肝細胞特異性Sirt3基因敲除小鼠模型的構建

許雅萍,王語涵,陳婷婷,李 南,高萍萍,李 玲,王 華,孫嫵弋

沉默信息調節因子3(silence information regulator 3,Sirt3)是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotina mide adenine dinucleotide,NAD)依賴性的去乙?；?屬于Sirtuins蛋白家族[1]。肝細胞作為肝臟中主要的實質細胞,其介導碳水化合物、脂質和蛋白質代謝、解毒和免疫細胞激活,以維持肝臟內穩態[2]。研究[3-6]表明,肝細胞在接受肝臟損傷和炎癥信號后會發生凋亡、壞死、自噬等,并通過釋放各種細胞炎性介質,參與藥物性肝損傷、病毒性肝病、肝纖維化等疾病的發生發展。

Sirt3作為一種重要的去乙?；?可通過維持肝細胞線粒體完整性和清除胞內活性氧抑制氧化應激,從而調控肝細胞凋亡、壞死等過程,在多種肝臟疾病中發揮重要調節作用[7-8]。研究[9]表明,正常小鼠Sirt3全身敲除后體內出現異常的氧化應激,但在腸上皮細胞中特異性敲除Sirt3基因后小鼠表現正常,而造模后與正常小鼠相比可明顯加速腸道癌變,提示細胞條件性敲除Sirt3對于研究疾病的病理機制十分必要。因此,該研究中,利用Cre-loxP重組酶系統的基因敲除技術,以原代肝細胞為對象,建立了肝細胞特異性Sirt3基因敲除小鼠模型,該模型成功建立后可在轉基因小鼠體內穩定遺傳,為進一步在各類肝臟疾病中闡述肝細胞Sirt3基因發揮的作用提供良好的實驗動物模型基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 體質量為20～25 g的雄性Sirt3flox/flox小鼠、Alb-Cre轉基因小鼠各8只均購自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司,均為C57BL/6J遺傳背景。本研究獲得安徽醫科大學臨床藥理研究所動物實驗倫理委員會批準(編號:PZ-2023-008)。本研究的實驗動物均由安徽醫科大學臨床藥理研究所SPF級動物房飼養和繁育,對飼養環境進行了精確的控制,保持在大約25 ℃的溫度和70%左右的濕度。實驗動物自由飲食和飲水。實驗動物的使用許可證號:SYXK(皖)2020-001。

1.1.2 主要試劑2×Taq PCR Master Mix(貨號:MT201)、50×TAE(貨號:EL102-01)、DNA marker(貨號:MD112)均購自北京博邁德基因技術有限公司;蛋白酶K(貨號:V900887-100MG)購自美國Sigma Aldrich公司;基因鑒定引物購自上海生工生物工程股份有限公司;Super Red核酸染料(貨號:BS354B)購自北京蘭杰柯科技有限公司;RIPA蛋白裂解液(貨號:P0013C)、苯甲基磺酰氯(phenylmethyl sulfonylfluoride,PMSF)(貨號:ST506-2)、5×電泳加樣緩沖液(貨號:P0015L)均購自上海碧云天生物技術公司;抗β-actin抗體(貨號:T0022)、抗Sirt3抗體(貨號:AF5135)均購自美國Affinity公司;抗Albumin抗體(貨號:66051-1-Ig)、辣根過氧化物酶山羊抗兔二抗(貨號:SA00001-2)和鼠二抗(貨號:SA00001-1)均購自美國Proteintech公司;ECL化學發光試劑盒(貨號:BL520B)購自北京Biosharp公司;Alexa Fluor 488標記的山羊抗鼠IgG熒光二抗(貨號:711-546-152)、Alexa Fluor 647標記的山羊抗兔IgG熒光二抗(貨號:715-606-150)均購自美國Jackson ImmunoResearch公司。

1.1.3 主要儀器化學發光凝膠成像分析系統(上海天能科技有限公司,型號:Tanon-5200);冰凍切片機(德國LEICA公司,型號:CM 1950);通用型電泳儀(北京六一生物科技有限公司,型號:DYY-7C);石蠟切片機(美國Thermo Fisher Scientific公司,型號:MICROM HM 325);玻片掃描儀(山東濟南丹吉爾電子有限公司,型號:Pannoramic MIDI);激光共聚焦顯微鏡(德國LEICA公司,型號:TCS SP8); Themal Cycler PCR儀(美國BIO-RAD公司,型號:T100)。

1.2 方法

1.2.1肝細胞特異性Sirt3敲除小鼠模型的構建策略與流程Sirt3基因位于Chr7染色體上,有10個轉錄子,根據Sirt3基因的結構,將Sirt3-201轉錄本的外顯子2～3作為敲除區域,該區域含有起始密碼子ATG編碼序列,敲除該區域會導致蛋白質功能的缺失。本研究使用Cre-loxP系統進行實驗,以Sirt3flox/flox小鼠和Alb-Cre小鼠進行配繁。Sirt3flox/flox小鼠是在Sirt3基因的2號和3號外顯子插入了loxP位點的實驗鼠,而Alb-Cre小鼠則是具有肝細胞特異性表達Cre重組酶的實驗鼠。通過同源重組,Alb-Cre重組酶可以特異性敲除Sirt3基因,因為它具有識別loxP位點的能力(圖1A)。在構建過程中,首先將Sirt3flox/flox小鼠與Alb-Cre+/+小鼠交配,產生了基因型為Sirt3flox/-/Alb-Cre+/-的小鼠,然后,這些小鼠與Sirt3flox/flox小鼠再次交配,生成了子代,其基因型為Sirt3flox/flox/Alb-Cre+/-小鼠(Sirt3Δhep小鼠)和Sirt3flox/flox/Alb-Cre-/-小鼠(Sirt3flox/flox小鼠)。見圖1B。

圖1 肝細胞特異性Sirt3基因敲除小鼠模型的構建策略(A)與流程圖(B)

1.2.2PCR鑒定小鼠基因型 在小鼠4周時,將鼠尾剪下,加入鼠尾裂解液300 μl,蛋白酶K 20 μl,在55 ℃水浴中過夜,第2天,12 000 r/min離心1 min,取出上清液,加入400 μl預冷的無水乙醇,輕輕吹打混合,使其在管內沉淀出白色絮狀DNA后,12 000 r/min離心5 min,棄去上清液。將70 %預先冷卻的乙醇400 μl混合,12 000 r/min離心5 min,棄去上清液,仔細吸干殘余乙醇,再打開離心管蓋,室溫靜置2 h,使其完全揮發。加入30 μl復溫的TE溶液使DNA溶解,混合均勻后放入4 ℃冰箱,備用。

PCR反應體系:12.5 μl 2×Taq Mix、9.5 μl去離子水、Sirt3或Alb-Cre基因鑒定引物(10 μmol/L)各1 μl和提取的小鼠DNA(100 ng/μl)1 μl。loxP和Alb-Cre的PCR擴增程序為:95 ℃、5 min;98 ℃、30 s,65 ℃(-0.5 ℃/循環)、30 s,72 ℃、45 s,20個循環;98 ℃、30 s,55 ℃、30 s,72 ℃、45 s,20個循環;72 ℃、5 min?；蜩b定引物序列見表1。在PCR擴增后,將產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析,并將凝膠置于化學發光凝膠成像分析系統中進行拍照觀察。

表1 肝細胞特異性Sirt3基因敲除小鼠的基因型鑒定引物序列表

1.2.3免疫熒光雙染檢測小鼠肝細胞中Sirt3表達 取6周齡的Sirt3Δhep小鼠和Sirt3flox/flox小鼠肝組織,多聚甲醛固定過夜。OCT包埋后,進行冰凍切片。PBS洗3次,使用PBS稀釋的Triton X-100室溫通透30 min,PBS洗3次,5% BSA/PBS封閉液室溫封閉1 h。加入抗Albumin(1∶150)、抗Sirt3抗體(1∶100),4 ℃孵育過夜,PBS洗3次,加入熒光二抗(1∶400)在室溫下孵育30 min,PBS洗3次,并用激光共聚焦顯微鏡拍照觀察。

1.2.4小鼠原代肝細胞的分離提取 利用改良版兩步灌流法提取原代肝細胞,將6周齡的兩組小鼠麻醉后消毒,打開腹腔。暴露肝門靜脈,平行插入留置針,用37 ℃、0.5 mmol/L的EGTA灌洗液Ⅰ按5 ml/min流速進行肝灌注約25 ml,灌入的同時剪開下腔靜脈,隨后用灌流液Ⅱ(含膠原酶Ⅳ的DMEM高糖培基)勻速灌流約25 ml至肝軟塌至出現皸裂。剪下肝放置培養皿中,加入15 ml完全培養基,撕裂肝包膜,形成肝細胞混懸液,用70 μm細胞網濾過,收集濾液。400 r/min離心5 min,棄上清液,重復多次,即得小鼠原代肝細胞。

1.2.5Western blot檢測Sirt3的表達 在上述分離獲得的Sirt3Δhep小鼠和對照組Sirt3flox/flox小鼠的原代肝細胞中,加入裂解液,提取總蛋白,同時提取小鼠的心、脾、肺和腎組織總蛋白。制備10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠,上樣電泳,將其置于PVDF薄膜上,然后用牛奶封閉,孵育抗Sirt3抗體(1∶1 000)、β-actin抗體(1∶1 000),置于冰箱4 ℃過夜,在進行TPBS洗脫之后,將二抗(1∶2 000)在室溫下孵育2 h,并且使用化學發光成像系統進行顯影。通過使用ImageJ軟件分析結果,測量了條帶的灰度值,并計算出各組目的條帶與內參β-actin的比值,以反映目的蛋白的相對表達水平,并對各組之間的差異進行了比較。

1.2.6HE染色 取小鼠肝、心、脾、肺和腎組織進行包埋、切片,將石蠟切片放入二甲苯溶液中去除石蠟后,依次用100%、95%、85%、70%的乙醇水化,蘇木精染色5 min,用流動水沖洗,0.1%的鹽酸乙醇進行分化,然后用流動水沖洗,在伊紅染液中2 s后,再用流動水沖洗,最后依次經70%、85%、95%、100%乙醇進行脫水,二甲苯透明,中性樹脂封片后在玻片掃描儀下觀察。

2 結果

2.1 肝細胞特異性Sirt3基因敲除小鼠的基因型鑒定結果Sirt3flox/flox/Alb-Cre小鼠與Sirt3flox/flox小鼠交配產生子代基因型鑒定結果見圖2。在DNA樣本中,若存在Sirt3flox/flox,則只擴增出423 bp長度的片段;若存在Sirt3flox/-,則同時擴增出342 bp的片段;若樣本含有Cre基因,那么會擴增出340 bp的片段。正如圖2A所示,小鼠編號1、3、4、5、7、8和9都攜帶著423 bp長度的Sirt3flox/flox基因;而在圖2B中,小鼠編號1、2、3、5、7、8和9都有攜帶340 bp長度的Cre基因的特征。在這些實驗中,編號為1、3、5、7、8和9的是Sirt3flox/flox/Alb-Cre小鼠,即Sirt3Δhep小鼠,而編號4的是Sirt3flox/flox小鼠。

圖2 Sirt3flox/flox/Alb-Cre小鼠基因型PCR鑒定結果

2.2Sirt3Δhep小鼠肝細胞中Sirt3的表達情況由于白蛋白是肝細胞特異性標記蛋白,為了驗證Sirt3在Sirt3Δhep小鼠肝細胞中被敲除,首先使用免疫熒光雙染法檢測Sirt3和白蛋白在小鼠肝組織中的共定位情況,其中紅色熒光蛋白標記為白蛋白,綠色熒光蛋白標記為Sirt3。圖3結果顯示,Sirt3flox/flox小鼠肝細胞中Sirt3熒光強度較強,有明顯表達,而Sirt3Δhep組小鼠肝細胞中Sirt3蛋白基本不表達,提示肝細胞Sirt3基因敲除成功。

圖3 免疫熒光雙染檢測小鼠肝細胞中Sirt3和白蛋白表達情況

2.3 Western blot檢測小鼠肝細胞中Sirt3蛋白的表達情況為進一步確證Sirt3在Sirt3Δhep小鼠肝細胞中被敲除,通過Western blot檢測Sirt3蛋白在小鼠原代肝細胞中的表達。結果如圖4所示,與Sirt3flox /flox小鼠相比,Sirt3Δhep組的小鼠肝細胞中Sirt3蛋白表達減少,下降約90%(t=32.861,P<0.01),提示肝細胞特異性Sirt3敲除小鼠模型成功構建。

圖4 Sirt3在兩組小鼠原代肝細胞中蛋白表達的比較

2.4 Western blot檢測小鼠心、脾、肺、腎組織中Sirt3蛋白的表達情況為了觀察Sirt3Δhep小鼠其他主要臟器組織中Sirt3表達有無變化,分別提取心臟、脾、肺、腎組織蛋白,Western blot檢測Sirt3蛋白表達。如圖5所示,Sirt3flox/flox組與Sirt3Δhep組小鼠的心、脾、肺及腎臟中均有Sirt3蛋白表達;與Sirt3flox/flox小鼠相比,Sirt3Δhep組小鼠的心、脾、肺及腎臟中Sirt3蛋白表達量無明顯差異(t=0.000、0.211、1.234、0.353,均P>0.05),提示構建的Sirt3Δhep小鼠Sirt3蛋白的表達在其他臟器中不受影響。

圖5 Sirt3在其他組織器官中蛋白表達的比較

2.5Sirt3Δhep小鼠組織的HE染色結果肝組織HE染色顯示,兩組小鼠肝臟細胞形態正常、排列規則且結構完整(圖6A),肝細胞的核呈現為圓形并位于中央,肝竇保持正常狀態。肝細胞索以放射性方式排列,其細胞質著色一致,且沒有發現炎癥細胞的滲透。提示肝細胞特異性敲除Sirt3基因對肝組織的形態結構及病理特征并無明顯影響。

圖6 小鼠各臟器組織HE染色圖

進一步觀察肝細胞特異性敲除Sirt3基因對其他主要組織器官的影響,HE染色結果如圖6B所示,兩組小鼠的心肌纖維結構特征完整、形態清楚、排列整齊;脾臟組織結構清晰,邊緣區清晰結構完整;肺部的組織構造顯示正常,肺泡之間的間隔分布比較均勻,沒有出現滲出或其他炎癥跡象;而腎臟形態完整,結構清晰可見,腎小球和腎小囊的囊腔大小正常,提示各組織形態學無明顯改變。以上結果提示肝細胞特異性敲除Sirt3基因對肝臟及主要器官的形態結構無明顯影響。

3 討論

由于C57BL/6小鼠遺傳背景清晰,且其應用范圍廣泛,除了被應用于各類模型的造模,也被用于制備不同的基因工程小鼠,以更深入地進行相應基因功能性及藥理學、藥效學研究。研究人員通過Cre-loxP系統建立不同的基因敲除C57BL/6小鼠模型[10-11],可以為不同類型疾病的研究提供良好的模型基礎。

已有研究[12]結果顯示,全身敲除Sirt3(Sirt3KO)小鼠在高脂飲食中表現出更嚴重的高脂血癥和脂肪性肝炎,提示Sirt3在肝臟疾病中可能具有十分重要的作用,然而也有研究[13]顯示,全身敲除Sirt3的小鼠也出現了胰島、心臟功能的損害,因此,全身敲除Sirt3的小鼠對于研究肝細胞Sirt3在肝臟疾病中的作用可能會受到其他疾病的影響,故全身敲除Sirt3小鼠在該研究領域中的應用受到限制[14]。因此,建立肝細胞特異性Sirt3敲除小鼠模型十分必要。

已有研究通過采用基因編輯技術[15]成功創建了僅在肝細胞中敲除Sirt3基因的小鼠模型。使用的Cre重組酶能夠識別并定位Sirt3基因兩端的兩個loxP位點,并能夠切除這兩個位點之間的Sirt3基因序列,從而敲除Sirt3基因。本研究對4周左右的小鼠進行鑒定,成功篩選出Sirt3Δhep和Sirt3flox/flox小鼠。免疫熒光雙染法和Western blot法檢測顯示Sirt3flox/flox小鼠肝細胞中Sirt3蛋白表達正常,而Sirt3Δhep小鼠肝細胞中Sirt3蛋白明顯降低,提示肝細胞特異性Sirt3敲除小鼠模型構建成功。HE染色結果顯示,兩組小鼠的肝臟組織形態學及病理特征并無明顯差異,心臟、脾臟、肺及腎臟等組織形態學也均無明顯差異,提示肝細胞特異性敲除Sirt3對心、脾、肺和腎的器官的形態結構無明顯影響。本研究成功建立了肝細胞特異性Sirt3基因敲除鼠模型,實現了Sirt3在肝細胞中的特異性敲除,可以為未來關于Sirt3在肝臟疾病和其他各種疾病中作用的研究,以及相關的分子調控機制提供可靠的實驗動物模型,這將有助于將來對Sirt3的功能和機制更深入地研究,并為疾病的治療和預防提供理論基礎。