朗格漢斯細胞組織細胞增生癥臨床特點及其BRAF V600E 基因突變與預后的相關性*

朱麗華, 金皎*, 高勤, 吳莎莎, 黃璟

(1.貴州醫科大學附屬醫院 兒科血液?？? 貴州 貴陽 550004; 2.貴州醫科大學附屬醫院 病理科, 貴州 貴陽 550004)

朗格漢斯細胞組織細胞增生癥(langerhans cell histiocytosis,LCH)是一種罕見的以朗格漢斯細胞增生為特征的一組病變,病因尚未明確[1]。LCH可能侵及骨骼、皮膚、淋巴結或實質器官,如肝、脾、骨髓,臨床以單系統病灶發病多見,常見于骨骼系統。該病臨床表現差異極大,輕者僅累及骨骼、皮膚,重者可累及多器官并造成重要臟器功能損害,患者預后較差,其發病率與年齡呈負相關,好發于兒童(約占70%),隨年齡增長,發病率逐漸降低,各個年齡段均可發病[2]。兒童發病率約為 (3～5)/100 萬[3],成人相對較少,發病率約為(1～2)/100 萬[4]。LCH起病癥狀較隱匿,臨床表現復雜多樣,具有高度異質性,臨床易漏診或誤診。研究發現其存在著多種基因突變,包括BRAF V600E、ARAF 及 MAP2K1 基因等,其中BRAF V600E基因突變對于疾病的預后判斷依舊存在著爭議,仍是一個尚未解決的難題。本研究對收治的17例LCH患者的臨床特點、組織病理學特點、治療結局、BRAF V600E基因突變情況進行整理分析,以提高對LCH的認識,同時統計分析LCH中BRAF V600E基因的突變率及其對于患者預后的影響,從而進一步分析它的臨床意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2014年2月—2020年6月收治的17例LCH患者作為研究對象,納入標準:(1)符合國際組織細胞協會2009年的LCH評估與治療指南的診斷標準[5];(2)有本院活檢組織病理確診的病例;(3)進行BRAF V600E基因突變情況檢查;(4)資料信息完整;(5)治療后隨訪。排除標準:(1)未達確診標準或無本院活檢組織病理確診的病例;(2)未進行BRAF V600E基因突變情況檢查;(3)資料信息不全;(4)治療后未隨訪。

1.2 研究方法

1.2.1臨床特點分析 記錄LCH患者的首發病變部位(皮膚、淋巴結、肝脾、肺部、耳、骨、中樞神經系統)及各病變部位的具體表現。

1.2.2組織學檢查 取患者首發病變部位組織,其中骨組織預先經脫鈣處理,采用蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining,HE )進行組織學檢查,切片(厚度5 μm ,長度0.5 cm)平鋪于38 ℃純水,待伸展完全后撈出,放入60 ℃烘箱烤片5 h,經常規脫蠟、水化,蘇木素染色3～5 min、水洗5 min,鹽酸酒精分化數秒后水洗5 min,伊紅染色1 min、水洗5 min,經70%、80%、90%、100%梯度乙醇脫水各1次、每次10 s,浸入二甲苯3 min、中性樹膠封片。

1.2.3基因檢測與分組 通過數字聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)擴增和一代測序的方法測定患者首發病變部位組織標本中的BRAF V600E 基因,提示BRAF V600E 陽性,則判為陽性,完善檢測,無陽性結果則判為陰性;根據LCH臨床分型將17例患者分為單系統病變(singlesystem Langerhans cell histiocytosis,SS-LCH)組和多系統病變(multi-system Langerhans cell histiocytosis,MS-LCH)組以及根據年齡分為未成年組和成年組。

1.2.4治療與預后 根據LCH患者病變范圍及受累部位,實施具體治療手段,包括手術切除、化學藥物治療及放射治療;統計治療手段,通過隨訪記錄預后情況。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 臨床特點分析

17例患者中,病灶首發于骨骼13例(76.47%),累及部位包括額骨、頂骨、枕骨及顳骨等部位,X線、CT或MR上可表現為局限性或多發性骨質破壞伴軟組織腫塊形成、密度減低,頭顱骨可表現為骨質缺損,椎體損害表現為椎體變扁、骨質破壞并椎體壓縮;首發于皮膚者2例(11.76%),均為嬰兒期患兒,受累部位以顏面部、軀干部多見,表現為遷延不愈、新舊不一的淡紅色或紫紅色丘疹、濕疹樣皮疹,部分結痂,皮疹高出皮膚表面,中間凹陷,壓之不褪色,可伴少許鱗屑、脂溢性皮炎,皮疹消退后可遺留色素脫失斑等,外用藥物治療效果欠佳;首發于淋巴結患者2例(11.76%),多數大小在0.5～5.0 cm,質中,無壓痛,部分可融合成團,與周圍組織粘連,多累及雙側頜下、頸部、腋窩、腹股溝處等淋巴結;首發于肝脾部位患者4例(23.53%),其中合并肝、脾受累3例(17.65%),多表現為肝臟腫大、最大肋下5 cm、CT上表現為肝臟體積增大伴多發小結節狀低密度影、肝臟囊腫等,單獨脾臟受累1例(5.88%),表現為脾臟腫大、最大肋下5 cm、無明顯脾功能亢進癥狀;首發于肺部患者1例(5.88%),表現為咳嗽、咳痰、呼吸困難;合并耳受累1例(5.88%),表現為耳朵疼痛,伴聽力下降,反復耳朵流膿,抗感染治療效果欠佳;首發于中樞神經系統合并有尿崩癥者1例(5.88%),垂體MR可見垂體柄結節影。本次收集17例病例中,2例首診于皮膚科,1例首診于耳鼻喉科,5例首診于兒科,余9例首診于骨科,首個癥狀出現至明確診斷時間為7 d至3年不等。由此可見,本病累及器官多、臨床表現多種多樣是導致誤診及延長診斷時間的主要原因,需結合臨床表現、病理學特點、免疫組化結果確診。見表1。

表1 17例患者的臨床特點Tab.1 Clinical characteristics of 17 cases with LCH

2.2 組織學檢查

結果顯示,病變組織主要由朗格漢斯細胞及嗜酸性粒細胞組成,可伴數量不等的淋巴細胞、泡沫樣組織細胞,局灶區域可見肉芽腫形成及多核巨細胞,朗格漢斯細胞中等偏大,核呈卵圓形、短梭形或橢圓形,可見核折疊、核溝(圖1);其中朗格漢斯細胞陽性表達白細胞分化抗原1a(cluster of differentiation 1a,CD1a) 100%(17/17),鈣結合蛋白(calcium-binding protein,S-100) 100%(17/17),細胞核增值相關抗原Ki-67(nuclear proliferation associated antigen Ki-67) 88%(15/17),白細胞分化抗原68(cluster of differentiation 68,CD68)82%(14/17),細胞因子(cytokine,CK)、白細胞分化抗原3(cluster of differentiation 3,CD3)、白細胞分化抗原20(cluster of differentiation 20,CD20)、上皮膜抗原(epithelial membrane antigen,EMA)均陰性。

圖1 部分患者病變部位的朗格漢斯細胞HE染色Fig.1 HE staining of Langerhans cells in some patients with LCH

2.3 基因檢測與分組

結果表明,7例檢出BRAF V600E 基因突變,總陽性率41.18%;其中SS-LCH組13例,BRAF V600E 基因突變7例,陽性率53.85%,MS-LCH組未發生BRAF V600E基因突變。未成年人組12例,其中BRAF V600E 基因突變5例,陽性率41.67%,在3歲以下低齡兒童病變中BRAF V600E基因突變率是3歲以上的2倍,成年人組共5例,其中BRAF V600E 基因突變2例,陽性率40.00%,這17例患者的BRAF V600E基因分別在多系統與單系統、未成年人與成年人組間比較中,差異均無統計學意義(P>0.05)。見表2、表3。

表2 SS-LCH與MS-LCH組BRAF V600E基因突變陽性率分析Tab.2 Analysis of positive rate of BRAF V600E gene mutation between SS-LCH group and MS-LCH group

表3 成年組與未成年組BRAF V600E基因突變陽性率分析Tab.3 Analysis of BRAF V600E gene mutation positive rate between the adult group and juvenile group

2.4 治療與預后

結果表明,單純化療7例、單純手術治療5例、手術+化療4例、手術+化療+放療1例;其中以化療為主的全身治療最多,占 41.18%,其次為單純手術治療,占29.41%,手術+化療占23.53%,手術+化療+放療占5.88%;化療方案包括VP化療方案(長春新堿+潑尼松)、CHOP化療方案(環磷酰胺+多柔比星+長春新堿+潑尼松) 、COP化療方案(環磷酰胺+長春地辛+潑尼松)、LCH-Ⅲ化療方案(長春花堿+潑尼松)、DAL-HX83/90化療方案(潑尼松+長春地辛+依托泊苷+甲氨喋呤+巰嘌呤)、CCAP( 環磷酰胺+阿糖胞苷+潑尼松)、SCMC-LCH-2008(上海兒童醫學中心LHC方案),均未采用維羅非尼靶向治療。隨訪 5～81 個月,中位隨訪時間58個月,其中SS-LCH組均治愈,MS-LCH組中1例患者隨訪8個月后死亡,3例患者分別隨訪41個月、48個月、52個月時出現復發,且均無BRAF V600E基因突變。SS-LCH組預后較好,MS-LCH組預后較差,但差異無統計學意義(P>0.05);復發患者現仍繼續治療中,共16例患者生存至今,其中復發及死亡患者均為未成年組患兒,受累器官較多,其余患者均治愈,目前均未復發,7例BRAF V600E基因突變患者治療效果尚可,均已治愈,提示BRAF V600E 基因突變對生存的影響差異無統計學差異(P>0.05)。見表4。

表4 BRAF V600E基因突變陽性與陰性患者預后分析(例)Tab.4 Prognosis analysis of BRAF V600E gene mutation positive and negative cases

3 討論

LCH是一種以朗格漢斯細胞組織細胞異常增殖為病理特征的罕見疾病。由于LCH特有的形態學表現(組織細胞形態上含有大細胞的組織病變),多種研究表示其與巨噬細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞、巨細胞有關[6],長期以來一直被歸類為單核 - 巨噬細胞系統的疾病[7]。LCH 病變包括浸潤的病理性樹突狀細胞、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞和富含調節性T細胞的淋巴細胞。有研究表明樹突細胞表達高水平的T細胞共刺激因子和促炎細胞因子,細胞因子與趨化因子受體構成“細胞因子風暴”[8]。近年來,研究證明大量的樹突狀細胞可表達多效細胞因子骨橋蛋白,促進T輔助細胞的產生,組織細胞招募單核細胞和破骨細胞活化,同時也會產生大量組織破壞性酶[9],可導致受累組織的損壞,約75%患者激活的體細胞中發現BRAF V600E(57%),提示 LCH 有腫瘤增殖的過程[10]。BRAF 突變是LCH的診斷和預后指標,也是 BRAF V600E 特異性抑制劑靶向治療的重要指標[11]。LCH尚缺乏標準的治療方案,化療方案多種多樣,包括單用潑尼松、潑尼松和長春新堿聯合用藥,外科治療包括皮膚病變局部治療、骨病灶刮除等。近年來,BRAF V600E突變的發現改變了研究者對LCH發病機制的認識以及對治療的選擇[10]。程曉燁等[12]經過對中國50例LCH患者的研究發現BRAF V600E突變率可高達58%,研究表明BRAF V600E突變激活下游MEK/ERK通路,從而促進腫瘤的發生與發展,在無BRAF V600E突變的LCH患者中,還有部分患者具有MAP2K1的突變。BRAF抑制劑維羅非尼,在治療BRAF V600E陽性的LCH患者中取得了不錯的療效,有效率達42%[13]。遺憾的是,在本研究中并未進行MAP2K1基因的檢測及未針對BRAF V600E陽性的LCH患者使用維羅非尼治療。

LCH病變累及單系統到多系統,可受累全身骨骼,頭頸部受累較為常見,常見受累骨骼包括頜面骨及顳骨[14];累及耳顳部時,可出現耳顳部疼痛、腫脹、流膿,甚至鼓膜穿孔、耳聾等癥狀;累及顱底時,可出現頭痛、腦脊液漏;如累及垂體時可出現尿崩癥[15]?；颊呓洺Ｊ自\于骨科、耳鼻喉科,所以臨床上遇到兒童患病就診時要多加注意,如伴有顱骨缺損、頭顱包塊、皮疹、外耳道流膿等癥狀時應考慮LCH的可能。對頭顱包塊的定位可通過頭顱CT及MR的檢查進行,LCH顱骨病變在CT及MR可有特征性表現[16],典型的CT表現為大塊溶骨性破壞,具有特征性“地圖狀”外觀,病變不規則強化。另外,LCH所引起的中樞神經系統病變損傷常局限于下丘腦-垂體 ,因此當患者出現多飲、多尿等尿崩癥癥狀時應首選MR檢查以明確腦內病變[17]。影像學檢查結合臨床表現有助于早期診斷及評估預后[18],而至關重要的是要進行病變部位的組織病理學檢查及免疫組織化學檢查以便確診。

本研究中,17例患者均進行BRAF V600E基因突變檢測,基因突變率為41.18%(7/17)。Badalian-Very 等[10]在石蠟包埋的LCH組織切片上檢測到57%的BRAF V600E基因突變,并通過免疫熒光染色檢測BRAF V600E突變的LCH細胞中2個下游激酶 MEK/ERK 的活化。Satoh等[19]和 Kansal等[20]在 CD1a+LCH 細胞上證實了BRAF V600E基因突變的存在。多個研究小組在LCH患者中檢測到BRAF V600E基因突變,陽性率為 38% ～ 69%[21],本研究中BRAF V600E基因突變陽性率與相關報道文獻相符。本研究發現未成年組發生BRAF V600E 基因的突變率與成人組差異無統計學意義(P>0.05),或因病灶標本量少,且基因突變在LCH中的研究處于起步階段所以仍有許多問題需系統且深入的研究,該結論具有一定的局限性。Allen等[22]發現BRAF V600E基因突變發生在髓系樹突狀細胞中會形成高風險的LCH,而突變發生在分化成熟的樹突狀細胞中會形成低風險的LCH,提示 BRAF基因和LCH預后是密切相關的;而且,有研究也證實BRAF V600E基因突變會導致LCH預后變差[23]。然而,本文研究未發現BRAF V600E基因突變對LCH的生存有直接影響,可能是因為參與本次研究的標本大多數是單系統性的疾病,預后本來就很好[24];或者說這個基因突變發生在分化成熟的樹突狀細胞中,形成了低風險的LCH,但這需要進一步的實驗研究去證實;也可能是由于參與本次研究的LCH標本病變部位大部分都來源于骨(76.5%),有學者做了大標本的臨床研究,發現在LCH中病變部位如果侵及到骨組織會比未侵及到骨組織的預后要好[25]。

總之,LCH 臨床表現復雜多樣,易誤診,確診需要依靠組織病理學檢查,不同分型組在臟器受累范圍和程度指標上有明顯不同,其治療方案必須根據患者發病部位和病變范圍進行相應調整[26]。LCH 病變嚴重程度差異大,主要侵及的部位是骨組織,且預后良好,但累及重要器官的多系統病變預后較差。LCH常見的突變基因是 BRAF V600E,其在多系統與單系統、未成年人與成年人組間比較中,差異均無統計學意義(P>0.05),但3歲以下兒童病變中BRAF V600E基因突變率有增高的趨勢,未觀察到BRAF V600E 基因突變對生存的有影響,但尚需擴大樣本進一步研究。