環狀RNA MAPK4通過吸附miR-125a-3p對神經膠質瘤細胞生物學行為的影響*

郝建強, 何森, 謝飛, 張文彥, 葉勇強

(資陽市中心醫院 神經外科, 四川 資陽 641300)

神經膠質瘤是常見的中樞神經系統腫瘤疾病之一,其病例占原發顱內腫瘤的27%以上,具有發病率高、預后差和死亡率高的特點[1]。目前治療神經膠質瘤方式主要包括放療、化療、手術和靶向治療等,但患者的具體治療方案還需要根據患者自身的精神狀態、治療的預期結果、腫瘤病變部位以及病變的嚴重程度等眾多因素進行綜合考慮[2]。雖然目前已有的治療方式可以改善一部分神經膠質瘤患者的預后和提高患者的生存期,但是仍有部分患者的治療效果欠佳。分析神經膠質瘤的發病機制對指導神經膠質瘤靶向藥物研究、設計均有重要意義。神經膠質瘤是腦膠質細胞癌變所致,其發病與基因突變、表觀遺傳學變異有關,基因、蛋白異常表達受到多種因子調節,例如環狀RNA(circular RNA,circRNA)、微小RNA(microRNA,miRNA)等[3-4]。circRNA是由外顯子或內含子經選擇性剪切產生的一類非編碼RNA,具有較高的穩定性、保守性、組織特異性及高豐度等特點,可在組織中穩定性表達,還可參與不同疾病發生、進展過程,其中包括惡性腫瘤[5]。有研究表明環狀RNA MAPK4(circular RNA MAPK4,circ-MAPK4)在神經膠質瘤組織中表達上調[6],推測其可能參與神經膠質瘤的發生過程,但其作用機制尚未闡明。因此,本研究基于生物信息數據庫、神經膠質瘤細胞體外實驗來初步探討circ-MAPK4對神經膠質瘤細胞生物學行為的影響及其潛在作用機制,希望能為神經膠質瘤的靶向藥物研究、設計提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞 人神經膠質瘤細胞株(U138、U373、U87、A172和U251)和人正常性星形膠質細胞(HA1800)均由中國典型培養物保藏中心提供。

1.1.2主要試劑和儀器 1%青霉素/鏈霉素、Trizol提取試劑盒、V-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒、Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen,circ-MAPK4 siRNA、siRNA-NC和miR-125a-3p inhibitor、NC-inhibitor、微小RNA-125a-3p(miR-125a-3p)mimics、NC- mimics購自廣州市銳博生物科技有限公司,PrimeScriptTMRT Master Mix購自日本Takara,GoTaq?Green Master Mix購自美國Promega,LightCycler?480 SYBR Green I Master購自瑞士Roche,CCK-8細胞活力試劑盒購自美國APExBio,兔抗上皮細胞鈣黏蛋白(E-cadherin)、N-cadherin、Ceaved-caspase3、Ki67、cycD、Vimentin、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、羊抗兔IgG二抗購自美國Santa Cruz,基質膠、Transwell小室購自北京優尼康生物科技有限公司。LightCycler 480熒光定量PCR儀器購自瑞士Roche,ReadMax 1900Plus多功能酶標儀購自上海閃譜生物科技有限公司,BB15 CO2細胞培養箱購自美國Thermo Fisher Scientific,CytoFLEX LX流式細胞儀購自美國Beckman Coulter。

1.2 研究方法

1.2.1細胞培養 將U138、U373、U87、A172、U251細胞接種于DMEM高糖培養基中進行貼壁生長,細胞培育環境為37 ℃、5%CO2加濕培養箱;HA1800細胞接種至星形膠質細胞培養基生長,培養環境條件與神經膠質瘤細胞相同;待細胞生長融合80%～90%時進行傳代培養,取第3代細胞用于后續實驗。

1.2.2實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qPCR)測神經膠質瘤細胞中基因表達水平 使用Trizol試劑盒提取各組細胞系的總RNA,使用PrimeScriptTMRT Master Mix、GoTaq?Green Master Mix進行逆轉錄擴增,使用LightCycler?480 SYBR Green I Master進行qPCR擴增,擴增條件為95 ℃ 5 min,95 ℃ 10 s、60 ℃ 20 s、75 ℃ 15 s,40個循環,使用2-ΔΔt法計算目的基因表達水平。引物序列:circ-MAPK4,正向引物為5′-ATCAGCACAGAGGACCTCGT-3′, 反向引物為5′-ATCCTCTGGAGCCTTTG GA T-3′; miR-125a-3p,正向引物為5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCG CACTGGATACG

ACGGCTCCC-3′,反向引物為5′-TGACCACAGGTGAGGTTCTTG-3′;U6,正向引物為5′-CGCTT CGGCAGCACATATAC-3′,反向引物為5′-TTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。

1.2.3細胞轉染 以神經膠質瘤細胞中circ-MAPK4表達水平最低的U138細胞作為轉染細胞背景,將U138細胞分為circ-MAPK4低表達組(si-circMAPK4組)、陰性對照組(si-NC組)、無轉染組(control組),使用Lipofectamine?2000將si-circMAPK4組、si-NC組U138細胞分別轉染circ-MAPK4 siRNA及其陰性對照siRNA-NC,control組細胞不做轉染處理,使用qPCR檢測circ-MAPK4水平。經qPCR驗證轉染成功后,si-circMAPK4組U138細胞分為2個亞組(circ-MAPK4+miR-inhibitor組、circ-MAPK4+NC-inhibitor組),將miR-125a-3p inhibitor、NC-inhibitor分別轉染circ-MAPK4+miR-inhibitor組、circ-MAPK4+NC-inhibitor組細胞,并使用qPCR驗證。

1.2.4熒光素酶實驗 使用circNet、StarBase分析預測circ-MAPK4與miR-125a-3p的靶向關系和結合位點,使用熒光素酶實驗驗證circ-MAPK4對miR-125a-3p的靶向調控作用,將circ-MAPK4的全基因(hsa_circ_0047688)插入熒光素酶基因下游,將野生型circ-MAPK4熒光素酶重組載體記為circ-MAPK4-WT,通過點突變構建突變型circ-MAPK4熒光素酶重組載體并記為circ-MAPK4-mut,將circ-MAPK4-WT、circ-MAPK4-mut、miR-125a-3p mimics、NC- mimics共轉染至U138細胞,檢測熒光素酶活性。

1.2.5CCK-8法檢測細胞活力 將U138細胞接種至96孔板(1×103/孔),培養條件同1.2.1,分別在培養第1、2、3、4、5天時加入CCK-8反應溶液37 ℃反應2 h,然后在分光光度計450 nm波長處檢測吸光度。

1.2.6細胞集落實驗檢測細胞增殖能力 將U138細胞接種至培養皿(1×103/孔),輕柔搖動培養皿使細胞能夠均勻分布,在1.2.1條件下培養7 d,使用磷酸緩沖液輕柔洗滌2次,甲醇固定細胞10 min,0.1%結晶紫染色10 min,在顯微鏡下統計細胞克隆數(細胞數>50個),克隆形成率(%)=(克隆數/接種細胞數)×100%。

1.2.7Transwell檢測細胞侵襲能力 將細胞接種至預先涂有Matrigel膠無血清Transwell小室(1×105/孔),下室加入含有血清的培養基,同1.2.1培養條件培養24 h,將下室細胞用4%多聚甲醛固定,1%結晶紫染色,隨機5個不重疊視野,計算其中侵入細胞數目。

1.2.8流式細胞法檢測細胞凋亡情況 將U138細胞接種至96孔板(4×105/孔),培養條件同1.2.1培養24 h,收集細胞,加入 Annexin V-FITC 5 μL和PI 10 μL 避光反應20 min,上樣流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.9Western blot檢測蛋白表達 提取細胞總蛋白,采用Bradford調整各組蛋白濃度一致,經10%SDS-PAGE凝膠電泳、電轉膜至PVDF膜,密封2 h,加入兔抗人Ki67、cycD、N-cadherin、Vimentin、E-cadherin、Ceaved-caspase3、GAPDH一抗(1∶500)4 ℃ 孵育過夜,漂洗,加入HRP標記二抗(1∶500)孵育1 h,化學發光,凝膠圖像處理系統軟件分析待測蛋白條帶相對灰度值。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 人神經膠質瘤細胞中circ-MAPK4和miR-125a-3p表達水平

與HA1800細胞比較,U138、U373、U87和A172細胞的circ-MAPK4表達水平升高(P<0.05),miR-125a-3p表達水平下降(P<0.05)。見表1。

表1 神經膠質瘤細胞系和HA1800細胞circ-MAPK4、miR-125a-3p表達水平Tab.1 Expression levels of circ-MAPK4 and miR-125a-3p in glioma cell lines and HA1800

2.2 circ-MAPK4和miR-125a-3p的靶向關系驗證

與si-NC組比較,si-circMAPK4組細胞的circ-MAPK4表達水平降低(P<0.05),miR-125a-3p表達水平升高(P<0.05);與circ-MAPK4+NC-inhibitor組比較,circ-MAPK4+miR-inhibitor組細胞miR-125a-3p表達水平降低(P<0.05),見表2。經circNet、StarBase分析預測circ-MAPK4與miR-125a-3p存在靶向關系(圖1),熒光素酶實驗結果顯示circ-MAPK4-mut/miR-125a-3p mimics、circ-MAPK4-mut/NC-mimics、circ-MAPK4-WT/NC-mimics細胞的熒光素酶相對活性均高于circ-MAPK4-WT/miR-125a-3p mimics細胞(F=437.659,P<0.001)。

圖1 circ-MAPK4和miR-125a-3p結合位點預測Fig.1 Prediction of binding site between circ-MAPK4 and miR-125a-3p

表2 不同組別細胞circ-MAPK4和miR-125a-3p的靶向關系Tab.2 Targeted relationship between circ-MAPK4 and miR-125a-3p

2.3 circ-MAPK4低表達對U138細胞增殖的影響

與si-NC組比較,si-circMAPK4組細胞活力、克隆形成率、Ki67和cycD蛋白表達降低(P<0.05);與circ-MAPK4+NC-inhibitor組比較,circ-MAPK4+miR-inhibitor組細胞活力、克隆形成率、Ki67和cycD蛋白表達升高(P<0.05)。見圖2、表3。

注：(1)與si-NC比較,P<0.05;(2)與circ-MAPK4+NC-inhibitor組比較,P<0.05。

表3 不同組別細胞增殖、Ki67和cycD蛋白表達Tab.3 Cells proliferation and expressions of Ki67 and cycD

2.4 circ-MAPK4低表達對U138細胞侵襲的影響

與si-NC組比較,si-circMAPK4組細胞侵入細胞數目、N-cadherin和Vimentin蛋白表達降低(P<0.05),E-cadherin蛋白表達升高(P<0.05);與circ-MAPK4+NC-inhibitor組比較,circ-MAPK4+miR-inhibitor組細胞侵入細胞數目、N-cadherin和Vimentin蛋白表達升高(P<0.05),E-cadherin蛋白表達降低(P<0.05)。見圖3、表4。

圖3 circ-MAPK4低表達對U138細胞侵襲的影響(Transwell,×200)Fig.3 Effects of low-expression circ-MAPK4 on invasion of U138 cells (Transwell,×200)

表4 不同組別細胞侵入數目、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達Tab.4 Number of invasion cells and expressions of E-cadherin, N-cadherin, and Vimentin

2.5 circ-MAPK4低表達對U138細胞凋亡的影響

與si-NC組比較,si-circMAPK4組細胞凋亡率、Ceaved-caspase3/caspase3蛋白表達升高(P<0.05);與circ-MAPK4+NC-inhibitor組比較,circ-MAPK4+miR-inhibitor細胞凋亡率、Ceaved-caspase3/caspase3蛋白表達降低(P<0.05)。見表5。

表5 細胞凋亡率、Ceaved-caspase3/caspase3蛋白表達Tab.5 Apoptosis rate and expression of Ceaved-caspase3/caspase3

3 討論

神經膠質瘤病變的惡性機率高于其他類型腫瘤,患者的生存期不超過2年,5年生存率低于10%,雖然經手術、放療、化療等治療可增加患者存活率,但膠質瘤細胞的惡性生物學行為易引起患者術后復發或對放化療產生抵抗作用,不利于延長患者的生存時間[7-8]。神經膠質瘤的惡性生物學行為變化受到多種因素的共同調節。20世紀70年代時,circRNA在RNA病毒中被發現,屬于一種特殊的非編碼RNA,是前體RNA的3’末端和5’末端首尾相連產生的環狀結構,性質穩定、富集高且重復檢測性好,還可參與多種疾病發病、進展過程[9]。已有研究[10]表明circRNA-FBXW7表達與膠質瘤患者的總生存期存在正相關,還有學者[11]證實circ_002136表達下調可顯著抑制U87細胞的活力、侵襲和血管形成,與調節miR-138-5p表達有關。miRNA是一大類非編碼小RNA,經堿基互補配對方式直接作用信使RNA,調節多種基因的轉錄、翻譯過程和參與疾病發生[12]。隨著研究深入發現circRNA可充當miRNA分子海綿,對miRNA有吸附、捕獲作用并使miRNA不能與其靶向的mRNA結合,從而調節其基因的表達水平[13]。有研究表明circ-TTBK2可通過吸附miR-761靶向調節膠質瘤細胞的增殖、侵襲和凋亡[14]。最近有研究顯示circ-MAPK4在膠質瘤組織中呈明顯表達升高趨勢[15]。本研究通過比較人神經膠質瘤細胞系和人正常膠質細胞circ-MAPK4表達水平發現,人神經膠質瘤不同細胞系中circ-MAPK4表達水平大致相同,大部分呈現出升高趨勢,其中U138細胞系circ-MAPK4表達水平最顯著,此結果與上述研究趨勢相似,由此推測circ-MAPK4可能參與人神經膠質瘤發病過程。

circRNA可作為miRNA分子海綿,推測circ-MAPK4可能是通過某種miRNA作用發揮其功能,本研究通過circNet、StarBase在線分析預測發現,circ-MAPK4與miR-125a-3p存在結合位點,并且通過熒光素酶實驗得到證實,此外還發現U138細胞miR-125a-3p表達水平較HA1800細胞明顯降低,說明circ-MAPK4與miR-125a-3p存在靶向關系。神經膠質瘤較其他腫瘤的惡性病變程度高,這與其活躍的細胞惡性生物學行為存在密切關系,腫瘤細胞的惡性生物學行為與其不受控制的細胞增殖、細胞侵襲和細胞凋亡能力降低有關。因此,本次研究為探究circ-MAPK4對人神經膠質瘤細胞的惡性細胞生物學行為的影響,以U138細胞作為神經膠質瘤細胞體外研究背景構建circMAPK4低表達細胞和在此基礎上構建miR-125a-3p 低表達細胞系,發現circMAPK4低表達細胞的細胞活力、克隆形成率降低,進一步分析蛋白表達發現Ki67和cycD蛋白表達降低,而在circMAPK4低表達的基礎上抑制miR-125a-3p表達可以部分逆轉上述指標趨勢。Ki67屬于細胞增殖抗原,其表達水平高低可展示細胞的增殖情況[16]。cycD是調節細胞周期運行的周期蛋白,其表達水平可以反映細胞增殖情況[17]。已有研究[18]表明miR-125a-3p可以通過抑制cycD等細胞周期相關蛋白表達來抑制結腸癌細胞增殖,本研究結果呈現出相似趨勢,說明circMAPK4可能通過吸附miR-125a-3p調節U138細胞增殖過程。

本研究還發現circMAPK4低表達可以降低U138細胞的侵入細胞數目和N-cadherin、Vimentin蛋白表達,但可提高細胞凋亡率和E-cadherin、Ceaved-caspase3/caspase3蛋白表達。腫瘤上皮間質轉化增強是引起腫瘤細胞侵襲能力增強的重要原因之一,腫瘤細胞侵襲轉移增強會提高腫瘤周邊轉移風險,N-cadherin、Vimentin在腫瘤細胞侵襲轉移中起正調控作用,而E-cadherin在腫瘤細胞侵襲轉移中起負調控作用。caspase3是細胞凋亡的執行分子,其切割呈活化狀態的分子能不可逆誘導細胞凋亡。有研究[19]顯示miR-125a-3p在腦膠質瘤組織中低表達,其過表達可以促進膠質瘤細胞凋亡并抑制細胞增殖,本研究也呈現出相似趨勢,說明circMAPK4可能通過吸附miR-125a-3p調節U138細胞侵襲和細胞凋亡過程。

綜上所述,circ-MAPK4低表達可降低人神經膠質瘤細胞U138細胞活力、增殖和侵襲能力,促進細胞凋亡,可能與吸附miR-125a-3p作用有關。