環狀RNA_PLEKHM3通過miR-320/KLF4軸調控宮頸癌細胞上皮間質轉化

張亞男,崔 瑩,王天嬌,杜忠蕾

宮頸癌轉移的分子機制十分復雜,其中包括多種與轉移相關基因的突變和細胞的上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)[1],闡明宮頸癌細胞EMT的內在分子機制對宮頸癌的治療具有重要價值。環狀RNA(circular RNA,circRNA)是一種具有共價閉環的非編碼RNA,不受RNA外切酶的影響,因此circRNA的表達穩定,不易被降解[2]。研究[3]表明,circRNA在宮頸細胞中可能扮演腫瘤激活因子或抑制因子。circRNA的主要機制是通過作為一種分子海綿來調控微小RNA(microRNA,miRNA)的表達和功能,其作為一種分子支架調控miRNA與靶蛋白相互作用,從而發揮其生物學效應[4]。研究[5]表明circRNA-含Pleckstrin同源結構域家族M成員3(Pleckstrin homology domain-containing family M member 3,PLEKHM3)具有抑制癌癥的潛力,可以扮演抑癌基因的角色,如circRNA_PLEKHM3過表達可以起到增強姜黃素對卵巢癌細胞的抗凋亡作用以及對卵巢癌細胞惡性行為的抑制作用。但circRNA_PLEKHM3在宮頸癌中的作用尚不清楚。該研究旨在從細胞水平闡明circRNA_PLEKHM3在宮頸癌EMT中的作用機制,為宮頸癌的診斷和治療提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器circRNA_PLEKHM3過表達載體(pcDNA3.1-circRNA_PLEKHM3,circRNA_PLEKHM3)(貨號:C01001)、空載體Vector(貨號:C01001)、miR-320的模擬物(miR-320 mimics)(貨號:C09001)、miR-320的模擬物的陰性對照(mimics NC)(貨號:C09001)、miR-320的抑制劑(miR-320 inhibitor)(貨號:C09004)、miR-320的抑制劑的陰性對照(inhibitor NC)(貨號:C09004),小干擾RNA(siRNA)沉默畸變樣因子4(kruppel-like factor 4,KLF4)的重組質粒(si-KLF4)(貨號:G04003)、si-KLF4的陰性對照(si-NC)(貨號:G04003)、含circRNA_PLEKHM3野生型(circRNA_PLEKHM3-WT)或突變型(circRNA_PLEKHM3-MUT)結合位點DNA片段的重組質粒(貨號:G05002)、含有KLF4 3’UTR 野生型(KLF4 3’UTR WT)或突變型(KLF4 3’UTR MUT)結合位點的DNA片段的重組質粒(貨號:G05002)(上海吉瑪公司)。雙熒光素酶試劑盒(美國promega公司,貨號:E1910)。人宮頸鱗狀細胞系Hela(貨號:Delf-10469)和人宮頸癌上皮細胞系CaSki(貨號:Delf-10473)(美國ATCC公司),人體正常上皮細胞系HaCat(蘇州北納創聯生物技術有限公司,貨號:T25)。KLF4激活劑APTO-253(美國MCE公司,貨號:HY-16291)。胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(貨號:A5669701)、杜氏改良培養基(dulbecco's modified eagle medium,DMEM)培養基(貨號:12491015)(美國Gibco公司)。兔抗KLF4(貨號:ab222235)、上皮鈣黏蛋白(epithelial cadherin,E-cadherin)(貨號:ab40772)、神經鈣黏蛋白(neural cadherin,N-cadherin)(貨號:ab245117)、波形蛋白(Vimentin)(貨號:ab92547)、基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-2(貨號:ab92536)、MMP-9(貨號:ab76003)、磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase,GAPDH)(貨號:ab181603)的一抗及辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase,HRP)偶聯的山羊抗兔IgG二抗(貨號:ab205718)(英國Abcam公司)。生理鹽水(saline)(貨號:ST341)、結晶紫染色液(貨號:C0121)、Lipofectamine ?3000轉染試劑盒(貨號:C0526FT)、BCA蛋白檢測試劑盒(貨號:P0009)、RIPA裂解緩沖液(貨號:P0013B)、免疫熒光原位雜交試劑盒(貨號:R0306S)、FITC標記的circRNA_PLEKHM3探針設計與合成(貨號:R0306S)(上海碧云天生物科技有限公司)。異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)標記的抗小鼠二抗(貨號:ZF-0312)、FITC 標記的抗兔二抗(貨號:ZB-2301)(北京中杉金橋生物技術公司)。Transwell小室(美國SigmaAldrich公司,貨號:32011202)。二脒基苯基吲哚(diaminidine phenyl indole,DAPI)(北京Solaribo公司,貨號:28718-90-3)。pMIR-GLO熒光素酶載體(德國Promega公司,貨號:E1330)。熒光顯微鏡(德國蔡司公司,型號:Axio Imager A2);實時熒光定量PCR儀(型號:CFX96)、Western blot成像分析儀(美國Bio-Rad公司,型號:CFX96);(美國伯樂公司,型號:ChemiDoc)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養分組和轉染 Hela、CaSki、HaCat細胞分別用含有10%FBS的DMEM培養基培養,并置于37 ℃、含有5% CO2的細胞培養箱中進行培養。CaSki細胞的分組和轉染:分別將circRNA_PLEKHM3過表達載體pcDNA3.1-circRNA_PLEKHM3(circRNA_PLEKHM3組)、空載體Vector(Vector組)轉染至CaSki細胞,24 h后通過qRT-PCR檢測CaSki細胞PLEKHM3 mRNA表達以檢測細胞過表達circRNA_PLEKHM3的效果;分別將mimics NC(mimics NC組)、miR-320 mimics(miR-320 mimics組)以及inhibitor NC(inhibitor NC組)和miR-320 inhibitor(miR-320 inhibitor組)轉染至CaSki細胞,24 h后通過qRT-PCR法檢測miR-320表達;此外,在轉染circRNA_PLEKHM3的同時分別將mimics NC(circRNA_PLEKHM3+mimics NC組)和miR-320 mimics(circRNA_PLEKHM3+miR-320 mimics組)轉染至CaSki細胞,孵育24 h。在轉染circRNA_PLEKHM3的同時分別將si-NC(circRNA_PLEKHM3+si-NC組)和si-KLF4(circRNA_PLEKHM3+ si-KLF4組)轉染至CaSki細胞,孵育24 h。在轉染miR-320 mimics的同時分別加入aline(mimics+saline組)和APTO-253(miR-320 mimics+APTO-253組)處理CaSki細胞,孵育24 h。

1.2.2原位熒光雜交技術(fluorescence in situ hybridization,FISH)染色實驗檢測circRNA_PLEKHM3在Hela、HaCat和CaSki細胞中的分布 將正常培養且無處理的Hela、HaCat和細胞固定在4%多聚甲醛中,與含有circRNA_PLEKHM3探針的雜交緩沖液在37 ℃暗處雜交過夜。用DAPI染細胞核。用熒光顯微鏡獲取圖像。

1.2.3qRT-PCR檢測circRNA_PLEKHM3、KLF4 mRNA和miR-320的表達 收集HaCat、Hela和CaSki細胞的總RNA,逆轉錄為cDNA,行PCR擴增。以GAPDH為內參,采用2-△△CT法計算circRNA_PLEKHM3、miR-320、KLF4mRNA的相對表達量。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。引物序列見表1。

表1 PCR引物序列表

1.2.4雙熒光素酶報告基因實驗檢測miR-320和circRNA_PLEKHM3以及miR-320和KLF4的靶向關系 通過三個生物信息公共數據庫,starbase(star-base.sysu.edu.cn/)、target scan(targetscan.org/vert_70/)和circBase (http://www.circbase.org/)篩選出與circRNA_PLEKHM3有可能有相互作用的miRNA;同時在癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas,TCGA)(portal.gdc.cancer.gov)和ENCORI pan-cancer (https://rnasysu.com/encori/panCancer.php)數據庫中選擇在宮頸癌表達前100的miRNA,取miRNA的交集,篩選出circRNA_PLEKHM3可能的下游靶標是miR-320。

為檢測miR-320和circRNA_PLEKHM3的靶向調控作用,本研究合成了含有circRNA_PLEKHM3野生型(circRNA_PLEKHM3-WT)或突變型(circRNA_PLEKHM3-MUT)結合位點的DNA片段,并將其克隆到pMIR-GLO熒光素酶載體。分離重組質粒并測序。分別將mimics NC、miR-320 mimics、inhibitor NC、miR-320 inhibitor按照Lipofectamine?3000轉染試劑盒的說明書使用Lipofectamine?3000與circRNA_PLEKHM3-WT/circRNA_PLEKHM3-MUT片段共轉染CaSki細胞。轉染4 h后,更換培養基,將細胞置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養48 h,廢棄培養基,PBS洗滌細胞3次。用雙熒光素酶試劑盒檢測各組的熒光素酶活性。以螢火蟲熒光素酶活性值/海腎熒光素酶活性值作為熒光素酶活性。另外,本研究還合成含有KLF4 3’UTR 野生型(KLF4 3’UTR WT)和突變型(KLF4 3’UTR MUT)結合位點的DNA片段,并將其克隆到pMIR-GLO熒光素酶載體。分離重組質粒并測序。分別將mimics NC、miR-320 mimics、inhibitor NC、miR-320 inhibitor按照Lipofectamine?3000轉染試劑盒的說明書與KLF4 3’UTR WT/KLF4 3’UTR MUT片段共轉染CaSki細胞,以檢測miR-320和KLF4的結合作用,其余方法與circRNA_PLEKHM3一致。

1.2.5Western blot實驗 用RIPA裂解緩沖液從各組細胞中提取總蛋白質,采用BCA 蛋白檢測試劑盒檢測總蛋白濃度。SDS-PAGE分離蛋白:70 V、30 min轉120 V、90 min,將蛋白條帶以 300 mA 轉移到 PVDF 膜上。室溫下5%脫脂牛奶封閉 2 h,將膜與一抗在 4 ℃ 下孵育過夜:KLF4(1∶800)、E-cadherin(1∶1 000)、N-cadherin(1∶600)、Vimentin(1∶1 000)、MMP-2(1∶1 000)、MMP-9(1∶500)、GAPDH(1∶3 000),隨后將膜與HRP偶聯的山羊抗兔 IgG (1∶2 000) 于室溫下一起孵育 1 h。用 ECL 檢測試劑顯示蛋白條帶,并采用 ImageJ 軟件分析每個條帶的灰度值。

1.2.6Transwell侵襲和遷移實驗 在細胞侵襲實驗中預先在上室膜(膜的孔徑為8 μm)上涂基質膠,將各組的細胞(5×104個/組)懸浮在無血清培養基的Transwell上室中,下室充滿20%含FBS的培養基,37 ℃下孵育48 h后,將上表面的剩余細胞去除,固定膜下表面上的細胞,然后用結晶紫染色,并在光學顯微鏡下計數,從而測定細胞侵襲情況。在細胞遷移實驗中,上室膜不涂基質膠,其余步驟與細胞侵襲實驗一致。

2 結果

2.1 circRNA_PLEKHM3在宮頸癌細胞中的定位和表達經FISH染色觀察到circRNA_PLEKHM3和細胞核分別為綠色和藍色,circRNA_PLEKHM3定位于CaSki細胞的細胞質內(圖1A)。qRT-PCR檢測結果顯示,與HaCat細胞相比,circRNA_PLEKHM3在Hela細胞和CaSki細胞中的表達均降低,差異有統計學意義(t=16.254、21.842,均P<0.05)(圖1B)。

圖1 circRNA_PLEKHM3在HaCat、CaSki和Hela細胞中表達的比較

2.2 CaSki細胞中circRNA_PLEKHM3對miR-320和KLF4表達的影響以及circRNA_PLEKHM3對miR-320的靶向調控qRT-PCR檢測顯示,與HaCat細胞相比,在CaSki細胞中miR-320的mRNA表達上調(t= 118.589,P<0.05),而KLF4中的mRNA表達下調(t=35.549,P<0.05)。見圖2A-B。CaSki細胞轉染過表達circRNA_PLEKHM3的載體,與Vector組比,circRNA_PLEKHM3組的circRNA_PLEKHM3上調(t=141.362,P<0.05),miR-320的表達下調(t=23.514,P<0.05),KLF4蛋白表達上調(t=37.498,P<0.05)。見圖2C-D。提示在CaSki細胞中過表達circRNA_PLEKHM3可以抑制miR-320的表達,促進KLF4蛋白的表達。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示,在circRNA_PLEKHM3-WT轉染的CaSki細胞中,與mimics NC組比,miR-320 mimics組的熒光素酶活性下降(t=16.558,P<0.05),與inhibitor NC組比,inhibitor組的熒光素酶活性上調(t= 21.577,P<0.05)。而在circRNA_PLEKHM3-MUT轉染的CaSki細胞中,各組之間熒光素酶活性差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2E。提示miR-320是circRNA_PLEKHM3的靶點,circRNA_PLEKHM3可通過靶向調控miR-320抑制miR-320的表達。

圖2 CaSki細胞中circRNA_PLEKHM3對miR-320和KLF4表達的影響以及circRNA_PLEKHM3對miR-320的靶向調控

2.3miR-320靶向調控KLF4并抑制KLF4的表達用雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-320是否靶向調控KLF4。結果顯示,在KLF4 3’UTR-WT轉染的CaSki細胞中,與mimics NC組比,miR-320 mimics組熒光素酶活性下降(t=23.063,P<0.05),與inhibitor NC組比,inhibitor組的熒光素酶活性上調(t= 17.364,P<0.05)。而在KLF4 3’UTR-MUT轉染的CaSki細胞中,各組熒光素酶活性差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3A。說明miR-320能夠靶向調控KLF4。此外,qRCT和Western blot檢測結果顯示,與mimics NC組比,miR-320 mimics組的miR-320的mRNA表達上調(t=18.639,P<0.05),KLF4的mRNA和蛋白表達下降(t=16.603、21.558,均P<0.05);與inhibitor NC組比,miR-320 inhibitor組的miR-320的mRNA表達下調(t=14.557,P<0.05),KLF4的mRNA和蛋白表達升高(t=21.512、17.611,均P<0.05)。見圖3B-D。提示CaSki細胞中miR-320能夠通過靶向調控KLF4并抑制KLF4的表達。

圖3 miR-320靶向調控KLF4并抑制KLF4的表達

2.4 過表達circRNA_PLEKHM3抑制宮頸癌細胞的遷移、侵襲和EMTTranswell細胞遷移和細胞侵襲實驗結果顯示,與Vector組比較,circRNA_PLEKHM3組遷移細胞數和侵襲細胞數均下降(t=16.554、18.204,均P<0.05)。見圖4A-C。提示過表達circRNA_PLEKHM3抑制宮頸癌細胞的遷移和侵襲。Western blot法檢測EMT標志物E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-2、MMP-9的表達,結果顯示,與Vector組比較,circRNA_PLEKHM3組的E-cadherin的表達增加(t=20.714,P<0.05),N-cadherin、Vimentin、MMP-2、MMP-9的表達均降低(t=15.603、24.880、18.562、14.069,均P<0.05)。見圖4C-H。以上結果提示過表達circRNA_PLEKHM3抑制宮頸癌細胞的EMT。

圖4 過表達circRNA_PLEKHM3對宮頸癌細胞遷移、侵襲和EMT標志物的影響

2.5過表達circRNA_PLEKHM3通過抑制miR-320抑制宮頸癌細胞的遷移、侵襲、EMTTranswell細胞遷移和細胞侵襲實驗結果顯示,與circRNA_PLEKHM3+mimics NC組比較,circRNA_PLEKHM3+miR-320 mimics組的遷移細胞數和侵襲細胞數均上調(t=18.602、15.266,均P<0.05)。見圖5A-C。提示過表達circRNA_PLEKHM3通過抑制miR-320抑制宮頸癌細胞的遷移和侵襲。Western blot法檢測EMT標志物E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-2、MMP-9的表達,結果顯示,與circRNA_PLEKHM3+mimics NC組比較,circRNA_PLEKHM3+

圖5 過表達circRNA_PLEKHM3通過抑制miR-320對宮頸癌細胞遷移、侵襲和EMT標志物的影響

miR-320 mimics組的E-cadherin的表達減少(t=24.187,P<0.05),N-cadherin、Vimentin、MMP-2、MMP-9的表達均增加(t=17.629、11.984、16.332、19.045,均P<0.05)。見圖5D-I。提示過表達circRNA_PLEKHM3通過抑制miR-320抑制宮頸癌細胞的EMT。

2.6 過表達circRNA_PLEKHM3通過上調KLF4抑制宮頸癌細胞的遷移、侵襲、EMTTranswell細胞遷移和細胞侵襲實驗結果顯示,與circRNA_PLEKHM3+si-NC組比,circRNA_PLEKHM3+si-KLF4組的遷移細胞數和侵襲細胞數均上調(t=23.252、14.936;均P<0.05)。見圖6A-C。提示過表達circRNA_PLEKHM3通過上調KLF4抑制宮頸癌細胞的遷移和侵襲。Western blot法檢測EMT標志物E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-2、MMP-9的表達,結果顯示,與circRNA_PLEKHM3+si-NC組比,circRNA_PLEKHM3+si-KLF4組的E-cadherin的表達減少(t=15.423,P<0.05),N-cadherin、Vimentin、MMP-2、MMP-9的表達均增加(t=18.409、15.663、21.087、16.052,均P<0.05)。見圖6D-I。提示過表達circRNA_PLEKHM3通過上調KLF4抑制宮頸癌細胞的EMT。

圖6 過表達circRNA_PLEKHM3通過上調KLF4對宮頸癌細胞遷移、侵襲和EMT標志物的影響

2.7 過表達miR-320通過抑制KLF4促進宮頸癌細胞的遷移、侵襲、EMTTranswell實驗檢測結果顯示,與mimics NC組比,miR-320 mimics組的遷移細胞數和侵襲細胞數均上升(t=19.677、16.375,均P<0.05),與miR-320 mimics+saline組比,miR-320 mimics+APTO-253組的遷移細胞數和侵襲細胞數均下調(t=21.065、24.316,均P<0.05)。見圖7A-C。提示激活KLF4可以削弱miR-320 mimics對宮頸癌細胞的遷移和侵襲的促進作用。Western blot檢測結果顯示,與mimics NC組比,miR-320 mimics組的E-cadherin的表達減少(t=16.394,P<0.05),N-cadherin、Vimentin、MMP-2、MMP-9的表達均增加(t=18.662、25.213、21.809、15.364,均P<0.05);與miR-320 mimics+saline組比,miR-320 mimics+APTO-253組的E-cadherin的表達增加(t=14.801,P<0.05),N-cadherin、Vimentin、MMP-2、MMP-9的表達均降低(t=25.450、18.468、16.212、22.866,均P<0.05)。見圖7D-I。提示過表達miR-320通過抑制KLF4促進宮頸癌細胞的EMT。

圖7 過表達miR-320通過抑制KLF4對宮頸癌細胞的遷移、侵襲、EMT的影響

3 討論

circRNA在癌癥發生和發展中的生物學作用越來越受到關注[6]。本研究表明circRNA_PLEKHM3在宮頸癌細胞中低表達,其定位于細胞質內,提示circRNA_PLEKHM3在宮頸癌的發展中可能扮演重要角色;同時發現在宮頸癌細胞中過表達circRNA_PLEKHM3可抑制宮頸癌細胞的EMT、細胞增殖、細胞侵襲和遷移,這些結果提示,宮頸癌中circRNA_PLEKHM3可能是一種關鍵的抑癌靶點。此外,本研究還驗證了circRNA_PLEKHM3與miR-320之間的關系。過表達circRNA_PLEKHM3抑制了miR-320的表達。本實驗雙熒光素酶報告基因實驗的數據表明,miR-320是circRNA_PLEKHM3的靶點,miR-320 mimics抑制過表達circRNA_PLEKHM3對CaSki細胞遷移、侵襲以及EMT的抑制作用。

circRNA參與調控多種細胞生物學過程[7],也與宮頸癌密切相關[8]。本研究中,circRNA_PLEKHM3在宮頸癌細胞中低表達,過表達circRNA_PLEKHM3后,宮頸癌細胞的遷移和侵襲能力均下降,提示circRNA_PLEKHM3具有抑制宮頸癌細胞轉移的作用。

腫瘤轉移是宮頸癌預后不良的主要原因[9]。EMT是腫瘤細胞遷移和侵襲的關鍵步驟[9]。在EMT過程中,E-cadherin的降低會導致細胞連接被破壞,具有抑制癌細胞EMT、遷移和侵襲的作用,而N-cadherin的增加參與了EMT過程的發生,可促進細胞的遷移和侵襲[9]。E-cadherin和N-cadherin被報道[10]與惡性腫瘤和轉移有關。本研究表明,過表達circRNA_PLEKHM3能夠降低N-cadherin的蛋白表達并增加E-cadherin的蛋白表達,表明circRNA_PLEKHM3具有抑制宮頸癌細胞的EMT、轉移和侵襲的潛力。此外,Vimentin、MMP-2和MMP-9等蛋白也是EMT過程的關鍵參與因子[11]。本研究結果顯示,過表達circRNA_PLEKHM3抑制了Vimentin、MMP-2和MMP-9的表達,這些發現進一步證明了circRNA_PLEKHM3在宮頸癌EMT調控中的重要性。

許多cicrRNA通過調節miRNA的表達來實現其調控功能。miR-320作為促癌miRNA分子,在腫瘤組織中表達上調[5]。本研究表明miR-320是circRNA_PLEKHM3在宮頸癌細胞中的靶分子,circRNA_PLEKHM3過表達明顯抑制了宮頸癌細胞中miR-320的表達,細胞遷移和侵襲實驗也揭示了miR-320的模擬物逆轉了circRNA_PLEKHM3對宮頸癌細胞遷移、侵襲、EMT的抑制作用,這就證明miR-320參與了circRNA_PLEKHM3對宮頸癌細胞惡性進展的負調控作用。近年來發表的文章[5]支持了本研究結果,如在卵巢癌細胞中circRNA_PLEKHM3與miR-9或miR-320都具有靶向調節關系,circRNA_PLEKHM3可明顯抑制miR-9或miR-320的表達,當過表達miR-9或miR-320后,circRNA_PLEKHM3對卵巢癌細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲的調作用被逆轉。

miRNA通過靶向調控基因的表達來對腫瘤細胞進行調控。之前的研究[5]顯示miR-320在卵巢癌中是促癌miRNA。本研究中的結果表明miR-320的靶基因是KLF4。作為一個關鍵抑癌基因,KLF4在多種腫瘤中的蛋白表達缺失,過表達KLF4表現出明顯的抗腫瘤特征[12]。本研究進一步觀察到miR-320 mimics可以抑制KLF4的表達,而KLF4的激活劑APTO-253則抑制了miR-320 mimics對宮頸癌細胞遷移、侵襲和EMT過程中的促進作用。提示KLF4是miR-320的功能性下游靶基因。此外,本研究還證明circRNA_PLEKHM3過表達可以促進KLF4的表達,而沉默KLF4能夠明顯恢復細胞遷移、侵襲和EMT過程。由此可見,circRNA_PLEKHM3通過抑制miR-320的上調來抑制KLF4的表達,從而調控宮頸癌細胞的EMT過程。

綜上所述,本研究結果表明circRNA_PLEKHM3在宮頸癌細胞的EMT中具有抑制作用。通過調節miR-320的表達,circRNA_PLEKHM3能夠對KLF4的表達進行調控。這些發現為進一步了解和干預宮頸癌的轉移和侵襲提供了重要的理論依據,也為開發新的治療策略和靶向藥物提供了潛在的方向。然而,還需要更多的研究來深入探究circRNA_PLEKHM3、miR-320和KLF4之間的調控網絡,以及它們在宮頸癌發生與發展中的具體作用機制。