髓系特異性Spi1基因敲除小鼠的構建和基因鑒定

吳旭銘,王卉卉,朱向玲,周園園,王安琪,張慧茹,劉 崇,涂佳杰

脾病灶形成病毒前病毒整合癌基因-1/富含嘌呤盒1(spleen focus forming virus proviral integration oncogene,Spi-1/purine rich box-1,PU.1)是鼠紅白血病中基因轉錄上調的一種原癌基因。人類的Spi1基因位于11號染色體,在骨髓和B淋巴細胞的發育過程中發揮重要作用。轉錄因子PU.1是E26轉化特異性轉錄因子家族的一員,該家族成員在多種人體組織中普遍表達,各成員發揮不同的生物學功能。PU.1蛋白有272個氨基酸,N-末端含有一個轉錄激活結構域,C-末端含有一個DNA結合結構域[1]。目前病理條件下PU.1的研究主要集中在免疫系統相關的癌癥,其在系統性自身免疫性疾病中的作用尚不清楚[2]。最近的研究[3-5]表明PU.1參與多種自身免疫性疾病的發展,包括類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis,RA)、實驗性自身免疫性腦脊髓炎和系統性紅斑狼瘡,并通過影響多種免疫細胞的功能來影響這些疾病的過程。課題組前期研究[6]表明,PU.1可直接靶向巨噬細胞和成纖維樣滑膜細胞中的FMS樣酪氨酸激酶3從而促進關節炎的發生發展。PU.1在多種免疫細胞中的特異性作用為RA的發病機制提供了新的思路和潛在的治療靶點。構建Spi1基因敲除小鼠對充分闡明 PU.1的病理作用機制及藥物靶點的明確具有重要意義。該研究利用CRISPR/Cas9技術和Cre/LoxP系統構建髓系特異性Spi1基因敲除小鼠,對后代子鼠進行基因型鑒定和蛋白水平驗證從而驗證小鼠構建結果,為進一步以PU.1為靶點的疾病和藥物研究提供基因工程動物模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物Spi1flox/+小鼠與賽業(蘇州)生物科技有限公司聯合構建;Lyz2-Cre+小鼠由該公司贈送,生產許可證號:SCXK(蘇)2018-0003。實驗動物通過安徽醫科大學臨床藥理研究所動物實驗倫理委員會批準,倫理審查批準號為PZ-2022-023,并在安徽醫科大學臨床藥理研究所動物實驗中心無特定病原體級動物房飼養繁殖。

1.2 主要材料GenCrispr NLS-Cas9-EGFP Nuclease(南京金斯瑞生物科技,貨號:Z03393);sgRNA、Donor載體由賽業(蘇州)生物科技有限公司合成;孕馬血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin,PMSG)(武漢艾美捷科技有限公司,貨號:HOR-272);人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG)(上海羽哚生物科技有限公司,貨號:YLY0803);M16培養基(美國Sigma-Aldrich公司,貨號:M7292);2×HotStrat Taq PCR Master Mix、50×TAE Buffer、Gelred核酸染料10 000×、100 bp Ladder DNA Marker(北京博邁德基因技術有限公司,貨號:MT205、EL102-01、EL108、MD112);瓊脂糖Agarose(德國BioFroxx公司,貨號:1110GR100);RPMI 1640培養基(上海逍鵬生物科技有限公司,貨號:C3010-0500);磷酸鹽緩沖液 PBS pH7.2(上海源培生物科技股份有限公司,貨號:B31OKJ);Western blot抗體:Anti-PU.1/Spi1抗體(英國Abcam公司,貨號:ab230336);β-actin抗體(美國Affinity公司,貨號:#T0022);辣根過氧化物酶偶聯親和山羊抗兔IgG(H+L)、辣根過氧化物酶偶聯親和山羊抗小鼠IgG(H+L)(武漢三鷹生物技術有限公司,貨號:SA00001-2、SA00001-1)。

1.3 主要儀器CO2培養箱(上海博旅儀器有限公司,型號:P-90A);熒光定量PCR儀(杭州朗基科學儀器有限公司,型號:T20);多功能水平電泳槽(上海天能科技有限公司,型號:HE-120);Tanon 1600系列全自動凝膠圖像分析系統(上海天能科技有限公司,型號:Tanon 1600)。

1.4 方法

1.4.1Spi1flox/+小鼠構建 根據Spi1Gene ID(20375)小鼠基因組序列信息,發現Spi1基因有5個轉錄本,根據Spi1基因的結構,推薦選擇第2號外顯子(Exon 2)所在的轉錄本為敲除區域。利用CRISPR/Cas9技術對Spi1基因進行改造,在Exon 2兩側各放置同向Loxp元件。利用美國麻省理工學院CRISPR Design軟件(http://crispr.mit.edu)設計篩選得到一對先導RNA(single guide RNA,sgRNA),即gRNA1(GAGTGAGTCTCCACGGCTTT)和gRNA2(AGGTCGAGCTCCGCGCTCCC)。根據sgRNA序列設計并合成Donor載體。篩選10只3～4周C57BL/6雌鼠,注射5 IU PMSG,46～48 h后再注射5 IU HCG;注射HCG 12 h后將雌鼠與成年的可育雄鼠交配,使雌鼠受精;次日將雌鼠安樂死后,從輸卵管內收集受精卵,放置37 ℃恒溫5 %的CO2培養箱內備用;將30 ng/μl Cas9蛋白、2 pmol/μl靶向Spi1基因的sgRNA和15 ng/μl含有Loxp位點的Donor供體載體混合體顯微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中,注射共計280枚受精卵,將注射完畢的受精卵轉移到M16培養基中,并放入37 ℃恒溫5 %的CO2培養箱內,培養0.5～1 h后進行移植;選取適齡的可育母鼠與輸精管結扎后絕育的雄鼠交配得到假孕母鼠,移植受精卵到假孕的C57BL/6J母鼠的子宮中,共計移植10只代孕鼠,19～20 d后獲得F0代。將陽性F0代(Spi1flox/flox)小鼠與C57BL/6J小鼠交配,得到穩定的F1代Spi1flox/+小鼠。

1.4.2Spi1flox/flox/Lyz2-Cre+小鼠獲得 將Spi1flox/+小鼠雌雄自交獲得Spi1flox/flox小鼠。Spi1flox/flox與Lyz2-Cre+小鼠交配,得到Spi1flox/+/Lyz2-Cre+小鼠。將Spi1flox/+/Lyz2-Cre+小鼠與Spi1flox/flox交配,最終得到Spi1flox/flox/Lyz2-Cre+小鼠和Spi1flox/flox/Lyz2-Cre-小鼠。Spi1flox/flox/Lyz2-Cre+小鼠為髓系特異性Spi1基因敲除小鼠(myeloid-specificSpi1knockout mice,KO小鼠);Spi1flox/flox/Lyz2-Cre-小鼠作為野生型(wild type mice,WT)小鼠。

1.4.3PCR鑒定Spi1flox/+和KO小鼠基因 剪取適齡小鼠鼠尾3 mm,置于無DNA污染的1.5 ml EP管,每支EP管加入50 μl鼠尾裂解液[25 mmol/L NaOH,0.2 mmol/L EDTA(pH=8.0)],95 ℃振蕩恒溫金屬浴30 min。3 000 r/min離心5 min后加入50 μl[4 mmol/L Tris-Hcl緩沖液 (pH=8.0)],于渦旋震蕩器上震蕩并充分混勻。3 000 r/min離心5 min,吸取上清液至新的EP管中作為DNA模版。PCR擴增反應體系:DNA模板2 μl、正反向引物各1 μl(10 μmol/L)、2×HotStrat Taq PCR Master Mix 12.5 μl,去離子水補齊至25 μl。其中LoxP基因型鑒定正向引物:5’-GTGTGGACATGTGAGAGTGAGTCT-3’,反向引物:5’-TCTCTTATTATCCACTGCACCGTT-3’;Lyz2-Cre基因型鑒定正向引物:5’-CCCAGAAATGCCAGATTACG-3’,反向引物:5’-CTTGGGCTGCCAGAATTTCTC-3’。PCR擴增程序:94 ℃ 預變性3 min;94 ℃ 變性30 s,60 ℃退火35 s,72 ℃延伸35 s,35個循環;72 ℃ 5 min終止反應。瓊脂糖凝膠電泳:取1.2 g瓊脂糖溶于60 ml 1×TAE緩沖液中,微波沸騰3次,待稍冷卻后加入10 μl核酸染料,倒入模具凝固后得到瓊脂糖凝膠。取10 μl PCR擴增產物及5 μl DNA Marker進行電泳,120 V,30 min,用Tanon 1600系列全自動凝膠圖像分析系統分析成像并保存。

1.4.4小鼠免疫細胞分離 小鼠處死后用75 %酒精消毒,取出股骨和脛骨,用生理鹽水沖出骨髓細胞,細胞篩過濾除去殘存肉沫,1 500 r/min離心5 min,棄上清,加入含10 ng/ml M-CSF 的1640培養基,培養7 d獲得骨髓來源巨噬細胞(bone marrow-derived macrophages,BMDMs);剪開小鼠腹部皮膚,用注射器抽取磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution,PBS)約6～8 ml注入腹腔,5 min后用眼科鑷稍提起腹腔,用1 ml注射器吸出,1 500 r/min離心5 min棄上清獲得腹腔原位巨噬細胞(peritoneal macrophage,PM);取出胸腺剪碎研磨,細胞篩過濾,離心棄上清液獲得胸腺T細胞。

1.4.5Western blot檢測PU.1表達水平 將分離出的BMDMs、PM和胸腺T細胞制備成蛋白樣本進行聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉膜,封閉,置于封閉液稀釋的PU.1(1∶1 000)及內參β-Actin(1∶10 000)抗體中4 ℃孵育過夜,洗膜除去殘留的一抗,分別置于封閉液稀釋的辣根過氧化物酶偶聯親和山羊抗兔IgG(H+L)(1∶100 000)和辣根過氧化物酶偶聯親和山羊抗小鼠IgG(H+L)(1∶100 000),室溫孵育2 h,洗膜除去殘留的二抗,暗室顯影。

2 結果

2.1Spi1flox/flox小鼠獲得及鑒定結果采用CRISPR/Cas9基因編輯技術將Spi1flox/+小鼠LoxP位點放置于Spi1基因Exon2區域兩側,構建策略如圖1。Spi1flox/flox基因型小鼠由Spi1flox/+基因型小鼠雄雌自交獲得,采用flox引物鑒定時僅擴增出220 bp條帶的小鼠基因型為Spi1flox/flox純合子,僅擴增出159 bp條帶的小鼠基因型為Spi1+/+純合子,同時擴增出220 bp和159 bp條帶的小鼠基因型為Spi1flox/+雜合子(圖2)。結果表明Spi1flox/flox小鼠構建成功。

圖1 Spi1flox/flox小鼠構建策略

圖2 Spi1flox/flox小鼠和Spi1flox/flox/Lyz2-Cre+小鼠基因型鑒定

2.2KO小鼠獲得及鑒定結果為獲得KO基因型小鼠,首先將Spi1flox/flox與Lyz2-Cre+小鼠交配獲得Spi1flox/+/Lyz2-Cre+小鼠,再將其與Spi1flox/flox交配,最終獲得KO基因型小鼠。PCR鑒定結果顯示,采用flox引物鑒定時僅擴增出220 bp條帶的小鼠基因型為Spi1flox/flox純合子,采用Lyz2-Cre引物鑒定時可擴增出700 bp的小鼠基因型為Lyz2-Cre+,無條帶的小鼠基因型為Lyz2-Cre-(圖2)。

2.3 KO小鼠免疫細胞中PU.1的表達分離WT和KO小鼠的BMDMs、PM和胸腺T細胞,Western blot檢測PU.1表達,結果顯示,與WT組比較,KO組小鼠BMDMs中PU.1不表達(P<0.001);PM中PU.1也不表達(P<0.001);T細胞中PU.1表達水平與WT小鼠差異無統計學意義(圖3)。表明髓系特異性Spi1基因敲除小鼠構建成功。

圖3 小鼠PU.1表達的比較

3 討論

目前基因敲除技術在基礎實驗研究中廣泛應用,但全基因敲除過程中常導致小鼠胚胎致死[7]。條件性基因敲除技術與全基因敲除技術相比顯然有著明顯的優勢和更為廣泛的應用前景,其中基于Cre-loxP系統的條件性基因敲除小鼠在改善小鼠胚胎致死的同時也為在特定的細胞亞群中研究基因功能提供了可能。

LoxP序列是從大腸埃希菌P1噬菌體中發現的長度為34 bp的堿基序列,由兩個13 bp的反向重復序列和中間8 bp的間隔序列組成[8]。Cre重組酶可以特異性識別細胞內基因或DNA上的LoxP序列,并根據其位置和序列之間的關系介導不同的特異性重組反應。應用Cre-LoxP系統構建條件性基因敲除小鼠,主要是構建具有LoxP序列的目的基因突變小鼠和構建帶有Cre酶基因的轉基因Cre小鼠,將兩種小鼠雜交后經篩選可得到細胞內同時存在Cre重組酶基因和LoxP序列的小鼠,通過條件性表達Cre重組酶并與細胞內LoxP序列特異性識別,刪除相應的基因或基因片段,從而完成條件性基因敲除小鼠的構建[8]。

本實驗首先利用CRISPR Design工具,結合Spi1Gene ID(20375)小鼠基因組序列信息,設計針對Exon2的sgRNA,再根據sgRNA序列設計Donor載體。將Cas9蛋白和轉錄好的sgRNA以及純化后的Donor載體片段顯微注射到受精卵中,隨后將胚胎轉移到假孕動物中以產生F0代。最后將陽性F0代與C57BL/6J交配獲得穩定的F1代Spi1flox/+小鼠,F1代小鼠之間雜交得到Spi1flox/flox小鼠。將Spi1flox/flox小鼠與帶有骨髓細胞特異性表達Cre酶的Lyz2-Cre+小鼠雜交獲得Spi1flox/+/Lyz2-Cre+小鼠,再將其與Spi1flox/flox小鼠雜交即可獲得Spi1flox/flox/Lyz2-Cre+小鼠。

轉錄因子PU.1對多種骨髓細胞的分化和功能是必需的[9-10],并在病理情況下如血液系統相關疾病[11-12]和自身免疫性疾病[3-5]中發揮重要作用。巨噬細胞從髓系祖細胞分化伴隨著E26轉化特異性轉錄因子PU.1的表達增加;PU.1表達減少導致髓系祖細胞增殖增加和分化受損[9]。PU.1結合大多數受IL-1抑制的靶基因,在炎癥應激期間調節造血干細胞(hemopoietic stem cell,HSC)周期活動從而影響血液系統對炎癥信號的反應[11]。在自身免疫性疾病類風濕性關節炎中,PU.1可直接靶向巨噬細胞和成纖維樣滑膜細胞中的FMS樣酪氨酸激酶3從而促進關節炎的發生發展[6]。因此,構建Spi1基因敲除小鼠對充分闡明 PU.1的病理作用機制及藥物靶點的明確具有重要意義。

綜上所述,本研究成功構建了髓系特異性Spi1基因敲除小鼠,可為探討PU.1在自身免疫性疾病及腫瘤中的作用機制提供動物模型基礎。