蓮草直胸跳甲短神經肽F 受體基因sNPFR的克隆及表達分析

王康　趙雪瑩　霍楠　胡軍　王苑馨　楊軍　賈棟

摘要：為明確蓮草直胸跳甲（Agasicles hygrophila）短神經肽F 受體AhsNPFR 功能及其表達特點，為探索蓮草直胸跳甲生防作用奠定理論基礎，利用PCR 技術克隆鑒定蓮草直胸跳甲AhsNPFR 基因并進行生物信息學分析，通過實時熒光定量PCR 技術分析其在蓮草直胸跳甲不同發育時期和組織中的時空表達譜。結果表明，克隆獲得基因AhsNPFR 全長1 669 bp，開放閱讀框1 257 bp，編碼418 個氨基酸；預測其蛋白質分子質量為48.11 ku，理論等電點為8.21，AhsNPFR 具有7 個典型保守跨膜結構域，屬于GPCRs 家族，系統進化樹分析表明，其與玉米根螢葉甲Diabrotica virgifera virgifera sNPFR 親緣關系最近。AhsNPFR 基因在不同發育階段均有表達，在1 齡幼蟲中的表達量最高，是卵中表達量的9.06 倍；在卵中表達量最低；雌成蟲的表達量顯著高于雄成蟲。AhsN ?PFR 基因在不同組織中均有表達，在3 齡幼蟲后腸中顯著高表達，是脂肪體表達量的12.21 倍；在雌雄成蟲后腸顯著高表達，并在所有組織中均沒有雌雄表達差異。

關鍵詞：蓮草直胸跳甲；短神經肽F 受體基因sNPFR；基因克??；發育時期表達；組織表達

中圖分類號：S476.2文獻標識碼：A 文章編號：1002?2481（2024）01?0137?08

神經肽是一類重要的信號分子，在昆蟲的生長發育、繁殖和行為等多種生物學過程中發揮重要調節作用[1]。昆蟲神經肽作為配體通過與同源的G 蛋白偶聯受體（G protein-coupled receptors，GPCRs）相互作用介導其生物學功能[2]。短神經肽F（shortneuropeptide F，sNPF）是最初通過神經肽F（neuro?peptide F，NPF）C 末端抗體在馬鈴薯甲蟲Leptino?tarsa decemlineata 和沙漠蝗蟲Schistocerca gregaria中鑒定得到的一類NPF 短肽[3-4]，這些NPF 短肽僅由8～10 個氨基酸組成，而不是無脊椎動物NPF 典型的36～40 個氨基酸[5]，基于其羧基末端的RLRF酰胺序列類似于無脊椎動物的NPF 的RPRF 基序[6]，因此，命名為sNPF。

與大多數神經肽信號系統相同，sNPF 也是通過激活其特異性短神經肽F 受體（short neuropep?tide F receptor，sNPFR），進而引發細胞信號傳導機制發揮系列功能[7]。sNPFR 首次在黑腹果蠅中發現[8]，隨后在紅火蟻Solenopsis invicta 和岡比亞按蚊Anopheles gambiae 中相繼克隆出來[9-10]。sNPF 信號系統在昆蟲的晝夜節律[11]、生長發育[12]、寄主定位[13-14]、取食等生理過程中發揮重要作用，尤其在昆蟲取食中的調控作用引起相關研究者的廣泛關注。在黑腹果蠅Drosophila melanogaster 中，DmsNPF及其受體DmsNPFR 的表達能促進取食量增加及體型增大，相反RNA 干擾二者的功能后果蠅的取食量減少且體型變小[15-16]。華山松大小蠹Dendrocto?nus armandi 中敲除DasNPF 及其受體DasNPFR后，幼蟲和雌雄成蟲的取食量均減少[17]。與上述昆蟲相反，在沙漠飛蝗S. gregaria 中，SgsNPF 及其受體SgsNPFR 的敲除反而會導致取食量增加[18-19]。大量研究表明，昆蟲頭部和腸道是sNPFR 的主要表達部位，但在其他組織部位如中樞神經系統（cen?tral nervous system，CNS）、觸角、脂肪體、馬氏管等也都有表達[10，17，20]，關于sNPFR 的表達部位目前還沒有明確結論。

蓮草直胸跳甲Agasicles hygrophila 是世界惡性雜草喜旱蓮子草Alternanthera philoxeroides 的專食性天敵昆蟲[21-23]。本研究擬基于神經肽sNPF信號系統與昆蟲的寄主定位及取食密切相關的特性，克隆鑒定蓮草直胸跳甲sNPF 信號系統的sNPFR 基因，檢測其在不同發育階段及組織的表達模式，旨在為后續深入研究蓮草直胸跳甲專一性定位寄主與取食的分子調控機制提供理論基礎。

1材料和方法

1.1 試驗材料

供試蓮草直胸跳甲采自華南農業大學，后飼養于山西農業大學生物安全與生物防治實驗室養蟲室。飼養條件為：溫度（25±1）℃ ，相對濕度為85%±5%，光周期14L∶10D。幼蟲飼養于玻璃培養皿（直徑15 cm，高2.5 cm），成蟲飼養于養蟲罐（直徑12 cm，高17 cm）。

喜旱蓮子草采自浙江省玉環縣，現種植于太谷區山西農業大學生物安全與生物防治基地。

1.2 試驗方法

1.2.1 昆蟲樣品收集

基因克隆樣品為蓮草直胸跳甲不同發育階段的混合樣本。各發育階段的取樣分別為：1 日齡卵，1 日齡的1、2、3 齡幼蟲，1 日齡蛹和雌雄成蟲。其中，3 齡幼蟲組織的取樣為：頭、前腸、中腸、后腸、馬氏管、脂肪體；雌雄成蟲取樣為：觸角、頭、前腸、中腸、后腸、馬氏管、脂肪體。以上樣本均3 次生物學重復，液氮速凍，-80 ℃冰箱保存備用。

1.2.2 RNA 的提取與cDNA 合成

總RNA 使用Trizol 試劑（TaKaRa，大連）提取，通過超微量蛋白核酸分析儀（BioDrop，Cambridge，UK）測定濃度，1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測質量。以1 μg RNA 為模板，采用HiScript? Ⅲ 1stStrand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）試劑盒（Vazyme，南京）的步驟合成cDNA 第1 鏈，-20 ℃備用。

1.2.3 AhsNPFR 的克隆鑒定與序列分析

基于課題組的蓮草直胸跳甲轉錄組數據[24]，利用Primer5.0 設計目的基因的擴增引物（表1），以1.2.2 合成cDNA 為模板，利用Phanta? Max Super-FidelityDNA Polymerase 試劑盒（Vazyme，南京）進行PCR擴增。PCR 反應體系為：2×Phanta Max Buffer10 μL，引物AhsNPFR-F/AhsNPFR-R 各0.8 μL，1 ? cDNA 1 μL，Phanta MAX Super-Fidelity DNApolymerase 0.5 μL，dNTP Mix 0.4 μL，加ddH2O 至20 μL。PCR反應條件為：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性15 s，48 ℃退火15 s，72 ℃延伸2 min，35 個循環；徹底延伸5 min。PCR 產物用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，通過M5 Gel Extraction Kit（Mei5bio，Beijing，China）進行回收，連接于pEASY?-Blunt3 CloningVector（Trans Gen Biotech，北京），轉入TOP10 感受態細胞（ANGYUBIO，上海），菌液送上海生工生物工程有限公司測序。

利用NCBI ORF（Open Reading Frame）（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder）預測AhsNPFR 基因的開放閱讀框，DNAMAN 進行多序列比對，ExPASy-ProtParam（http：//web. expasy. org/prot?param/）預測等電點及蛋白質分子量大小，DeepT?MHMM（https：//dtu. biolib. com/DeepTMHMM）預測跨膜結構域，InterPro（https：//www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence/）預測保守結構域與蛋白家族。通過MEGA 7.0 采用鄰接法構建系統發育樹，重復1 000 次。

1.2.4 AhsNPFR 基因的表達模式分析

以1.2.2合成cDNA 為qPCR 模板，通過BeaconDesign 7.0設計AhsNPFR 特異性引物，以18S 核糖體蛋白（RPS18）[25]作為不同發育階段和不同組織處理的內參基因進行實時熒光定量PCR（表1）。qPCR 所使用的儀器為ABI7500（Applied Biosystems，Fos?ter City，CA，USA）。反應體系為：2?ChamQ Uni?versal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，上下游引物各0.8 μL，10 ? cDNA 1 μL，加ddH2O 至20 μL。qPCR 反應條件為：95 ℃ 預變性3 min；95 ℃ 變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40 個循環。不同發育階段和各組織樣品分別設置3 次生物學重復和3 次技術重復。

1.3 數據分析

qPCR 相對表達量數據采用2-ΔΔCt[26]法進行分析，使用SPSS 26.0 軟件進行單因素方差分析（one-way ANOVA），Tukey?s HSD 進行多重比較差異分析，差異顯著性標準為P<0.05。所得結果采用平均值± 標準誤表示，柱狀圖均由GraphPadPrism 8 繪制。

2結果與分析

2.1 AhsNPFR 基因克隆鑒定

克隆獲得了1 個短神經肽受體基因，產物經1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到與預期長度一致的目的片段（圖1），其開放閱讀框ORF 長1 257 bp，編碼418 個氨基酸（圖2），命名為AhsNPFR（Gen?Bank 登錄號為OQ550102）。

2.2 序列與系統發育分析

蓮草直胸跳甲AhsNPFR 蛋白質分子質量為48.11 ku，等電點（pI）為8.21；結構域預測顯示，在38—297 位氨基酸殘基之間具有GPCRs 家族的保守結構域，屬于GPCRs 家族；多序列比對結果（圖3）顯示，蓮草直胸跳甲AhsNPFR 氨基酸序列與其他5 種鞘翅目昆蟲的sNPFR 序列相似性最高，為72.15%～87.22%，其中，與玉米根螢葉甲Di?abrotica virgifera virgifera 相似性最高（87.22%），與鱗翅目昆蟲家蠶Bombyx mori 相似性次之（52.34%），與雙翅目昆蟲黑腹果蠅D. melanogaster相似性最低（38.83%）。根據與其他昆蟲sNPFR共有的7 個典型保守跨膜結構域，克隆序列應該為AhsNPFR 基因。

將蓮草直胸跳甲sNPFR 氨基酸序列與鞘翅目、鱗翅目、雙翅目和半翅目等其他26 種昆蟲進行多序列比對，構建系統發育樹，結果如圖4 所示，蓮草直胸跳甲AhsNPFR 與其他鞘翅目昆蟲聚為一支；其中與玉米根螢葉甲DvsNPFR、光肩星天牛AgsNPFR 和馬鈴薯甲蟲LdsNPFR 親緣關系較近；其他目昆蟲也能分別聚類，符合分類學關系。

2.3 AhsNPFR 基因在蓮草直胸跳甲不同發育階段的表達模式

通過qPCR 分析了AhsNPFR 基因在蓮草直胸跳甲不同發育階段內的表達水平。結果表明，AhsNPFR 基因在蓮草直胸跳甲各發育階段均有表達，其中幼蟲期（1～3 齡幼蟲）和成蟲期（雌雄成蟲）的表達量均顯著高于卵期和蛹期（P<0.05），1、3 齡幼蟲表達量顯著高于2 齡幼蟲，雌成蟲表達量顯著高于雄成蟲（P<0.05）。AhsNPFR 在1～3 齡幼蟲、蛹、雌、雄成蟲的相對表達量分別是卵期AhsNPFR表達量的9.05 倍、6.16 倍、8.03 倍、3.20 倍、8.84 倍和5.55 倍（圖5）。

2.4 AhsNPFR 基因在蓮草直胸跳甲不同組織的表達模式

通過qPCR 分析了AhsNPFR 基因在蓮草直胸跳甲3 齡幼蟲不同組織的表達水平，結果表明（圖6），AhsNPFR 基因在3 齡幼蟲各組織均有表達，其中后腸的表達量最高，顯著高于其他組織，是脂肪體表達量的12.21 倍（P<0.05）；在頭、前腸、中腸和馬氏管的表達量間沒有顯著差異（P>0.05）；在脂肪體的表達量最低。

通過qPCR 分析了AhsNPFR 基因在蓮草直胸跳甲雌雄成蟲不同組織的表達水平，結果表明（圖7），AhsNPFR 基因在蓮草直胸跳甲雌雄成蟲各個組織均有表達，且表達模式相似，后腸的表達量均顯著高于其他組織（P<0.05）；觸角、頭、前腸、中腸、馬氏管、脂肪體的表達量沒有顯著差異，雌雄成蟲相同組織中表達量差異不顯著（P>0.05）。

3結論與討論

本研究克隆了蓮草直胸跳甲sNPFR 基因全長序列，其開放閱讀框編碼418 個氨基酸殘基，具有GPCRs 家族的保守結構域。目前，已鑒定的節肢動物短神經肽受體sNPFR 均屬于GPCRs 家族[18]，主要典型特征為含有7 個跨膜結構域。本研究結果顯示，蓮草直胸跳甲AhsNPFR 也含有7 個跨膜結構域，并且與其它昆蟲sNPFR 的保守結構域高度保守。系統發育分析也表明該基因可用于物種的進化關系研究。

蓮草直胸跳甲AhsNPFR 基因在幼蟲和成蟲期的表達量顯著高于卵和蛹期，1 齡幼蟲表達量最高。有研究表明，在豌豆蚜Acyrthosiphon pisum 中，ApsNPFR 在若蟲和成蟲中都有表達，且1 齡若蟲表達量最高，敲除ApsNPFR 后，刺探電位圖譜（EPG）結果顯示，豌豆蚜A. pisum 刺吸植物的次數和刺吸時間顯著減少[27]。在黑腹果蠅中，DmsNPFR的過表達導致取食量增加[16]。由此可見，sNPFR 在調控昆蟲取食中發揮重要功能作用，蓮草直胸跳甲是喜旱蓮子草的專食性天敵昆蟲，我們推測，AhsNPFR 也可能與蓮草直胸跳甲取食密切相關，但其功能還需后續基因干擾及行為試驗驗證。另外發現，蓮草直胸跳甲雌成蟲AhsNPFR 表達量顯著高于雄成蟲，相關結果在其它文獻未見報道，推測可能為蓮草直胸跳甲雌成蟲取食量高于雄成蟲的重要分子基礎。

AhsNPFR 基因在蓮草直胸跳甲3 齡幼蟲和雌雄成蟲后腸中顯著高表達。有研究表明，在華山松大小蠹D. armandi 中，DasNPFR 基因在頭和中腸組織中顯著高表達，功能驗證表明其主要與取食相關[17]。在橘小實蠅Bactrocera dorsalis 中，BdsN ?PFR 在觸角和中樞神經系統顯著高表達，通過CRISPR/Cas9 敲除BdsNPFR，發現該蟲定位寄主能力變弱；EAG 反應中，對3 種氣味物質的電生理反應均顯著降低[28]。家蠶B. mori sNPF 的3 個同源受體（BNGR-A7、BNGR-A10 和BNGR?A11）在不同組織中表達模式不同，其中BNGR?A7 僅在成蟲頭部高表達，BNGR?A10 在幼蟲和蛹的馬氏管中高表達，而在成蟲馬氏管中表達量較低，BNGRA11在幼蟲和成蟲的馬氏管、中腸和精巢中表達量較高，而在蛹期的卵巢中相對表達量較高[20]。由此可見，短神經肽受體sNPFR 在不同昆蟲的調控模式可能不同。本研究中檢測了AhsNPFR 基因在蓮草直胸跳甲觸角、頭、前腸、中腸、后腸、馬氏管和脂肪體的表達情況，但仍有不足。有文獻報道，sN ?PFR 在昆蟲中樞神經系統中顯著高表達[27]，由于技術原因，沒有檢測AhsNPFR 在中樞神經系統CNS中的表達情況。

本研究克隆鑒定了蓮草直胸跳甲AhsNPFR 基因，明確了AhsNPFR 基因在蓮草直胸跳甲不同發育時期和不同組織的表達模式，為進一步解析短神經肽受體AhsNPFR 調控蓮草直胸跳甲的取食調控機制奠定依據，也為蓮草直胸跳甲生防世界惡性雜草喜旱蓮子草提供一些新的思路。

參考文獻：

［1］ ALTSTEIN M，N?SSEL D R. Neuropeptide signaling in in?sects[J]. Advances in Experimental Medicine and Biology，2010，692：155-165.

［2］ HEWES R S，TAGHERT P H. Neuropeptides and neuropep?tide receptors in the Drosophila melanogaster genome[J]. Ge?nome Research，2001，11（6）：1126-1142.

［3］ SPITTAELS K，VERHAERT P，SHAW C，et al. Insect neu?ropeptide F（NPF）-related peptides：isolation from Colorado po?tato beetle（Leptinotarsa decemlineata） brain[J]. Insect Biochem?istry and Molecular Biology，1996，26（4）：375-382.

［4］ SCHOOFS L，CLYNEN E，CERSTIAENS A，et al. Newlydiscovered functions for some myotropic neuropeptides in locusts[J]. Peptides，2001，22（2）：219-227.

［5］ N?SSEL D R，WEGENER C. A comparative review of shortand long neuropeptide F signaling in invertebrates：any similari?ties to vertebrate neuropeptide Y signaling？ [J]. Peptides，2011，32（6）：1335-1355.

［6］ MAULE A G，SHAW C，HALTON D W，et al. NeuropeptideF（Moniezia expansa）：localization and characterization usingspecific antisera[J]. Parasitology，1992，105（ Pt 3）：505-512.

［7］ 栗洪飛. 短神經肽F 受體（sNPFR）參與調控桔小實蠅覓食和取食行為[D]. 重慶：西南大學，2022.

LI HF. The short neuropeptide F receptor（sNPFR）involved inregulating foraging and feeding behaviors in the oriental fruit flyBactrocera dorsalis（Hendel）[D]. Chongqing：Southwest Univer?sity，2022.

［8］ MERTENS I，MEEUSEN T，HUYBRECHTS R，et al. Char?acterization of the short neuropeptide F receptor from Dro?sophila melanogaster[J]. Biochemical and Biophysical ResearchCommunications，2002，297（5）：1140-1148.

［9］ GARCZYNSKI S F，CRIM J W，BROWN M R. Characteriza?tion and expression of the short neuropeptide F receptor in theAfrican malaria mosquito，Anopheles gambiae[J]. Peptides，2007，28（1）：109-118.

［10］ CHEN M E，PIETRANTONIO P V. The short neuropeptideF-like receptor from the red imported fire ant，Solenopsis in?victa Buren（Hymenoptera：Formicidae）[J]. Archives of InsectBiochemistry and Physiology，2006，61（4）：195-208.

［11］ JOHARD H A D，YOISHII T，DIRCKSEN H，et al. Peptider?gic clock neurons in Drosophila：ion transport peptide and shortneuropeptide F in subsets of dorsal and ventral lateral neurons[J]. The Journal of Comparative Neurology，2009，516（1）：59-73.

［12］ 李梅梅. 黏蟲種群遺傳結構與神經肽F 及其受體基因功能研究[D]. 楊凌：西北農林科技大學，2022.

LI M M. Study on genetic structure and neuropeptide F and itsreceptor gene function of armyworm population[D]. Yangling：Northwest A & F University，2022.

［13］ JIANG H B，GUI S H，XU L，et al. The short neuropeptide Fmodulates olfactory sensitivity of Bactrocera dorsalis upon star?vation[J]. Journal of Insect Physiology，2017，99：78-85.

［14］ ROOT C M，KO K I，JAFARI A，et al. Presynaptic facilita?tion by neuropeptide signaling mediates odor-driven food search[J]. Cell，2011，145（1）：133-144.

［15］ LEE K S，YOU K H，CHOO J K，et al. Drosophila short neu?ropeptide F regulates food intake and body size[J]. Journal ofBiological Chemistry，2004，279（49）：50781-50789.

［16］ LEE K S，KWON O Y，LEE J H，et al. Drosophila short neu?ropeptide F signalling regulates growth by ERK-mediated insu?lin signalling[J]. Nature Cell Biology，2008，10：468-475.

［17］ LIU B，FU D Y，NING H，et al. Identification of the short neu?ropeptide F and short neuropeptide F receptor genes and theirroles of food intake in Dendroctonus armandi[J]. Insects，2021，12（9）：844.

［18］ DILLEN S，ZELS S，VERLINDEN H，et al. Functional char?acterization of the short neuropeptide F receptor in the desertlocust，Schistocerca gregaria[J]. PLoS One，2013，8（1）：e53604.

［19］ DILLEN S，VERDONCK R，ZELS S，et al. Identification ofthe short neuropeptide F precursor in the desert locust：evi?dence for an inhibitory role of sNPF in the control of feeding[J].Peptides，2014，53：134-139.

［20］ MA Q，CAO Z，YU Y N，et al. Bombyx neuropeptide Gprotein-coupled receptor A7 is the third cognate receptor forshort neuropeptide F from silkworm[J]. The Journal of Biologi?cal Chemistry，2017，292（50）：20599-20612.

［21］ 賈棟，趙龍龍，王森，等. 蓮草直胸跳甲Hsp70 蛋白的生物信息學分析[J]. 山西農業科學，2015，43（4）：397-400.

JIA D，ZHAO L L，WANG S，et al. Bioinformatic analysis ofAgasicles hygrophila Hsp70[J]. Journal of Shanxi AgriculturalSciences，2015，43（4）：397-400.

［22］ 馬瑞燕. 空心蓮子草天敵：蓮草直胸跳甲引進中國后的生態適應性研究[D]. 北京：中國農業科學院，2001.

MA R Y. Ecological adaptation of the introduced biocontrolagent，Agasicles hygrophila，for alligatorweed，Alternantheraphiloxeroides，in china[D]. Beijing：Chinese Academy of Agri?cultural Sciences，2001.

［23］ 余國梁，李政，李健，等. 喜旱蓮子草生物防治研究進展[J]. 湖南生態科學學報，2020，7（4）：62-67.

YU G L，LI Z，LI J，et al. Research progress on biological con?trol of Alternanthera philoxeroides[J]. Journal of Hunan Eco?logical Science，2020，7（4）：62-67.

［24］ JIA D，WANG Y X，LIU Y H，et al. SMRT sequencing offull-length transcriptome of flea beetle Agasicles hygrophila（Selman and Vogt）[J]. Scientific Reports，2018，8：2197.

［25］ 賈棟，紀周瑜，劉艷紅，等. 蓮草直胸跳甲不同發育階段內參基因的篩選與驗證[J]. 山西農業大學學報（自然科學版），2020，40（4）：53-58.

JIA D，JI Z Y，LIU Y H，et al. Screening and validation of in?ternalreference genes in different developmentalstages of Agas?icles hygrophila[J]. Journal of Shanxi Agricultural University（Natural Science Edition），2020，40（4）：53-58.

［26］ LIVAK K J，SCHMITTGEN T D. Analysis of relative geneexpression data using real-time quantitative PCR and the2?ΔΔCT method[J]. Methods，2001，25（4）：402-408.

［27］ AMIR M B，SHI Y，CAO H H，et al. Short neuropeptide Fand its receptor regulate feeding behavior in pea aphid（Acyrtho?siphon pisum）[J]. Insects，2022，13（3）：282.

［28］ LI H F，HUANG X Y，YANG Y H，et al. The short neuropep?tide F receptor regulates olfaction-mediated foraging behaviorin the oriental fruit fly Bactrocera dorsalis（Hendel）[J]. InsectBiochemistry and Molecular Biology，2022，140：103697.