蘿卜硫素通過調節ALOX5/NF-κB信號通路調控巨噬細胞糖酵解抑制糖尿病腎病進展

烏日娜,丁海東,常 宏,孫娜娜,張 磊

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是2型糖尿病最常見的微血管并發癥[1]。有文獻[2]報道,在DN中高糖能夠促進巨噬細胞糖酵解并且加速DN進展。蘿卜硫素(sulforaphane,SFN)是一種主要從西蘭花等十字花科蔬菜中提取的異硫氰酸鹽,Kong et al[3]研究表明,SFN可以減輕糖尿病腎纖維化?；ㄉ南┧?-脂氧合酶(arachidonic acid 5-lipoxygenase,ALOX5)基因在人體中起著重要作用,其編碼的蛋白質是一種催化花生四烯酸等多不飽和脂肪酸過氧化反應的雙加氧酶[4]。研究[5]表明,ALOX5在高糖誘導的體外DN細胞模型中表達上調,敲低ALOX5通過抑制核因子kappa B(nuclear factor kappa B,NF-κB)信號傳導進而促進高糖處理的腎系膜細胞增殖并抑制細胞凋亡。此外,也有研究[6]表明SFN能夠抑制NF-κB通路的激活。然而,關于SFN調控ALOX5/NF-κB信號通路在DN中的作用機制尚不明確。該研究旨在探討SFN通過調節ALOX5/NF-κB信號通路調控巨噬細胞糖酵解對DN進展影響的機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器雄性C57BL/6小鼠[許可證號:SCXK(蒙)2020-0001]購自內蒙古醫科大學實驗動物中心;人近端腎小管上皮細胞系(HK-2細胞)和人單核細胞白血病細胞系(THP-1細胞)(中國科學院上海細胞庫,貨號:GNHu47、TCHu57);SFN(上海詩丹德標準技術服務有限公司,貨號:4478-93-7);鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)(上海懋康生物科技有限公司,貨號:18883-66-4);Lipofectamin3000試劑盒、RPMI-1640培養基(美國ThermoFisher公司,貨號:L3000015、11875119);CCK-8溶液、佛波醇 12-肉豆蔻酸酯 13-乙酸酯(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)、Triton X-100(美國MedChemExpress公司,貨號:HY-K0301、16561-29-8、HY-Y1883A );Transwell細胞培養小室(美國康寧公司,貨號:3412);原位末端脫氧核苷酸轉移酶標記(TdT-mediated dUTP Nick End Labeling,TUNEL)試劑盒(瑞士Roche公司,貨號:11684817910);葡萄糖和乳酸試劑盒(武漢艾美捷科技有限公司,貨號:KA4088、K607-100);小鼠CD11b磁珠(北京諾為生物技術有限公司,貨號:AM0111210);RIPA裂解液、BCA試劑盒、10%SDS-PAGE、ECL(上海碧云天生物技術股份有限公司,貨號:P0013B、ST2222、P0690、P0018S);PVDF膜(美國Millipore公司,貨號:IPVH00010);一抗:抗己糖激酶-2(hexokinase-2,HK2)、丙酮酸激酶M2(pyruvate kinase M2,PKM2)、葡萄糖轉運蛋白1(glucose transporter 1,GLUT1)、ALOX5、NF-κB、p-NF-κB和β-actin,二抗:辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標記的羊抗兔IgG(美國Abcam公司,貨號:ab209847、ab85555、ab115730、ab169755、ab239882、ab264271、ab8227);Masson染色試劑盒(南京森貝伽生物科技有限公司,貨號:BP-DL022); ELISA試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司,貨號:ml037585);細胞培養箱(德國Eppendorf公司,型號:CellXpert? C170i);自動生化分析儀(日本東京日立公司,型號:7600);酶標儀(北京普朗新技術有限公司,型號:DNM-9602A);光學顯微鏡(日本OLUMPUS公司,型號:IX53);熒光顯微鏡(日本Nikon公司,型號:SMZ18)。

1.2 方法

1.2.1生物信息學分析 通過Swiss target prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)獲得SFN的靶基因,之后借助GEO數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)查找DN相關芯片GSE30122和GSE30529,以實驗組和對照組基因表達水平的對數倍數變化的絕對值大于1,校正后P<0.05為條件篩選DN相關基因,去除重復基因。借助Venn在線工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)取SFN靶基因和DN相關基因的交集。

1.2.2細胞培養和處理 將HK-2細胞分為如下組:正常糖(NG)組、HG組、HG+SFN組、HG+ALOX5組、HG+SFN+ALOX5組。巨噬細胞和HK-2細胞共培養組分為:NG處理的巨噬細胞+HK-2細胞組、HG處理的巨噬細胞+HK-2細胞組、HG+SFN處理的巨噬細胞+HK-2細胞組、HG+ALOX5轉染處理的巨噬細胞+HK-2細胞組、HG+SFN+ALOX5轉染處理的巨噬細胞+HK-2細胞組。

使用含有10% FBS和1%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養基培養HK-2細胞和THP-1細胞,并置于37 ℃、含5% CO2的培養箱中。為構建體外DN模型,使用30 mmol/L高葡萄糖(high glucose,HG)處理HK-2細胞24 h誘導DN損傷模型,使用5.5 mmol/L正常葡萄糖(normal glucose,NG)處理HK-2細胞24 h作為對照組,將SFN溶解于DMSO中并稀釋至所需濃度3 mmol/L后處理HG組細胞24 h[7]。使用100 ng/ml PMA處理48 h誘導THP-1細胞分化為巨噬細胞,并使用上述方法處理巨噬細胞,評估SFN對HG誘導的巨噬細胞糖酵解的影響。

使用Transwell共培養系統完成巨噬細胞和HK-2細胞的共培養,首先在Transwell小室上腔加入HK-2細胞,之后在Transwell小室下腔添加不同條件處理后的巨噬細胞,在37 ℃、含5%CO2的培養箱中連續培養24 h并進行后續實驗。

1.2.3細胞轉染 將巨噬細胞接種于6孔板中(密度為1×105個/孔),待細胞生長至60%～70%融合度時,使用Lipofectamin3000試劑將ALOX5過表達質粒轉染至巨噬細胞,轉染48 h后檢測轉染效率并用于后續研究。

1.2.4CCK-8實驗檢測細胞活力 將各組細胞以3×103個/孔接種于96孔板中,37 ℃孵育過夜直至細胞貼壁生長,之后將10 μl CCK-8溶液添加到96孔板中,繼續孵育1 h。使用酶標儀檢測450 nm處的吸光度值。

1.2.5TUNEL法檢測細胞凋亡 各組HK-2細胞處理完畢后制備成細胞爬片,室溫下用4%多聚甲醛固定30 min。PBS沖洗,用1%Triton X-100透化3 min。PBS洗滌3次,每次5 min,吸水紙吸干樣本周圍水分,每個樣本滴加50 μl TdT酶反應液,放入避光濕盒中,37 ℃反應1 h。PBS再次洗滌,加入DAPI染色液復染細胞核。熒光顯微鏡下觀察并計算陽性細胞百分比,TUNEL陽性細胞為凋亡細胞。

1.2.6檢測葡萄糖和乳酸水平 收集各組巨噬細胞培養基,以1 000 r/min的轉速離心15 min后取上清液,根據說明書使用葡萄糖和乳酸試劑盒檢測上清液中葡萄糖和乳酸的水平。

1.2.7動物實驗 18只雄性SPF級C57BL/6小鼠(8周齡)體質量18～22 g用于本研究。將所有小鼠飼養在無特殊病原體的環境中,溫度22 ℃,濕度50%～55%,光照/黑暗12 h循環。適應性喂養7 d后,將小鼠分為對照組(con組)、DN組、DN+SFN組。對照組給與正常飼料喂養,DN和DN+SFN組給與高脂飲食,連續喂養4周后構建DN小鼠模型,使用STZ(60 mg/kg,溶解在檸檬酸鈉中,pH 4.5)對DN和DN+SFN組小鼠行腹腔注射,每d 1次,注射連續5 d,對照組(con組)腹腔注射等量檸檬酸鈉溶液。最后一次注射5 d后,通過小鼠尾靜脈檢測小鼠空腹血糖,并留取24 h尿液,當連續3 d空腹血糖≥16.7 mmol/L且尿蛋白陽性被認為DN模型誘導成功。隨后DN+SFN組小鼠使用SFN(0.5 mg/kg)行皮下注射,每周5次,持續4個月[3]。

1.2.8生化分析 在治療結束前24 h,將動物關在單獨的代謝籠中收集24 h尿液,用ELISA試劑盒檢測24 h尿蛋白。實驗結束當天,小鼠通過尾靜脈收集小鼠血液標本,使用自動生化分析儀測量小鼠空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)、血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)和血清肌酐(serum creatinine,Scr)的水平。

1.2.9腎組織中巨噬細胞分離 血液采集結束后使用50 mg/kg的戊巴比妥鈉麻醉小鼠,之后以頸椎脫臼法安樂死小鼠,解剖后取腎組織。小鼠腎組織(100 mg)使用含膠原酶的培養基在37 ℃水浴中消化1 h,然后使用過濾網(40 μm)過濾。使用小鼠CD11b磁珠分離過濾液收獲巨噬細胞,用于后續Western blot分析。

1.2.10Western blot檢測蛋白表達 使用含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合物的RIPA裂解液提取各組HK-2細胞、巨噬細胞和小鼠腎組織巨噬細胞中的總蛋白,使用BCA試劑盒檢測蛋白的濃度。每組30 μg蛋白在10%SDS-PAGE上進行電泳分離并轉移至PVDF膜上,5%脫脂牛奶封閉1 h。然后與一抗:抗HK-2(1/1 000),PKM2(1/1 000),GLUT1(1/100 000),ALOX5(1/2 000),NF-κB(1/1 000),p-NF-κB(1/2 000)和β-actin(1/2 000)在4 ℃下孵育過夜,TBST洗滌后,加入HRP標記的羊抗兔 IgG二抗(1/1 000)在室溫下避光孵育2 h。ECL對蛋白條帶進行顯影、成像,以β-actin作為內參計算目的蛋白的相對灰度值。

1.2.11小鼠腎組織HE染色 小鼠腎組織脫水,10%福爾馬林固定,石蠟包埋,切成5 μm厚的切片,脫蠟,水化,常規HE染色后在顯微鏡下觀察腎組織的病理改變。

2 結果

2.1 SFN抑制ALOX5/NF-κB信號通路如圖1A,生物信息學分析顯示SFN的靶基因與DN相關基因的交集共8個,結合相關文獻[5]選擇ALOX5進行進一步研究。Western blot 檢測HK-2細胞和巨噬細胞中ALOX5和NF-κB的蛋白表達。結果顯示,與NG組相比,HG組巨噬細胞及HK-2細胞中ALOX5和p-NF-κB的表達均上調(q=20.05、22.54、19.79、21.06,均P<0.001)。與HG組相比,SFN處理后抑制了高糖處理HK-2細胞和巨噬細胞的ALOX5和p-NF-κB的表達(q=13.51、14.72、14.01、14.67,均P<0.001)。見圖1B、C。提示SFN處理能夠抑制HG誘導的巨噬細胞和HK-2細胞中ALOX5和NF-κB通路相關因子的表達。

2.2 SFN抑制高糖誘導的HK-2細胞損傷CCK-8檢測和TUNEL檢測結果顯示,與NG組相比,HG組HK-2細胞活力百分數下降,TUNEL陽性細胞占比增多(q=13.44、16.96,均P<0.001)。與HG組相比,SFN處理后HK-2細胞活力增強,細胞凋亡被抑制(q=7.523、9.435,均P<0.01)。見圖2。提示SFN能夠抑制高糖誘導的HK-2細胞損傷。

圖2 SFN抑制高糖誘導的腎小管細胞損傷

2.3 SFN抑制高糖誘導的巨噬細胞糖酵解與NG組相比,HG處理上調巨噬細胞上清液中葡萄糖水平和乳酸的水平(q=35.24、14.37,均P<0.001),而SFN處理后HG誘導的葡萄糖水平和乳酸的水平(q=10.31、8.974,P<0.001、P=0.002)被抑制。見圖3A、B。Western blot檢測結果顯示,HG處理后HK2、PKM2和GLUT1的表達均高于NG組(q=14.10、11.59、14.39,均P<0.001),而SFN處理明顯降低HG誘導的HK2、PKM2和GLUT1的水平(q=9.574、7.472、9.595,均P<0.01)。見圖3C。

圖3 SFN抑制高糖誘導的巨噬細胞糖酵解

2.4 SFN抑制高糖處理的巨噬細胞介導的腎小管上皮細胞損傷將CCK-8和TUNEL檢測結果顯示,與NG處理的巨噬細胞+HK-2細胞組相比,HG處理的巨噬細胞+HK-2細胞組細胞活力降低,細胞凋亡增加(q=17.11、17.32,均P<0.001);SFN處理后,HG處理的巨噬細胞+HK-2細胞活力增強,且細胞凋亡減少(q=13.64、10.40,均P<0.001)。見圖4。提示SFN能夠抑制高糖處理的巨噬細胞介導的腎小管上皮細胞損傷。

圖4 SFN抑制巨噬細胞介導的腎小管上皮細胞損傷

2.5 過表達ALOX5減弱SFN對巨噬細胞糖酵解引起的腎小管上皮細胞損傷的保護作用檢測結果顯示,與HG+SFN組相比,HG+SFN+ALOX5組巨噬細胞培養基上清液中葡萄糖水平和乳酸水平升高(q=4.950、5.739,P=0.033、0.0154),且細胞中糖酵解相關蛋白HK2、PKM2和GLUT1表達均上調(q=3.888、6.760、6.327,P=0.048、0.005、0.007)。提示ALOX5可能促進巨噬細胞的糖酵解過程。此外,相比于HG+ALOX5組,SFN處理后,HG+SFN+ALOX5組巨噬細胞中的葡萄糖水平和乳酸水平降低(q=10.97、10.66,均P<0.001),糖酵解相關蛋白HK2、PKM2和GLUT1表達降低(q=20.91、16.69、27.13,均P<0.001)。見圖5A-C。提示SFN可能抑制ALOX5促進巨噬細胞的糖酵解這一過程。與HG+SFN處理的巨噬細胞+HK-2細胞組相比,

圖5 過表達ALOX5減弱SFN對巨噬細胞糖酵解引起的腎小管上皮細胞損傷的保護作用

轉染ALOX5并且以HG+SFN處理的巨噬細胞+HK-2細胞組中的細胞活力降低,細胞凋亡增加(q=16.34、5.92,P<0.001、P=0.013)。與HG+ALOX5轉染處理的巨噬細胞+HK-2細胞組比較,HG+SFN+ALOX5轉染處理的巨噬細胞+HK-2細胞組中細胞活力增加、凋亡降低(q=10.08、8.68,均P<0.001)。見圖5D、E。說明通過促進ALOX5表達可能影響腎臟細胞的活力和凋亡水平,并且會影響SFN對腎臟細胞的保護作用。

2.6 SFN減輕DN模型小鼠腎損傷并抑制腎臟巨噬細胞糖酵解本研究動物實驗示意圖見圖6A。與con組比較,DN組小鼠FBG、24小時尿蛋白、BUN和Scr均上調(q=18.17、21.61、20.45、10.88,均P<0.001),糖酵解相關蛋白HK2、PKM2和GLUT1表達均升高(q=17.92、15.50、15.09,均P<0.001)。使用SFN治療后,FBG、24小時尿蛋白、BUN和Scr水平均降低(q=9.265、8.538、9.830、7.183,均P<0.01),糖酵解相關蛋白HK2、PKM2和GLUT1表達均降低(q=11.88、10.44、10.06,均P<0.01)。見圖6B-E、G。HE染色結果顯示,con組腎小球體積和結構無明顯改變,DN組腎小球基底膜增厚、系膜增生,細胞空泡變性增多,腎小球體積增大,而SFN治療后,這些病理改變和纖維化得到改善。見圖6E。提示SFN可能對DN具有治療作用。

圖6 SFN對DN模型小鼠腎損傷和腎臟巨噬細胞糖酵解影響

3 討論

DN的發病機制復雜,且多種因素,如血流動力學異常、代謝紊亂和晚期糖基化終產物的形成均被認為與DN的發病有關[8]。巨噬細胞是DN患者和動物模型腎組織中浸潤最豐富的免疫細胞類型之一。高血糖、腎小球免疫復合物沉積和趨化因子的產生能夠促進巨噬細胞在腎臟中的積累和活化,進而導致腎損傷和纖維化[9]。有文獻[10]報道,DN小鼠腎臟巨噬細胞糖酵解增強,通過抑制巨噬細胞糖酵解可以減輕腎臟炎癥和纖維化。本研究表明SFN能夠抑制ALOX5和NF-κB的表達及巨噬細胞糖酵解介導的腎小管上皮細胞損傷,且SFN有利于改善DN小鼠腎功能和組織損傷。

糖酵解是一種細胞代謝途徑,最近的研究[11]表明,M1巨噬細胞被促炎因子激活時會快速通過糖酵解獲取能量并促進炎癥反應。Zeng et al[12]表明,HG可以誘導骨髓源性巨噬細胞分化為M1促炎表型,且在HG條件下M1巨噬細胞糖酵解增加。此外,糖酵解激活會進一步上調巨噬細胞中促炎和纖維化基因的表達[13]。本研究結果表明,HG處理后巨噬細胞培養基上清液中葡萄糖和乳酸的水平升高,糖酵解相關蛋白(HK2、PKM2、GLUT1)的表達上調。同時,從DN小鼠腎臟分離的巨噬細胞中糖酵解相關蛋白的表達高于正常對照組小鼠。這些結果表明,在高葡萄糖環境下或DN發展過程中,巨噬細胞的糖酵解途徑增加。這可能是由于糖酵解相關蛋白表達的上調導致了葡萄糖的優先代謝及乳酸的累積。而使用SFN處理巨噬細胞后,糖酵解途徑被抑制,可能是通過調控糖酵解相關蛋白的表達來實現。

關于DN的研究[14]顯示ALOX5在高葡萄糖處理的HK-2細胞中表達上調,且ALOX5可能參與了DN患者中的鐵死亡分子機制,可能通過特定的代謝途徑和免疫/炎癥機制發揮作用。NF-κB是一種核轉錄因子,有研究[15]報道NF-κB在DN中表達上調,抑制其活化能夠減輕高糖處理對足細胞的促炎反應和促凋亡作用。本研究證明了ALOX5是SFN治療DN的核心靶點。HG處理后的巨噬細胞和HK-2中ALOX5和p-NF-κB的蛋白表達上調,而SFN處理則能夠抑制ALOX5和p-NF-κB的表達。本研究顯示過表達ALOX5能夠增強HG條件下巨噬細胞糖酵解以及巨噬細胞介導的HK-2細胞損傷,減弱SFN對HK-2細胞的保護作用。這些發現強調了ALOX5在糖尿病性腎病中的重要作用,并且提示SFN可能通過抑制ALOX5和p-NF-κB表達,調節糖酵解和巨噬細胞介導的損傷來發揮其治療DN的作用。

綜上所述,SFN通過抑制ALOX5/NF-κB通路激活來抑制巨噬細胞糖酵解從而改善DN的進展。ALOX5可以作為治療DN的潛力靶點。本研究為DN的治療提供了新的方向和思路。然而本研究也存在一定局限性,如本研究只關注了ALOX5和NF-κB通路,未完全探究其他可能的機制和靶點,可能有其他未知的關鍵因素在DN的發展中起到了重要作用。此外,本研究并未對SFN的藥理學或毒理學進行深入研究。未來有待進一步研究ALOX5和NF-κB通路參與DN進展的機制以及SFN的藥理作用。