的24、48、72、96 h,向每孔滴加10 μl的CCK-8試劑,繼續置于細胞培養箱中孵育1 h,隨后用酶標儀測定在450 nm處的吸光度值,記錄并統計分析。

1.2.8ELISA測定雌二醇濃度 胰酶消化并收集pLV-NC組和pLV-SOX3組的細胞,進行計數。按照每孔1 ml體積,細胞密度為1×105細胞/孔接種到12孔板中,后置于細胞培養箱中培養,每組細胞設置6個復孔。細胞貼壁后,將培養基更換為含有雄烯二酮(10 μg/ml)的培養基,繼續置于細胞培養箱中培養24 h,隨后收集上清液按照說明書進行雌二醇濃度的測定,同時將對應的兩組細胞提取蛋白,按照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書進行測定,用測定的細胞蛋白濃度將雌二醇濃度均一化,記錄并統計分析。

1.3 統計學處理所有的實驗數據采用平均數±標準差表示。多組間的比較采用方差分析,兩組間的比較采用t檢驗。采用線性回歸分析繪制標準曲線。所有的圖表均用GraphPad Prism 8.0軟件繪制,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1SOX3的擴增及重組慢病毒表達載體的構建和鑒定SOX3基因的編碼序列全長為1 341 bp,PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳,結果顯示有明顯的目的條帶,且大小與預期結果一致(圖1A),表明SOX3基因擴增成功。將SOX3基因克隆至pLV-EF1a-GFP-2A-Puro載體上,獲得了慢病毒表達載體pLV-EF1a-GFP-2A-Puro-SOX3(圖1B)。隨后用NotI和BamHI雙酶切鑒定pLV-EF1a-GFP-2A-Puro-SOX3慢病毒載體,結果顯示,酶切條帶與預期一致(圖1C),基因測序結果顯示上述慢病毒載體中SOX3的序列與NCBI數據庫中SOX3序列一致(圖1D)。以上結果表明SOX3過表達慢病毒載體pLV-EF1a-GFP-2A-Puro-SOX3構建成功。

圖1 pLV-EF1a-GFP-2A-Puro-SOX3慢病毒載體的構建和鑒定

2.2 慢病毒轉染和穩轉細胞系建立的情況將已成功構建的慢病毒表達質粒和包裝質粒(pGag/Pol、pRev、pVSV-G)(圖2A)共同轉染到HEK 293T細胞,熒光顯微鏡下觀察轉染的HEK 293T細胞,結果顯示HEK 293T細胞GFP高表達,即慢病毒成功包裝(圖2B)。病毒滴度測定結果表明pLV-SOX3實驗組病毒滴度為1×108TU/ml,pLV-NC對照組病毒滴度為7×108TU/ml。隨后用慢病毒感染KGN細胞,獲得穩定表達的細胞系(圖2C)。

圖2 慢病毒轉染和SOX3穩定過表達KGN細胞系的建立

2.3 RT-qPCR和Western blot檢測的SOX3 mRNA和蛋白表達水平RT-qPCR檢測結果表明pLV-SOX3組的SOX3 mRNA水平較pLV-NC組上調(t=3.10,P<0.05)(圖3A)。Western blot檢測結果顯示,與pLV-NC組(0.40±0.01)相比,pLV-

圖3 SOX3 mRNA和蛋白表達水平的比較

SOX3組SOX3蛋白水平增加(t=7.88,P<0.05)(圖3B、C)。以上結果表明KGN細胞經pLV-EF1a-GFP-2A-Puro-SOX3慢病毒感染后,SOX3的mRNA和蛋白水平升高。

2.4 過表達SOX3對KGN細胞增殖能力的影響CCK-8法檢測結果顯示,與pLV-NC組相比,pLV-SOX3組在72 h和96 h時細胞的增殖能力明顯上升(t=8.82、23.76,均P<0.01)。見圖4。

圖4 CCK-8檢測SOX3過表達后不同時間KGN細胞的增殖能力

2.5 過表達SOX3基因對KGN細胞雌二醇分泌的影響ELISA檢測結果顯示,與pLV-NC組相比,pLV-SOX3組細胞培養液中雌二醇濃度升高(t=3.33,P<0.05)(圖5),表明過表達SOX3促進了KGN細胞雌二醇的分泌。

圖5 ELISA檢測的各組KGN細胞雌二醇濃度的比較

3 討論

卵巢早衰( premature ovarian failure,POF) 作為一種內分泌代謝紊亂性疾病,主要表現為卵巢功能衰竭,以雌激素缺乏和卵泡閉鎖為主要特征。POF不但可以導致不孕癥,同時還可能增加患骨質疏松癥、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病和神經退行性疾病等慢性疾病發生的風險[8],給婦女造成心理創傷。研究[9]表明卵泡發育與顆粒細胞的增殖和類固醇激素生成密切相關,顆粒細胞能夠分泌雌二醇、黃體酮和胰島素樣生長因子,促進卵母細胞生長,為卵母細胞的發育提供能量和營養物質,從而維持雌性動物的生殖功能;顆粒細胞功能紊亂會導致卵泡發育異常和卵泡閉鎖,進而促進卵巢早衰的發生。

SOX3基因家族的HMG盒是由79個氨基酸組成的DNA結合結構域,目前已經鑒定出30多個成員,主要參與維持個體內環境穩定、器官發生等過程[10]。研究[11-13]表明SOX3基因調控區發生基因組重排或染色體插入易位將導致人類XX男性性逆轉。SOX3在小鼠的性腺體細胞中表達,SOX3缺失會導致雌性小鼠卵泡發生閉鎖、畸形的卵母細胞增多以及生殖力下降[14]。在羅非魚中SOX3的缺失會導致卵子發生和卵母細胞生長過程被抑制[15]。因此,SOX3對卵泡發育有著重要作用。本研究構建SOX3過表達慢病毒載體,通過轉染篩選后建立穩定過表達SOX3的人KGN細胞系,并從mRNA和蛋白水平證明其可穩定過表達SOX3。CCK-8檢測結果表明過表達SOX3促進了人KGN的增殖能力,ELISA檢測結果顯示過表達SOX3促進了卵巢顆粒細胞雌二醇的分泌能力。以上的結果均表明SOX3對卵巢顆粒細胞的增殖活化和雌二醇分泌有著重要的促進作用。

綜上所述,SOX3作為一個重要的轉錄調控因子,參與維持卵巢顆粒細胞的功能,在卵泡發育和卵巢早衰過程中具有關鍵的調節作用。靶向過表達SOX3可能是治療卵巢早衰的有效途徑。本研究為POF的臨床治療提供了新的方向,為后續繼續對于SOX3在卵泡閉鎖和卵巢早衰中作用機制的研究奠定了基礎,但其中具體的調控機制仍需進一步研究。