大麻二酚對創傷性腦損傷大鼠腦皮質Occludin、ZO-1表達水平及血腦屏障通透性的影響

李佳麗,曹 艷,凌騰晗,尹愛平,李恒希,李經輝,張瑞林,吳海鷹,李 坪

創傷性腦損傷(traumatic brain injury,TBI)是一種由于外力作用于大腦而導致的中樞神經系統疾病[1-2]。TBI的繼發性損傷涉及血腦屏障(blood brain barrier,BBB)受損、水腫、炎癥等復雜的級聯反應,BBB主要由緊密連接的腦微血管內皮細胞、周細胞、星形膠質細胞足板和基底膜組成,在維持大腦穩態中至關重要。其完整性與緊密連接蛋白密切相關,主要包括閉合蛋白(Occludin)、密封蛋白和閉鎖小帶蛋白-1(zonula occluden-1,ZO-1),緊密連接蛋白Occludin和ZO-1被認為是判斷BBB完整性的標志物[3]。BBB受損被認為是TBI高發病率和高病死率的主要危險因素之一[4-5],因此尋找藥物干預TBI后BBB損傷具有重要意義。大麻二酚(cannabidiol,CBD)是天然植物大麻的主要提取物之一,具有抗氧化應激、抗炎、促進神經細胞增殖以及抑制凋亡等神經保護作用,能夠改善腦損傷[6-7]。但其是否對緊密連接蛋白Occludin和ZO-1表達水平產生干預作用以及干預作用是否隨著干預時間變化而產生變化尚不明確。因此,該研究旨在探討CBD對TBI后緊密連接蛋白Occludin和ZO-1的表達水平和對BBB滲透性的干預作用,從而探索TBI潛在治療藥物,以及為CBD用藥提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 SPF級SD雄性大鼠,體質量260～280 g,共72只,由實驗動物中心提供。提前1周運至實驗室,常規飼養(溫度20～25 ℃、濕度55%～65%,給予自由飲食、飲水)。

1.1.2主要試劑和儀器 CBD粉末(云南漢素公司,貨號:20200601,純度≥99.5%)兔抗大鼠ZO-1多克隆抗體(江蘇親科生物研究中心有限公司,貨號:AF5145),兔抗大鼠Occludin多克隆抗體(貨號:27260-1-AP),兔抗大鼠β-actin多克隆抗體(貨號:20536-1-AP),HRP標記的山羊抗兔IgG二抗(貨號:SA00001-2)均購自武漢三鷹生物技術有限公司,Cy3標記的山羊抗兔IgG抗體(貨號:C2306),含DAPI的抗熒光衰減封片劑(貨號:F6057)均購自美國sigma公司,BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司,貨號:P00010),即用型免疫組化超敏UltraSensitiveTMSP試劑盒(福州邁新生物技術開發有限公司,貨號:KIT-9720),高靈敏化學發光檢測試劑盒(北京蘭杰柯科技有限公司,貨號:BL520A),三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA,上海易恩化學技術有限公司,貨號:R050965),氫氧化鈉(sodium hydroxide,NaOH,云南景銳科技有限公司,貨號:K7-1),多功能酶標儀(美國Thermo Fisher公司,型號:Multiskan FC),大鼠腦立體定位儀(深圳瑞沃德生命科技有限公司,型號:68802),VICTOR NivoTM多模式微孔板檢測儀(美國Perkin Elmer公司,型號:VICTOR NivoTM),光學顯微鏡(德國Leica公司,型號:DM4000B),凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司,型號:Chemi DocTMXRS+),熒光倒置顯微鏡(德國Zeiss公司,型號:Axio Observer)。

1.2 方法

1.2.1動物分組及模型制備 SD大鼠隨機分為3組:假手術組(Sham組)、模型組(TBI+vehicle組)和CBD干預組(TBI+CBD組),每組24只大鼠。每個組又分為損傷后8 h、1、2、3、5和7 d共 6個時間點,觀察TBI急性期損傷情況。模型組和CBD干預組大鼠的TBI模型采用改良“Feeney自由落體撞擊法”制備。大鼠采用2%戊巴比妥鈉(2 ml/kg)進行腹腔注射麻醉,后固定于腦立體定位儀上,頭頂部消毒后,以矢狀縫右側2.5 mm和冠狀縫下側2 mm為中心,開一個直徑約6 mm的骨窗。將40 g砝碼通過銅管從15 cm高度落下,打擊撞擊子至腦組織從而造成TBI。止血后用骨蠟封閉骨窗并縫合皮膚。假手術組不進行打擊,其余步驟相同。CBD粉末先溶于DMSO,再使用2% Tween-80生理鹽水稀釋至終濃度為1%。在TBI大鼠造模前30 min、TBI造模后6 h以及之后每 d直至取材前1 d對CBD干預組大鼠進行CBD(10 mg/kg)[8]腹腔注射。模型組注射等體積溶劑(2% Tween-80生理鹽水)。根據免疫組化檢測Occludin和ZO-1蛋白陽性表達的實驗結果,以及課題組前期探索出腦損傷高峰期為2 d,后續模型組使用造模后2 d(TBI 2d+vehicle組)大鼠進行后續實驗。

1.2.2免疫組織化學染色檢測腦組織Occludin、ZO-1蛋白陽性表達 3組大鼠,在6個不同時間點處死,提取腦組織經4%多聚甲醛固定后進行石蠟包埋,制備厚度為5 μm的冠狀石蠟切片。利用即用型免疫組化超敏UltraSensitiveTMSP試劑盒進行免疫組織化學染色。切片常規脫蠟至水后,進行高溫高壓抗原修復,冷卻至室溫,滴加試劑1(內源性過氧化物酶阻斷劑)室溫孵育10 min,試劑2(非特異性染色阻斷劑)室溫孵育20 min,滴加兔抗大鼠ZO-1多克隆抗體或兔抗大鼠Occludin多克隆抗體(1∶500)于4 ℃冰箱過夜,次日室溫接著孵育30 min至室溫,滴加試劑3(生物素標記的羊抗兔IgG聚合物)室溫孵育1 h,滴加試劑4(鏈霉菌抗生素蛋白-過氧化物酶)室溫孵育15 min,DAB顯色,梯度乙醇脫水、二甲苯透明后使用中性樹膠封固切片。采圖部位位于打擊損傷處靠近中縫的位置,采集大腦損傷側皮質區染色結果圖,每張切片隨機選取5個視野,使用ImageJ軟件分析免疫陽性細胞的平均光密度值。

1.2.3免疫熒光染色檢測腦組織Occludin、ZO-1蛋白陽性表達情況 石蠟切片抗原修復后,使用10%山羊血清室溫封閉1 h,滴加兔抗大鼠ZO-1多克隆抗體或兔抗大鼠Occludin多克隆抗體(1∶200)于4 ℃冰箱過夜,次日室溫復溫30 min后,滴加Cy3標記的山羊抗兔IgG抗體(1∶200)室溫孵育1 h,使用含有DAPI的抗熒光衰減封片劑封片。采圖部位位于打擊損傷處靠近中縫的位置,采集大腦損傷側皮質區染色結果圖,每張切片隨機選取5個視野,使用ImageJ軟件分析陽性細胞的平均熒光強度。

1.2.4Western blot實驗檢測腦組織Occludin、ZO-1蛋白表達量 提取各組大鼠損傷側皮質區腦組織蛋白,通過BCA法測定蛋白濃度。每孔取20 μg樣品蛋白,通過SDS-PAGE凝膠電泳將蛋白分離,電轉移至PVDF膜,室溫下用5%脫脂牛奶封閉2 h后,用1∶1 000的兔抗大鼠Occludin或ZO-1多克隆抗體和1∶5 000的兔抗大鼠β-actin多克隆抗體4 ℃搖床孵育過夜,次日用1∶10 000的HRP標記的山羊抗兔IgG二抗室溫孵育1 h。采用高靈敏化學發光檢測試劑盒和ChemiDocTMXRS+凝膠成像系統顯色并進行采圖,使用ImageJ軟件分析灰度值。

1.2.5熒光素鈉法檢測大鼠BBB通透性 建立熒光素鈉溶液濃度為0～0.05 μg/ml的熒光強度值標準曲線,R2=0.997。3組大鼠2 d后以2 ml/kg的劑量腹腔注射熒光素鈉溶液(100 mg/ml,溶解于PBS中),循環30 min后麻醉大鼠進行造模,心臟灌注取損傷側腦皮質組織100 mg,加入500 μl的7.5%TCA研磨成勻漿,再加入500 μl的PBS沖洗混勻,4 ℃、10 000 r/min離心10 min,收集上清液。黑色96孔板中每孔加入120 μl上清液和30 μl的5 mol/L NaOH,用多功能酶標儀在excitation 波長485 nm和emission 波長530 nm處測定樣本熒光強度值,帶入標準曲線算出熒光素鈉濃度。

2 結果

2.1 CBD干預后上調TBI大腦損傷側皮質區Occludin、ZO-1蛋白陽性表達3組大鼠免疫組化結果顯示,Occludin、ZO-1蛋白陽性表達呈點狀及不規則形狀(圖1A、B)。對Occludin、ZO-1蛋白陽性表達進行統計發現,與Sham組相比,隨著時間推移,不同時間點的TBI+vehicle組Occludin、ZO-1蛋白陽性表達均下降,其中2 d下降最明顯(tOccludin=3.570、4.053、7.479、5.290、4.590、3.622,均P<0.05;tZO-1=2.823、4.112、4.681、3.925、4.924、3.667,均P<0.05);與TBI+vehicle組相比,TBI+CBD組Occludin、ZO-1平均光密度值在1 d后均升高(tOccludin=4.444、7.699、3.432、4.916、4.194,均P<0.05;tZO-1=0.142、2.858、3.251、3.697、2.970、3.406,均P<0.05)。見圖1C、D。

圖1 免疫組織化學染色檢測各組大鼠緊密連接蛋白Occludin、ZO-1陽性表達

2.2 CBD干預TBI大腦損傷側皮質區Occludin、ZO-1平均熒光強度值升高3組大鼠免疫熒光實驗結果顯示,Occludin、ZO-1陽性表達成點狀、條索狀或不規則狀(圖2A、B)。對二者陽性表達的平均熒光強度值進行統計發現,與Sham組相比,TBI 2 d+vehicle組Occludin、ZO-1平均熒光強度值下降(t=2.593、3.735,均P<0.05);與TBI 2 d+vehicle組相比,CBD干預后平均熒光強度值均升高(t=3.227、3.523,均P<0.05)。見圖2C、D。

圖2 免疫熒光染色檢測各組大鼠損傷側皮質區Occludin、ZO-1平均熒光強度表達情況

2.3 CBD干預TBI大腦損傷側皮質區Occludin、ZO-1蛋白表達量升高Western blot實驗結果顯示,與Sham組相比,TBI 2 d+vehicle組Occludin、ZO-1蛋白表達量下降(t=4.861、6.048,均P<0.01);與TBI 2 d+vehicle組相比,CBD干預后Occludin、ZO-1蛋白表達量均升高(t=6.067、4.320,均P<0.05),見圖3。

圖3 Western blot檢測各組大鼠損傷側皮質區Occludin、ZO-1蛋白表達量

2.4 CBD干預TBI大鼠BBB滲透性降低熒光素鈉實驗結果顯示,與Sham組相比,TBI 2 d后,大鼠腦皮質組織的熒光素鈉含量上升(t=5.156,P<0.01),提示BBB滲透性升高;與TBI 2 d+vehicle組相比,CBD干預后大鼠腦皮質組織的熒光素鈉含量明顯下降(t=2.785,P<0.05),提示BBB滲透性下降。見圖4。

圖4 大鼠腦皮質組織熒光素鈉熒光強度的比較

3 討論

TBI在全國乃至全球的致殘率、致死率仍居高不下,TBI后BBB的破壞是繼發性腦損傷的風險之一。BBB作為維持大腦穩態的關鍵結構,其完整性具有重要意義。當BBB結構遭到破壞,其滲透性發生變化,從而導致大腦內環境遭到破壞。本研究結果顯示,TBI后大鼠Occludin和ZO-1均下降,這與Yan et al[9]人研究結果一致。同時本研究顯示Occludin和ZO-1在TBI后2 d表達量最低,證明了緊密連接蛋白Occludin和ZO-1參與了TBI后病理改變,TBI后大鼠BBB遭到破壞。這與Fu et al[10]人研究結果近似。另外有研究[11]顯示,大鼠低壓缺氧后7 d腦組織熒光素鈉含量明顯升高,說明BBB完整性受損,通透性升高,這與本研究結果近似。本研究結果顯示TBI后2 d腦組織熒光素鈉含量升高,BBB滲透性升高,CBD干預后腦組織熒光素鈉含量下降,BBB滲透性下降。

CBD是天然植物大麻的主要提取物之一,因其不具有精神活性且易穿過BBB,在多種中樞系統神經疾病中均發揮神經保護作用,具有潛在的應用價值[6-7]。Belardo et al[12]研究結果發現,口服CBD可減輕TBI小鼠的神經功能障礙。本實驗結果顯示,CBD干預后1、2、3、5和7 d,緊密連接蛋白Occludin和ZO-1陽性表達升高。CBD干預2 d后Occludin和ZO-1的平均熒光強度以及蛋白表達量都出現升高,同時BBB滲透性下降,以上均提示CBD對TBI后BBB的破壞具有一定的保護作用,降低了BBB滲透性,保護了BBB完整性。

綜上所述,本研究顯示TBI后緊密連接蛋白Occludin和ZO-1表達下降,BBB滲透性升高,CBD干預可逆轉TBI對BBB的破壞。本研究為治療TBI提供潛在有效藥物,然而關于CBD干預BBB滲透性的機制還需進一步研究。