不同產地蒙古黃芪的非靶向代謝組學分析

宋詩娟　雷振宏　郭旭　王圓圓　燕翔　牛景萍　趙成萍　梁建萍

摘要：黃芪（Astragalus membranaceus）是一種傳統的道地藥材，藥用歷史悠久，分布范圍廣，不同產地黃芪的藥材品質和療效相差甚遠，次生代謝物的類型和含量是決定藥材品質的物質基礎。為了研究不同產地黃芪次級代謝物的差異，為解析黃芪品質形成提供重要依據，同時為優質黃芪的選育奠定基礎，試驗對來自山西渾源（S2-7）、山西五臺（S2-9）、甘肅和政藥園（S2-10）的3 種蒙古黃芪根進行基于LC-MS/MS 的非靶向代謝組學測定，利用主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）方法進行差異代謝物篩選，并通過KEGG 數據庫進行通路富集分析。結果顯示，共鑒定出674 種代謝產物，分為29 類，主要包括萜類物質、黃酮類物質、苯丙素類物質和生物堿類物質。依據P<0.05、變量投影重要度（VIP）>1 篩選差異代謝物，甘肅黃芪（S2-10）與山西黃芪組（S2-7、S2-9）間篩選出81 種差異代謝物；山西五臺（S2-9）和渾源（S2-7）2 個產地黃芪間篩選出67 種差異代謝物；這些代謝物在含量上存在顯著差異。對通路進行富集分析可知，甘肅黃芪與山西黃芪組富集到3 條差異顯著的代謝通路：異喹啉生物堿生物合成、吲哚生物堿生物合成以及煙酸鹽和煙酰胺代謝通路。綜上可見，不同產地黃芪次級代謝物的類型和含量存在一定差異。

關鍵詞：蒙古黃芪；不同產地；LC-MS/MS；PCA；OPLS-DA；非靶向代謝組學；差異代謝物

中圖分類號：R284文獻標識碼：A文章編號：1002?2481（2024）01?0043?12

黃芪是傳統的大宗中藥材，為豆科植物蒙古黃芪（Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge. var. mon?gholicus（Bge.）Hsiao）或膜莢黃芪（A. membranaceus（Fisch.）Bge.）的干燥根，最早記載于《神農本草經》[1]。黃芪為多年生草本植物[2]，從幼苗到收獲周期為2～5 a，分布范圍廣，主要生長在我國山西、內蒙古、甘肅、陜西、寧夏等省份，具有豐富的遺傳多樣性[3-4]。迄今為止，已從黃芪中鑒定出多種代謝物，包括皂苷、類黃酮、多糖和氨基酸等，其主要生物活性成分為黃酮、皂苷和多糖[2]。更重要的是，黃芪具有止汗、抗利尿、抗腫瘤、抗氧化和抗炎等作用[5-9]，黃芪在中成藥、保健品、化妝品等領域倍受青睞，而其代謝成分是黃芪藥材品質形成的重要物質基礎，因此，開展黃芪代謝組學研究，對于黃芪種質資源鑒定、品質評價、新品種選育、代謝成分體外合成機制極為重要[10]。

代謝組學分析是一種基于高通量技術對整個生物體內小分子代謝物進行研究的方法，能夠檢測生物體代謝物并篩選出顯著差異代謝物，在此基礎上研究相應的代謝通路及其變化機制[11]。近年來代謝組學技術被廣泛應用于中藥材質量控制與品質評價、植物分類、資源鑒定、親緣關系評估以及代謝調控網絡等領域[10]。其中非靶向代謝組學主要通過尋找試驗組和對照組之間的差異代謝產物以及分析代謝途徑與表型之間的關系，從整體反映代謝物的變化，提供更廣泛的代謝物覆蓋，實現不同樣品間代謝特征的比較，有利于發現新的代謝通路[12-14]。WU 等[2]基于UPLC-Q-Orbitrap 方法對蒙古黃芪進行綜合轉錄組和代謝組學分析，共檢測到5 435 種代謝物，闡明苯丙素生物合成、類黃酮生物合成和異黃酮生物合成的完整途徑，發現了新的類黃酮衍生物，并推斷出它們在黃芪中可能的合成途徑。WANG 等[15]利用UHPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS 方法，對蒙古黃芪和膜莢黃芪進行了化學鑒別，共檢測到53 種差異代謝物，初步推斷膜莢黃芪比蒙古黃芪有更強的藥理活性。牛媛婧等[16]通過非靶向代謝組學方法分析不同產地黨參之間的差異，篩選得到72 種差異代謝物，主要代謝通路為苯丙素生物合成。孟益德等[10]利用UPLC-QTOF/MS方法對不同產地杜仲雄花進行了非靶向代謝組學分析，共篩選出45 個顯著差異代謝物，主要參與氨?；鵷RNA 生物合成、類黃酮生物合成、黃酮和黃酮醇生物合成以及ABC 轉運蛋白等代謝途徑。但是運用非靶向代謝組學方法分析不同產地黃芪中代謝物的差異尚未見報道。

本研究基于實驗室前期對來源于8 個省份的80 份不同蒙古黃芪種質資源的聚類分析[17]，選擇分屬2 個亞群遺傳背景差異較大的3 個種質為試驗材料，分別為來自甘肅政藥園的S2-10、來自山西五臺的S2-9 與來自山西渾源的S2-7，采用LC-MS/MS 系統組合型四極桿Orbitrap 質譜技術，結合多元變量模式識別分析，檢索常規數據庫及測定公司自建的中藥材數據庫，從代謝組學的角度探討不同產地蒙古黃芪有效成分積累的差異，旨在為挖掘和選育高品質黃芪資源奠定基礎。

1材料和方法

1.1 試驗材料與儀器

供試材料為3 種位于2 個亞群[17]的不同產地蒙古黃芪，于2018 年采自山西和甘肅，分別記為S2-7（山西省渾源縣）、S2-9（山西省五臺縣）、S2-10（甘肅省和政藥用植物園）。2019 年5 月采用種子直播種植于汾陽市山西農業大學經濟作物研究所黃芪種質資源圃（111°47 ′42.13 ″E，37°14 ′55.90 ″N）內，2020 年11 月選取長勢一致的健康黃芪植株，每個產地3 次重復，剪掉地上莖葉，清理根部表面泥土后帶回實驗室，測量基本生物量后烘干備用。

試驗儀器包括：1290 UPHLC超高效液相（Ameri?can Agilent），Q Exactive Focus 高分辨質譜（Ameri?can Thermo Fisher Scientific），Heraeus Fresco17 離心機（American Thermo Fisher Scientific），BSA124S-CW 電子天平（Germany Sartoriu），JXFSTPRP-24 研磨儀（上海凈信科技有限公司），色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（American Waters），明澈D24 UV 純水儀（Merck Millipore），YM-080S超聲儀（深圳方奧微電子有限公司），乙腈、甲酸、甲醇（色譜純，CNW Technologies，Germany），L-2-氯苯丙氨酸（分析純，上海恒柏生物科技有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 代謝物提取

將3 個產地的黃芪根樣品進行研磨（60 Hz，1 min）；稱取100 mg 樣本，加2 個小鋼珠，加入500 μL 提取液（甲醇∶水=4∶1）；渦旋30 s 后45 Hz/240 s 研磨，冰水浴超聲1 h；-40 ℃靜置1 h 后將樣本4 ℃，12 000 r/min（離心力13 800×g，半徑8.6 cm）離心15 min；取出上清過0.22 μm 濾膜至進樣瓶中上機檢測；所有樣本取30 μL 上清混合成QC 樣本上機。

1.2.2 色譜條件

采用Waters 的UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），柱溫45 ℃，流速0.4 mL/min，進樣體積為5 μL。流動相A 是水（含0.1% 甲酸），B 是乙腈（含0.1% 甲酸），梯度洗脫條件為0～3.5 min，95%～85%A；3.5～6.0 min，85%～70%A；6.0～6.5 min，70%～70%A；6.5～12.0 min，70%～30%A；12.0～12.5 min，30%～30%A；12.5～18.0 min，30%～0%A；18.0～25.0 min，0%～0%A ；25.0～26.0 min ，0%～95%A ；26.0～30.0 min，95%～95%A。

1.2.3 質譜條件

利用Q Exactive Focus 質譜儀，在控制軟件（Xcalibur，Thermo Fisher Scientific）控制下，采用FullScan-ddMS2 功能進行一級和二級質譜數據的采集。詳細參數如下：鞘氣流量為45 L/min；輔助氣體流量為15 L/min；毛細管溫度為400 ℃；總質譜分辨率為70 000；二級質譜分辨率為17 500；碰撞能量為15 eV/30 eV/45 eV（負離子模式），噴淋電壓為4.0 kV（正離子）或-3.6 kV（負離子）。

1.3 數據處理

將質譜原始數據導入XCMS 軟件，進行保留時間校正、峰鑒定、峰提取、峰積分、峰對齊等，采用派森諾公司自建中藥數據庫及相應匹配方法對含有二級質譜數據的峰進行鑒定。采用主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）等多元統計分析來區分組間代謝的總體差異，篩選差異代謝物。利用MetaboAnalyst 軟件依據KEGG數據庫對差異代謝物進行途徑富集分析，以獲得代謝途徑富集結果，利用Matlab 繪制火柴桿圖。

2結果與分析

2.1 不同產地黃芪的非靶向代謝組學分析

依據來源，將S2-7 和S2-9 分為山西省黃芪資源（SXZY）組，S2-10 為甘肅省黃芪資源組。為深入了解不同產地黃芪之間藥用品質的差異，對3 種不同產地黃芪進行了LC-MS/MS 非靶向代謝組學測定，得到總離子流圖（圖1）。如圖1 所示，正負離子模式下的TIC 重疊度均較高，所檢測到物質峰都比較豐富，且3 種不同種質黃芪總離子流圖變化趨勢存在差異，如保留時間在4～12 min，不同種質出現的峰對應的物質種類和相對含量明顯不同，此研究結果為后續統計學分析差異性代謝物奠定基礎。LC-MS/MS 原始數據預處理后，采用測定公司自建中藥數據庫進行檢索匹配，共檢測出674 種代謝物，分為29 類，其中，萜類物質最多，為199 種；黃酮類物質位居第2，有119 種；苯丙素類物質位居第3，有61 種（表1）。

2.2 不同產地黃芪的代謝物判別分析

為理清S2-7、S2-9 和S2-10 之間化學成分的不同，采用多元統計法對其代謝物進行分析。首先利用SIMCA 軟件將處理后的質譜數據進行PCA分析，觀察各樣本間的總體分布和整個分析過程的穩定性，得到3 種不同產地黃芪的PCA 得分圖（圖2）。由圖2 可知，3 種不同產地黃芪的數據點在得分圖上可以明顯區分，S2-10 位于第1、4 象限，S2-7位于第3 象限，S2-9 位于第2 象限，表明3 種不同產地黃芪樣品中的代謝物存在明顯差異。

將3 種不同產地黃芪分為3 組S2-9 vs S2-7、S2-10 vs S2-7、S2-10 vs S2-9；同時，將甘肅省黃芪與山西省黃芪進行比較，分為S2-10 vs SXZY組。采用OPLS-DA 進一步對S2-9 vs S2-7、S2-10 vs S2-7、S2-10 vs S2-9 和S2-10 vs SXZY 4 組數據進行分析，由圖3-A-D 可知，4 組樣品分布在置信區間的左右兩側，判別效果明顯，顯示了4 組數據之間的顯著差異。對4 組模型進行置換驗證，由圖3-E-G 可知，置換檢驗隨機模型的Q2 值均小于原模型的Q2 值，圖3-H 的置換檢驗隨機模型的Q2值不小于原模型的Q2 值，但與縱軸負半軸相交，模型成立。綜上表明，這4 組原始模型具有良好的穩定性，不存在過擬合現象，可用于進一步篩選差異代謝物。

2.3 不同產地黃芪的差異代謝物篩選與鑒別

2.3.1 甘肅與山西黃芪的差異代謝物篩選與鑒別

采用多維分析和單維分析相結合的方法，依據Student?s t-test 的P<0.05，且OPLS-DA 的VIP>1 篩選組間差異代謝物。由圖4 可知，甘肅省黃芪（S2-10）與山西省黃芪（SXZY）共檢測到81 種差異代謝物，其中，43 種代謝物在S2-10 中豐度高，38 種代謝物在SXZY 組中豐度高。進一步對差異代謝物的log2（FC）值進行排序，篩選上調和下調前15 種代謝物（圖5），在甘肅黃芪中上調幅度前15 的差異代謝物包含：萜類4 種，生物堿、黃酮類、苯丙素類均為2 種，三萜類、有機酸及其衍生物、氨基酸衍生物、酚類和其他類物質均為1 種；下調幅度前15 的差異代謝物有2 種萜類，2 種氨基酸衍生物，2 種黃酮類，苯丙素類、環烯醚萜類、糖類多酮類、糖類及其衍生物、有機氧化合物均為1 種，以及4 種其他類物質。

綜上可見，S2-10 與SXZY 的主要差異代謝物為萜類、黃酮類和苯丙素類物質，其中，差異倍數最大的代謝物為萜類物質Oleanane-2H，+1O，1COOH，O-HexA-HexA，其差異倍數為115 倍，這些差異代謝物與甘肅和山西黃芪之間的藥材品質差異有關。

2.3.2 五臺與渾源黃芪的差異代謝物篩選與鑒別

為闡明五臺黃芪（S2-9）和渾源黃芪（S2-7）之間的藥材品質差異，同2.3.1 對S2-9 和S2-7 進行組間分析，根據VIP 值和P 值（VIP>1，P<0.05）篩選到67 種差異代謝物，其中，32 種代謝物在S2-9 中豐度高，35 種代謝物在S2-7 中豐度高（圖6）。進一步對差異代謝物的log2（FC）值排序，列出差異倍數前15（上調和下調）的代謝物（圖7），S2-9 與S2-7相比，上調的差異代謝物有4 種黃酮類，3 種苯丙素類，2 種生物堿，萜類、酚酸類、異戊烯醇脂類、蒽醌類均為1 種，其他類物質2 種；下調的差異代謝物有11 種萜類，脂肪酸類、酯類、異戊烯醇脂類和其他類物質均為1 種。

綜上可見，S2-9 的多數黃酮類、苯丙素類和生物堿類物質高于S2-7（1≤log2FC≤3），S2-7 的多數萜類物質高于S2-9（1≤-log2FC≤3），這些代謝物的差異可能是山西五臺與渾源黃芪藥材品質差異的物質基礎。

2.4 差異代謝物通路分析

分別將S2-10 vs SXZY 組的81 個差異代謝物及S2-9 vs S2-7 組的67 個差異代謝物在KEGG 數據庫映射后得到的通路進行富集分析[18] （圖8），S2-10 vs SXZY 組共富集到8 條通路，有3 條差異顯著的通路（P<0.05），分別是異喹啉生物堿生物合成、吲哚生物堿生物合成和煙酸鹽和煙酰胺代謝，其差異代謝物為多巴胺、色胺和煙酸，且都作用于植物抗逆性與生長調節，推測與不同產地的氣候條件和土壤條件相關；S2-9 vs S2-7 組富集到8 條通路，無差異顯著通路，說明山西省內兩組黃芪種質在種源上差異不大，可能與早期各地引種導致種質混雜有關[19]，綜上可見，來源于不同省份的黃芪親緣關系較遠。

3結論與討論

本研究基于液相色譜-串聯質譜技術對3 種不同產地黃芪進行了非靶向代謝組學分析，共檢測出674 種代謝物，分為29 類，3 個產地的黃芪均含有較多的萜類、黃酮類和苯丙素類化合物。隨后對質譜數據進行PCA 分析，發現3 個種質可以明顯區分，由于PCA 是一種無監督的分析方法，環境和系統誤差都會對結果造成影響。為排除因試驗無關的某些因素引起的代謝變化，同時理清不同種質兩兩之間的對比，將3 個種質分為4 組，進行可以過濾掉代謝物中與分類變量不相關的正交變量，并對非正交變量和正交變量分別分析的OPLS-DA 分析[21]，4 組數據皆區分明顯，且數據穩定。綜合2 種分析方法表明，不同產地黃芪的代謝物在類型和含量上具有一定的差異。

甘肅黃芪（S2-10）與山西黃芪（S2-9、S2-7）組比較，共篩選出81 種差異代謝物；進一步篩選差異前15 的代謝物，發現甘肅黃芪與山西黃芪的主要差異代謝物為萜類、黃酮類和苯丙素類物質。戴瑜婷等[22]研究表明，不同產地黃芪的總皂苷、總黃酮、總多糖的含量也不同，可以作為黃芪質量標志物預測分析指標。本研究中上調第一的萜類物質Oleanane-2H， +1O， 1COOH， O-HexA-HexA 主要存在于S2-10 中，通過Mass Bank 檢索發現，Oleanane-2H， +1O， 1COOH， O-HexA-HexA 是一種三萜皂苷類物質，可進一步對該物質進行探索，以期找到可鑒別甘肅黃芪（S2-10）與山西黃芪（S2-7、S2-9）的潛在標志性物質，為甘肅黃芪的應用奠定基礎。山西省內兩產區五臺與渾源黃芪組，共篩選出67 種差異代謝物，進一步發現五臺黃芪（S2-9）中黃酮類、苯丙素類和生物堿類成分顯著高于渾源黃芪（S2-7），而渾源黃芪中的萜類成分顯著高于五臺黃芪。表明即使是山西產黃芪，因分布區地理位置、土壤、溫度等生態條件不同，也會影響黃芪體內代謝物的合成。但本研究中根據差異倍數，沒有發現可作為區分渾源黃芪（S2-7）與五臺黃芪（S2-9）的特征代謝物，后續可重復試驗進一步驗證，以期為區分不同道地產區黃芪提供思路。

對差異代謝物進行富集通路分析，S2-10 vsSXZY 組富集到3 條差異顯著通路，其中，異喹啉生物堿生物合成為最主要的代謝途徑，該通路從2 種酪氨酸衍生物的縮合開始，經一系列反應形成反式心果堿，并伴隨產生多巴胺等物質。研究發現，該通路富集分析中多巴胺含量上調，推測反式心果堿含量也相應增加，而反式心果堿是大部分生物堿的前體物質[23]，因而甘肅黃芪（S2-10）的生物堿類物質合成隨之增多，這與通路富集分析結果一致。生物堿是一類應對生境脅迫的次生代謝產物，具有防御作用[24]，與生境脅迫耐受性相關。另外，在煙酸鹽和煙酰胺代謝通路中，煙酸含量上調，推測煙酰胺含量也得到提高，而煙酰胺與植物抗逆相關，是真核生物對逆境反應應答而產生的一種信號物質[25]。由上分析，來源于不同省份的黃芪親緣關系較遠。同時，甘肅黃芪（S2-10）生物堿類物質含量較多，可能與其應對生境變化而提高抗逆性密不可分，后續可將本研究結果進一步應用于黃芪抗逆性等研究。

綜上可見，甘肅與山西黃芪具有較遠的親緣關系，與實驗室前期對80 份不同黃芪種質的遺傳多樣性研究結果一致[17]，說明利用非靶向代謝組學分析不同種質黃芪方法可行；而山西五臺與渾源黃芪的親緣關系較近，但在代謝物上也存在差異，可進一步研究應用于臨床藥理藥效分析。但本研究中甘肅、山西五臺和渾源黃芪均引種到山西汾陽，不排除生境改變引起的差異，仍需收集大量樣品進行試驗。

本研究采用非靶向代謝組學技術，從PCA、OPLS-DA 等多元統計分析、差異代謝通路KEGG富集分析等方面進行了系統研究，發現不同產地黃芪次級代謝物存在差異。同時，富集通路分析發現，S2-10 vs SXZY 組富集到3 條差異顯著通路，而S2-9 vs S2-7 組沒有差異顯著通路，進一步證明不同省份黃芪之間親緣關系較遠，該研究為評價不同產地黃芪品質提供新思路，并且環境因素對植物代謝產物的影響值得進一步深入研究。

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