p62基因過表達慢病毒載體的構建及表達

張 春,蘇 叢,伍 婷,朱立雨

P62/SQSTM1(sequestosome-1,SQSTM1)蛋白是一種重要的自噬銜接蛋白,是最早發現的哺乳動物泛素化底物的自噬受體之一。P62蛋白含有多個功能性結構域,包括泛素相關結構域(ubiquitin-associated domain,UBA)、微管相關蛋白1輕鏈3作用域(LC3 interacting region,LIR)、Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白受體(Kelch-like epichlorohydrin-associated protein receptor,KIR)、腫瘤壞死因子受體相關因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6,TRAF6)結合結構域、ZZ型鋅指區和Phox-Bem1p(PB1)結構域等6個功能區域[1-3]。其中PB1、LIR和UBA結構域在選擇性自噬降解過程中發揮重要作用。P62蛋白異常表達與多種疾病如神經退行性病變、腫瘤、遺傳性疾病及感染性疾病的發生發展密切相關[4-7]。因此,該研究旨在通過構建p62基因過表達慢病毒,篩選出P62高表達的人單核細胞白血病細胞(human myeloid leukemia mononuclear cells,THP-1)細胞株,為進一步在體外深入探索p62基因的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要材料 人胚腎細胞 293T (human embryonic kidney 293T,HEK 293T)(目錄編號:GNHu44)及人單核細胞白血病細胞(THP-1)(目錄編號:SCSP-567)均購自中科院上海細胞所。包裝質粒pcDNA3.1-Flag-PCDH10(貨號:VT8014)及輔助包裝質粒pSPAX2(貨號:VT1444)和pMD2G(貨號:VT1443)購自湖南優寶生物;EcoR Ⅰ(貨號:ER0271)和BamH Ⅰ(貨號:ER0051)、限制性內切酶、轉染試劑Lipofectamine 2000(貨號:11668500)、T4連接酶(貨號:15224041)、DMSO(貨號:D12345)、質粒提取與純化試劑盒(貨號:K0502)、DNA Polymerease(貨號:EP0702)、DNA ladder(貨號:SM1553)、TRIzol RNA提取試劑(貨號:15596026)等均購自美國賽默飛世爾科技公司;Taq酶(貨號:R300S)、PrimeScriptTMRT Master Mix(貨號:RR036A)和TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ (貨號:RR420A)購自日本Takara公司;蛋白Marker(貨號:MBP0277-25 μl)、ECL發光液(貨號:MBP0297)購自上海畢合生物化學技術有限公司;抗GAPDH抗體(貨號:2118L)及抗P62多克隆抗體(貨號:5114S)均購自美國Cell Signaling Technology公司,山羊抗兔二抗(貨號:ab6721)購自美國Abcam公司;BCA蛋白定量試劑盒(貨號:C503021-0500)、大腸埃希菌感受態細胞(DH5α)、PCR引物、瓊脂粉(貨號:A505255-0250)購于上海生工生物工程股份有限公司。氨芐霉素(貨號:A8180)購自北京索萊寶科技有限公司。高糖培養基(Dulbecco's modified eagle medium,DMEM)(貨號:C11995500BT)、胎牛血清(fatal bovine serun,FBS)(貨號:10270-106)購自美國Invitrogen公司。

1.1.2主要儀器 冷凍超速離心機(型號:Beckman Coulter OPTIMA I-100XP,美國貝克曼庫爾特有限公司)、熒光定量PCR儀、超微量核酸蛋白測定儀(型號:ABI 7500、Thermo Nanodrop 2000,美國賽默飛世爾科技公司)、電泳槽和轉印芯及核酸蛋白電泳系統(型號:Bio-Rad,美國Bio-Rad公司)、凝膠成像分析系統(型號:Tanon 5200,上海天能生命科學有限公司)、電熱恒溫培養箱(型號:DNP-9162,常州恒隆儀器有限公司)、生物安全柜(型號:AB2-4A1,新加坡ESCO公司)、細胞培養箱(型號:HERACELL 150L,美國賽默飛世爾科技公司)。

1.2 方法

1.2.1p62基因合成及其慢病毒表達載體的構建 通過GenBank 網站查詢小鼠p62基因序列,設計基因引物:P1(5′-CGGAATTCATGGCGTCGTTCACGGTGAAGGCC-3′);P2(5′-AAGGATCCCAATGGTGGAGGGTGCTTCGAATACTGGA-3′);擴增長度:1 342 bp,引物由上海生工生物科技有限公司合成。擴增反應體系:P1和P2引物各1 μl 5×Buffer 10 μl,dNTP Mix 4 μl,模板1 μl,Prime STAR HS DNA polymerase 0.5 μl,雙蒸水 32.5 μl,充分混勻,條件如下:98 ℃、5 min,98 ℃、10 s,55 ℃、10 s,72 ℃、90 s,共循環30次,72 ℃、8 min。退火處理后得到帶黏性末端的雙鏈片段4 ℃冰箱保存,用于后續連接反應。限制性內切酶在EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ位點對載體進行雙酶切,反應體系及條件如下:10×Cut Smart Buffer 5 μl,pcDNA3.1-Flag-PCDH10質粒(1 μg/μl) 2 μl,EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ (10 U/μl)各1 μl,ddH2O 補足至50 μl,充分混勻,37 ℃水浴反應3 h,得到線性化的載體。凝膠電泳后切膠,用DNA凝膠回收試劑盒回收載體pcDNA3.1-Flag-PCDH10。將目的片段與線性載體連接,于冰水浴中配制如下反應體系:線性化pcDNA3.1-Flag-PCDH10載體DNA 4 μl,p62DNA 4 μl,T4連接酶1 μl,T4 Buffer 1 μl,共10 μl?；靹蚝箅x心,室溫過夜連接。將上述產物轉化大腸埃希菌DH5α,經含有氨芐霉素抗性的LB瓊脂培養基過夜篩選后,挑取單克隆細胞株送DNA測序鑒定,獲取重組p62-pcDNA3.1-Flag-PCDH10質粒,PCR擴增后雙酶切凝膠電泳驗證。擴大培養陽性DH5α,質粒提取試劑盒提取重組質粒,-20 ℃保存。

1.2.2重組表達p62慢病毒在HEK 293T細胞的包裝和轉染 轉染前1 d,將生長狀態良好的HEK 293T細胞接種于6孔板中,待細胞匯合度達70%左右時,將p62-pcDNA3.1-Flag-PCDH10 5 μg、包裝質粒pSPAX2 3.75 μg和 pMD2G 1.5 μg加入500 μl Optimum,混勻配制成DNA mixture,室溫靜置5 min,同時將500 μl Optimum和20 μl Lipofactamine2000混勻,于室溫靜置20 min,再將DNA mixture與之混勻,均勻滴至HEK 293T細胞中;將細胞置于37 ℃、5% CO2環境中轉染 6 h 后 更換為含 10% FBS的新鮮完全培養基,繼續培養48 h后收集細胞上清液,使用0.45 μm濾器過濾,4 ℃ 12 000 r/min 離心5 min,繼而獲得P62過表達慢病毒,-80 ℃冰箱冷凍保存,以備后續實驗使用。

1.2.3慢病毒感染THP-1及篩選P62穩定表達株 將2×106個THP-1細胞接種至6孔板,待細胞長至匯合度達50%～60%時,根據病毒感染復數及細胞數量加入相應體積的病毒原液;感染24 h后,更換無病毒的適應性培養基,細胞培養箱中繼續培養24 h,利用含氨芐霉素(2 μg/ml)的適應性培養基繼續篩選感染病毒的細胞,繼續培養3～4 d,直至剩余極少部分THP-1細胞存活,使含p62-pcDNA3.1-Flag-PCDH10慢病毒的THP-1穩定傳代,從而得到p62基因高表達THP-1細胞株,即過表達組(over expression,OE),轉染不含p62基因空質粒的THP-1細胞株為對照(control,Con)組。

1.2.4RT-qPCR檢測p62mRNA 相對表達量 提取氨芐霉素篩選陽性細胞總RNA,根據說明書對PrimeScriptTMRT Master Mix 進行逆轉錄,逆轉錄體系及條件為:Dntp Mixture(10 mmol/L) 1 μl、Oligo Dt Primer (2.5 μmol/L) 1 μl、Total RNA 5 μl、無酶去離子水補足至10 μl;37 ℃預反應15 min ;85 ℃擴增5 s。p62mRNA引物序列如下:Forward primer:5′-TTCAGCTTCTGCTTCAGCCC-3′;Reverse primer:5′-CTCCTGAGCACATGGTGGG-3′;GAPDH mRNA引物序列如下:Forward primer:5′-GTCAAGGCCGAGAATGGGAA-3′;Reverse primer:5′-CTCGTGGTTCACACCCATCA-3′;進行 RT-qPCR反應,反應體系及條件為:上述變性、退火后的反應液 10 μl、5×PrimeScriptTMBuffer 4 μl、Rnase Inhibitor (40 U/μl) 0.5 μl、PrimeScriptTMRtase (for 2 Step) 0.5 μl、Rnase Free H2O 5 μl,總體系20 μl;95 ℃預變性 30 s;95 ℃變性5 s,60 ℃退火30 s,共40個循環。采用2-ΔΔCT法計算相對表達量。

1.2.5Western blot 檢測THP-1細胞中P62蛋白的相對表達量 經氨芐青霉素篩選陽性THP-1克隆株,培養細胞至對數生長期,加入適量的細胞裂解液RAPI,冰上裂解30 min,12 000 r/min 離心10 min,蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。20 μg樣品中加入4×蛋白 Loading buffe,煮沸,冰上冷卻,蛋白上樣、80 V恒壓電泳、轉PVDF膜、5%脫脂奶粉室溫封閉1 h、分別以抗p62(1∶1 000)和抗GAPDH(1∶5 000) 抗體4 ℃孵育過夜,1×TBST清洗3次,每次8 min,再分別以山羊抗兔二抗 (1∶5 000)室溫孵育1 h,1×TBST清洗3次,每次8 min,ECL化學發光法顯示蛋白條帶。

1.2.6RT-qPCR檢測炎癥因子mRNA的表達量 肺炎克雷伯(KlebsiellaPneumoniae,K.p.)標椎菌株(ATCC 43816) 感染兩組THP-1細胞(細菌∶細胞=10∶1),刺激 6 h 后收集細胞,采用RT-qPCR方法檢測兩組細胞分泌的腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、白細胞介素(interleu kin,IL)-1β 和 Cxcl1 的 mRNA相對表達量。

2 結果

2.1 PCR擴增p62基因片段及含目的基因重組質粒p62-pcDNA3.1-Flag-PCDH10的鑒定目的基因p62PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳后顯示,在1 342 bp處顯示有一明亮特異性擴增條帶,片段大小與目的條帶一致,表明目的基因擴增成功。將擴增成功的p62目的基因與線性化載體連接,重組質粒圖譜如圖1所示,后轉染DH5α,篩選陽性克隆株,提取質粒,將重組質粒p62-pcDNA3.1-Flag-PCDH10進行擴增后再雙酶切進行PCR鑒定,可見被切開如圖2所示兩條條帶,同時經基因測序驗證,表明p62目的基因成功插入慢病毒質粒中。

圖1 重組質粒圖譜

圖2 EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ 雙酶切重組質粒瓊脂糖凝膠電泳鑒定圖

2.2 穩轉THP-1細胞株p62mRNA的相對表達量RT-qPCR檢測結果顯示,與Con組相比,OE組p62相對表達量升高(t=8.639,P<0.001)。見圖3。

圖3 兩組細胞p62 mRNA相對表達量的比較

2.3 穩轉THP-1細胞株P62蛋白的相對表達量Western blot檢測結果如圖4所示,OE組P62蛋白表達高于Con組,表明P62穩轉THP-1細胞株構建成功。

圖4 THP-1細胞株P62蛋白表達圖

2.4K.p.感染THP-1細胞炎癥因子的mRNA表達量實驗組細胞內的炎性因子TNF-α、IL-1β和Cxcl1的相對表達量均高于對照組(t=8.620、4.278、7.551,均P<0.01)。見圖5。

圖5 兩組炎癥因子mRNA表達水平的比較

3 討論

隨著分子生物學技術的快速發展,慢病毒載體作為工具廣泛運用于基因編輯,人為將目的基因插入慢病毒載體,能高效地將目的基因導入真核生物細胞中,并隨著細胞的不斷分裂,可穩定并持久地表達目的基因[8-9]。

P62是最早發現的哺乳動物自噬相關受體之一。P62的Phox、PB1、LIR和UBA結構域在自噬降解病原微生物中發揮重要作用。當細菌入侵細胞時,P62在細菌感染細胞早期發揮重要作用。E3連接酶TRIM50、TRAF6、MURF2泛素化胞內細菌,然后被自噬適配器P62和NBR1識別,適配器將細菌定位到自噬小體上,并靶向胞內細菌進行自噬降解[10]。研究[10-11]顯示福氏鏈球菌和結核分枝桿菌以P62依賴的方式被選擇性靶向招募并傳遞到新生的LC3陽性自噬小體中進行降解。在巨噬細胞體外感染實驗中,P62與結核分枝桿菌共同定位并控制其生存和復制,而抑制巨噬細胞中的P62可以增加結核分枝桿菌的存活率[12]。本研究構建P62高表達THP-1細胞株,旨在為進一步探究P62在感染性疾病中的作用提供方法。

P62介導的異種吞噬的其他機制也被報道[13],在斑馬魚感染模型中,溶酶體蛋白DRAM-1通過招募P62限制海洋分枝桿菌感染。同時,P62可直接參與炎癥的調節[14]。如P62同源和異源性的PB1結構域與絲裂原激活蛋白激酶激活蛋白激酶3相互作用時發生二聚化,進一步共同作用于腫瘤壞死因子受體相關蛋白6,形成P62復合物,該復合物磷酸化和泛素化kappa B 抑制因子激酶復合物,進一步抑制NF-κB信號轉導。本研究成功構建高表達P62的THP-1細胞系后,進一步探究在感染模型中P62對炎癥因子的影響,發現高表達P62蛋白后促炎因子TNF-α、IL-1β 和Cxcl1的相對表達量均明顯增高,這可能與K.p.菌株感染劑量和時間有關。此外,P62在氧化應激調節方面也發揮重要作用,研究[15]顯示P62磷酸化后與keap-1相互作用,導致抗氧化基因Nrf2的表達增加。因此,本研究中促炎因子表達增高可能與激活氧化應激通路有關,相關機制有待進一步研究。

本實驗經三質粒包裝系統成功構建p62-pcDNA3.1-Flag-PCDH10慢病毒載體及高表達P62蛋白THP-1細胞株,為后續研究p62基因在感染性疾病中的作用提供了基礎。