GA₃處理影響菠菜性別及其株型發育

張玉蘭 王麗穎 梁藝濤 陳寧 李書粉 高武軍

摘 要：赤霉素（gibberellic acids，GAs）是一種重要的植物激素，但其對菠菜生長發育的影響尚未系統報道.以菠菜亞屬PI647862為材料，研究了外源赤霉素（GA₃）處理后對菠菜的性別轉換、開花時間、花粉活力及植株發育等重要性狀的影響.結果表明，用質量濃度為25 mg/L的GA₃對2葉期菠菜進行處理后，約13%的菠菜雌株轉換為雄株，且轉換株的花粉數目、形態及活力均和對照無顯著差異.但是，轉換雄株的開花時間顯著早于對照雄株.研究結果也表明，GA₃處理后菠菜植株的高度、葉面積及葉柄長度均顯著高于對照植株.進一步分析發現，株高的增加是由于節間細胞縱向伸長所導致的，葉面積的增加是葉細胞面積增加引起的.GA₃可誘導菠菜雌株發生雄性化轉變，促進菠菜早花，同時促使株高、葉面積和葉柄長度也顯著增加.研究結果為全面探究GA₃對于菠菜性別轉換和株型發育的影響奠定了基礎.

關鍵詞：菠菜；GA₃；性別轉換；株型發育

中圖分類號：S636；Q945文獻標志碼：A文章編號：1000-2367（2024）02-0130-09

菠菜，藜科菠菜屬1至2年生雌雄異株植物，群體中雌雄比例接近1∶1^［1-2］.菠菜作為典型的雌雄異株代表植物，其性別決定和分化主要受遺傳調控，但也容易受到外源激素和環境等因素的影響^［3-4］.早期的研究表明，外源施加細胞分裂素、生長素和脫落酸，處理菠菜根部能夠促進菠菜群體中雌株比例的增加；赤霉素則促進菠菜群體中雄性比例的增加^［5］.2018年WEST等^［6］使用赤霉素處理菠菜幼苗發現，一定比例的植株發生了性別轉換，但是沒有明確的證據能夠證明性別轉換的方向.近年來研究人員通過深入分析菠菜雌雄基因組差異，發現了一些重要的性別連鎖分子標記.T11A是一種雄性連鎖的分子標記，其在菠菜雌雄植株中均能擴增出大小為810 bp的條帶，而特異地在雄株中擴增出一條320 bp 的條帶^［7］.SpoX是一個X特異的單核苷酸多態性分子標記^［8］，能夠用于識別菠菜中的YY個體.這些分子標記的發現，為菠菜幼苗早期性別鑒定提供了分子支持.

赤霉素作為一種重要的植物激素，不僅影響植物性別，還參與種子萌發、株型建立、開花結實等多種重要的生長發育過程^［9-12］.已有文獻報道，外源赤霉素處理能增加苦蕎株高^［13］和大豆的莖粗^［14］，對萵筍株高、節間長度和產量也具有促進作用^［15］；赤霉素尤其是GA₄促使水稻節間的伸長使水稻適應水淹^［16］.此外，外源赤霉素處理可以促使擬南芥等多種植物提前開花^［17］.使用赤霉素能促進草莓吐蕾提早開花^［18］；開花前10 d用赤霉素處理可以使“蜂后”葡萄提早開花^［19］.施加赤霉素可誘導植物產生不同的形態和性狀變化，但尚未有人對外源赤霉素處理菠菜發生的表型變化，尤其是對不同性別的菠菜性狀產生的影響進行詳細的數據統計及結果分析.

本研究采用外源赤霉素處理受試菠菜植株，觀察處理前后雌雄性別、開花周期、花粉數目和活性以及菠菜株型如株高、莖節、葉面積等變化情況，用以探究GA₃促進菠菜性別分化和植株生長的組織學基礎，為菠菜進一步的相關研究奠定基礎.

1 材料和方法

1.1 實驗材料

菠菜（Spinacia oleracea L. subsp. Turkestanica，PI647862）種子去殼浸泡于單蒸水中，放置100 r/min，20 ℃的搖床中過夜培養后轉移于培養皿中，4 ℃條件下培養7 d，每天換水2次，生根后移栽到土壤（培養土、蛭石體積比為1∶1）中，并放置在光照培養箱中培養，培養溫度為20 ℃（16 h∶8 h，光暗比），濕度為70% RH，光照為14 400 lx.

1.2 實驗方法

1.2.1 菠菜幼苗早期性別的鑒定

使用超光速mix試劑盒快速提取菠菜幼苗DNA，取少量菠菜葉片進行研磨后加入裂解液并煮沸5 min，12 000 r/min離心，取上清作為模板用T11A引物進行PCR擴增，引物序列為T11A-F，5'-CCCTAATTAACTCCTCTTTACCCAA-3'；T11A-R，5'-TACAAGCCCCATTATCATAACAGTC-3'.

PCR反應總體積為20 μL，包含1 μL模板DNA，10 μL PCR mix，1 μL T11A引物對和8 μL ddH₂O；其擴增程序為：預變性95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進行30個循環，72 ℃ 5 min.最后通過質量分數0.8%瓊脂糖凝膠電泳觀察條帶，確定每株菠菜幼苗的性別并做標記.待植株開花后根據花的結構進一步判斷植株性別，確定T11A標記的可靠性.

1.2.2 菠菜植株的GA₃處理

根據前期的研究結果^［20］，采用25 mg/L GA₃按照表1的處理時期及方式對菠菜進行噴施處理.對照組只噴水，且每個處理重復3次.根據早期性別鑒定及植株開花后性別的比較，統計菠菜性別出現轉換的時期、轉換率及對開花時間的影響.

1.2.3 GA₃處理后性別轉換株花粉活力檢測

在上午10點左右收集處理組雌轉雄株以及對照組雄株中3個成熟的未開裂的花藥收集花粉粒，用于花粉形態、數目和活力的分析.

I₂-KI染色：將收集的花藥，置于1.5 mL EP管中，并向其中加入500 μL I₂-KI染色液，在渦旋儀上短暫震蕩，以釋放花粉粒，離心機中短暫離心，收集花粉粒，吸取適量溶液于載玻片，加上蓋玻片，在光學顯微鏡下觀察.統計花粉的染色率.

Alexander染色：花藥轉于含有少量單蒸水EP管中，在渦旋儀上短暫離心，吸取底部花粉于載玻片上，并在上面滴加一滴Alexander染液，蓋上蓋玻片，之后在顯微鏡下觀察.

1.2.4 GA₃對菠菜株高的影響

土培40 d后，對GA₃處理組及對照組的菠菜植株隨機選取30株進行株高、莖節數量、節間長度測量，從植株基部到最上層葉尖的長度為株高，2個莖節之間的長度為節間長度.并使用GraphPad Prism 5進行數據的處理分析；最后對顯著變化的莖節進行徒手切片，制臨時裝片，在光學顯微鏡下觀察節間細胞；同時將莖節細胞在掃描電鏡下觀察.對植株的莖節使用FAA固定（V_70%乙醇∶V_乙酸∶V_37%甲醛=90∶5∶5），將材料置于固定液中之后抽真空5～10 min，直至材料固定完全.2～6 h之后更換新的FAA固定液，4 ℃過夜.然后分別在50%、70%、80%、90%、100%、100%、100%乙醇中進行梯度脫水，每次20～30 min.轉移到叔丁醇處理20 min，其中5～10 min更換一次新的叔丁醇.最后將材料在液氮中速凍5～10 min之后轉移到真空冷凍干燥機干燥2～3 h，將干燥后的材料進行噴金處理，噴金時電流設為10 mA，每次噴金20 s，間隔1 min之后進行下一次噴金，可處理4～6次.處理好的材料在掃描電鏡下觀察.

1.2.5 GA₃處理對菠菜葉面積、表皮細胞大小及葉柄長度的影響

取處理組和對照組2葉期至10葉期成熟葉片，對表皮細胞進行染色，利用Image J軟件測量葉片的長度、寬度、葉面積和表皮細胞大小，采用軟尺測量葉柄長度，測量數據使用GraphPad Prism 5軟件進行處理分析，實驗重復3次.

2 結果與分析

2.1 菠菜幼苗早期性別的鑒定

為了明確區分開花前菠菜幼苗的性別，使用了雄性特異分子標記T11A進行菠菜幼苗（圖1（a，b））早期性別的鑒定，由（圖1（e））可以看出，僅在810 bp處有一條帶的為雌株，同時有一條320 bp條帶的為雄株，100株菠菜幼苗早期和開花期性別的鑒定結果與植株開花后花器官表現的性別均一致（圖1（c-e）），其中雄株52株，雌株48株，雌雄比例接近1∶1，說明該方法確定的菠菜幼苗早期的性別是可靠的.

2.2 GA₃處理引起菠菜性別轉換時期的確定

表1結果表明，GA₃處理能夠引起菠菜發生雌株轉換為雄株的性別轉換，所有處理的平均轉換率為13.42%，且引起轉換的處理時期為2葉期.說明赤霉素處理菠菜使其性別發生轉換是由性別轉換關鍵期2葉期噴灑導致，而非多次噴灑積累導致.

2.3 GA₃處理對菠菜開花周期的影響

通過統計菠菜的開花時間可以看出，對照組雌（CK Female）和GA₃處理組雌（GA₃Female）的開花時刻差異不顯著，均是在第30 d左右開始開花（圖2（a，b））.而對照組雄（CK Male）和經GA₃處理后由雌株轉換的雄株（female was treated with GA₃and than transformed into male，FGM）的開花時間顯著早于雌花，分別在第26 d和第22 d開花（圖2（c，d）），說明GA₃處理后不僅能引起菠菜雌株的雄性化轉換，也能促進開花.

2.4 GA₃對菠菜花粉活力的影響

為了檢測轉換雄株的花粉形態及功能是否正常，利用I₂-KI和Alexander對花粉染色后發現，相同稀釋比例下，轉換雄株的花粉量和對照雄株基本一致（圖3（a，e））.花粉形態近似球狀，花粉著色較深，說明轉換株的花粉形態正常（圖3（b，f））；其次，根據Alexander染色的結果可以看出，轉換株的花粉約85%被染成深紅色，表明其花粉原生質體具有很好的活力（圖3（c，g））.用轉換株的花粉對正常雌株進行授粉后發現，其平均結實率為80%，和對照組實驗結果差異不顯著（圖3（d，h）），說明赤霉素處理引起的雌株轉換后的雄株花粉具有正常的授粉活性.

2.5 GA₃處理對菠菜株高的影響

從圖4中可看出，GA₃處理后菠菜植株的高度顯著高于對照植株（圖4（a））.為了分析株高的增加是節間數量的增加還是節間長度的增加，統計處理組和對照組節間數量及長度后發現，處理組植株所有節間的長度均出現增加，但是第3、4和第6節間的長度增加達到極顯著水平，其他莖節也呈現增加的趨勢但未存在明顯的統計學差異（圖4（b，c））.進一步通過徒手切片和掃描電鏡觀察顯著增加的第3、4莖節中節間細胞的形態發現，節間的伸長是由節間細胞縱向長度增加所導致的（圖4（d，e））.

2.6 GA₃對菠菜葉面積和表皮細胞大小的影響

葉面積和菠菜產量及質量密切相關，通過對處理組和對照組2葉期至10葉期的成熟葉片的葉面積比較發現，除10葉期的葉片長度和葉面積與對照組無顯著差異外，其余時期的葉片長度和葉面積均顯著大于對照組.其中葉片長度差異最明顯的是2葉期和4葉期，分別是對照組的1.27倍和1.38倍.葉面積差異最明顯的也是2葉期和4葉期，分別是對照組的1.22倍和1.28倍.但處理組葉片的寬度與對照相比差異較?。▓D5（a））.說明GA₃處理促使菠菜葉片長度的增加從而引起葉面積的增大.

對處理組和對照組2葉期和4葉期的表皮細胞進行染色，通過顯微鏡觀察發現，處理組2葉期表皮細胞平均大小為1 914.4 μm²，對照組為1 186.8 μm²，即處理組表皮細胞大小為對照的1.61倍，而處理組4葉期表皮細胞大小為對照組的1.63倍（圖5（e，f））.這說明赤霉素引起菠菜葉面積增加的主要原因是葉細胞大小的增加.

2.7 GA₃對菠菜葉柄長度的影響

葉柄長度是菠菜株型的重要指標之一，通過對2葉期至10葉期的葉柄長度進行比較，結果表明，GA₃處理后，除8葉期和10葉期葉柄長度與對照組無顯著差異外，其余時期葉柄長度均顯著增長（圖6（a））.其中葉柄長度差異最明顯的為2葉期和4葉期，分別為對照組的1.57倍和1.49倍（圖6（b）），說明噴灑赤霉素可以促進菠菜葉柄伸長.

3 討 論

已有研究表明，赤霉素作為一種重要的植物生長調節激素能夠參與植物花器官的形成或性別發育.如毛白楊（Populus tomentosa）雄花中赤霉素相關基因的表達量高于雌花，且比雌花中表達時期要早^［21］，暗示赤霉素具有促進毛白楊雄性化的作用，而用赤霉素抑制劑處理雌雄異株植物番木瓜（Carica papaya）能夠促進雄花的心皮發育^［22］.同樣在雌雄同株異花植物黃瓜花中也發現雄花中內源赤霉素含量比雌花的更高^［23］.這說明赤霉素具有促使單性花雄性化發育的作用.在菠菜性別發育過程中，赤霉素通常被認為是重要的生理調控因子^［24］.從菠菜形成第二對真葉至花序發育期間，對其進行外源GA₃的噴灑處理，結果78%的植株表現為雄株^［5］，證明了赤霉素的雄性化作用.其他相關的菠菜研究中，均從幼苗早期進行外源激素處理，并表明菠菜發育早期階段對其性別分化是關鍵的^{［6，22，25］}，但菠菜群體水平雌雄比例的改變，無法支持在單株水平上進行性別轉換的形態觀察和機制研究.本文建立了菠菜雄性特異標記與雌雄花形態的穩定性關系，最終確定了外源 GA₃誘導菠菜雌株發生性別轉換的時期為2葉期.

赤霉素通過抑制負調控因子DELLA蛋白來調控擬南芥的開花時間，并與其他主要的開花遺傳途徑協同影響開花^［26］.本研究中處理組雌株的開花時間與對照組雌株的開花時間相比無明顯提前，而雌轉雄植株的開花時間則明顯提前，且早于正常的雄株.此結果一方面提示了赤霉素促進開花的作用，另一方面也暗示了菠菜開花時間與性別之間的相關性.此外，研究還發現轉換后雄株的花粉具有與對照組雄株相同的活力和授粉結實能力，說明赤霉素對菠菜的有性生殖尤其是雄性發育具有積極的影響.

株高和葉片大小是決定植物株型的重要參數.由于每株植物的參數不完全相同，導致植物的株型出現多樣性.外源施加GA₃可調節細胞的分裂或伸長，影響植物的節間數目和長度，進而促進植株生長^［27］.葉面噴施GA₃可以促進黃瓜植株莖的伸長和增粗^［28］，用赤霉素處理草莓后其葉柄長度和葉面積均有明顯增加^［18］.我們通過對GA₃處理后的菠菜株型變化如株高、莖節、細胞數目和大小，葉面積、葉片長度和葉柄長度等數據的統計，確定了經GA₃處理，菠菜株高的增加伴隨著節間細胞的縱向伸長，葉面積增加表現為表皮細胞的增大.

4 結 論

外源GA₃處理可誘導菠菜性別發生轉換，且菠菜性別轉換的關鍵期為2葉期，平均性別轉換率約為13.42%.GA₃誘導的雌轉雄植株開花時間比雄株的開花時間提前，二者均早于雌株，且雌轉雄植株與雄株的花粉活性和授粉結實能力相似.GA₃促進植株增高是通過節間細胞伸長導致節間伸長引起的，葉面積的增加是葉細胞增大引起的.

參 考 文 獻

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GA₃treatment affects sex expression and plant architecture in spinach

Zhang Yulan， Wang Liying， Liang Yitao， Chen Ning， Li Shufen， Gao Wujun

（College of Life Sciences， Henan Normal University， Xinxiang 453007， China）

Abstract： Gibberellic acids（GAs） play an important role in plant growth regulation. To explore the effects of GAs on sex expression and plant architecture of spinach， we studied the effects of exogenous GA₃on sex conversion， flowering time， pollen viability， and other key traits of spinach inbred PI647862. After being treated with 25 mg/L GA₃， about 13% of the female spinach plants underwent masculinization， and the pollen morphology and vitality of the converted plants were similar as those of the control males. However， the converted male plants flower significantly earlier than male plants. Additionally， the height， leaf area， and petiole length of spinach plants treated with GA₃were significantly higher than control plants. Further analysis showed that plant height was increased as a result of longitudinal elongation of internode cells， and leaf area increased due to an increase in leaf cells area. 25 mg/L GA₃induced a higher frequency of masculinization conversion in female spinach plants at the two-leaf stage and promoted flowering. The converted males had the same morphology and function as normal males and increased the plant height， leaf area， and petiole length significantly. The results laid the foundation for a comprehensive exploration of the effects of GA₃on sex conversion and plant architecture in spinach.

Keywords： spinach; GA₃; sex conversion; plant architecture

［責任編校 劉洋 楊浦］