放線菌4-1的鑒定及其發酵液抑菌作用和穩定性探究

郭宇豪，劉紹波，葛菁萍,2，平文祥,2

（1黑龍江大學，生命科學學院，農業微生物技術教育部工程研究中心，黑龍江省寒區植物基因與生物發酵重點實驗室，黑龍江省普通高校分子生物學重點實驗室，哈爾濱 150080；2河北環境工程學院，河北省農業生態安全重點實驗室，河北秦皇島 066102）

0 引言

放線菌是產生抗生素的重要的微生物資源。其中鏈霉菌屬(Streptomycessp.)產生的抗生素物質超過7000 種，占微生物來源的活性物質的一半以上[1]。探索稀有放線菌并尋找有價值的活性物質是目前的科學研究熱點[2]。

目前人們已經從不同來源的放線菌中分離得到多樣化的抑菌物質，例如從蛇藤(Kennedianigriscan)中分離得到內生放線菌StreptomycesNRRL 30562[3]，其產生對結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)有抑制作用的抗生素物質munumbicins A,B,C,D；從高良姜(Alpiniagalanga)的根部分離得到活性化合物Actinomycin D[4]，可以有效抑制香蕉炭疽病(Colletotrichummusae)[5]和白色念珠菌(Candida albicans)的生長[6]。放線菌MSU-2110(Streptomycessp.)分離自龜背竹(Monsterasp.)，其發酵產物中具有對植物病原真菌有抑制活性的多肽類抗生素coronamycin[7]。而來自于陜西秦嶺山區土壤中的放線菌Z139對小麥白粉病的保護作用達到98.6%，對其治療作用達到86.1%[8]。分離自京郊菜園土壤的吸水鏈霉菌(Streptomyceshygroscopicus)[9]，對果蔬灰霉病菌(Botrytiscinerea)[10]、番茄早疫病菌(Phytophthora infesta)[11]抑制作用相對較強。SINGH等[12]從印度哈里亞納邦的農業土壤中分離出鏈霉菌活性微生物菌株，可以有效地抑制金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的活性。

放線菌在土壤微生物中占有很大比例[13-14]，雖然土壤被認為是分離不同潛力放線菌的極好來源，但目前國內外研究重點是探索不同尋常和以前被忽視的生態系統[15]。因此極端環境中生長的微生物成為研究的側重點。極端環境包括強酸堿、高鹽度、高輻射、高溫和低溫等[16]。極端微生物產生的新型活性物質使其對極端生活環境有較強的適應性[17]。由于極端環境中的特殊生存條件，使得極端微生物的物種、遺傳和代謝機制具有豐富的多樣性。并且為了適應極端的生存環境，極端微生物具有產生多種生理活性物質的潛力[18]。極端環境放線菌中的嗜鹽堿放線菌是一類適宜生存在一定的鹽濃度環境中的革蘭氏陽性細菌，已經成為了目前極端環境放線菌研究的主要類群之一[19]。研究人員已從極端環境放線菌中發現了許多具有發展前景的優異菌種[20-21]，但是大多數菌種受到生產應用的限制。

課題組之前從黑龍江省肇東市錦繡大地試驗基地土壤中分離獲得了若干放線菌。該地區地處北緯46°2'23.1''，東經125°55'57.2''，土壤為堿化草甸土類型，pH高達9.90，鹽度含量達到0.12%，符合鹽堿地區的特點。本研究對其中高鹽脅迫下生長最好的4-1進行菌株鑒定及發酵液抑菌活性和穩定性測定。對分離自該生境下的放線菌種類及其產生的代謝物質進行摸索，將有利于擴大極端環境下的微生物資源挖掘及利用。

1 材料和方法

1.1 試驗用菌株

實驗室前期從肇東市錦繡大地試驗基地分離出10 株放線菌，經過耐鹽脅迫試驗發現，菌株4-1 在7%鹽含量下培養可以正常生長，說明其可以耐受高鹽脅迫，因此選用于后續試驗。

指示細菌包括變形桿菌(Proteusvulgaris)，大腸桿菌(Escherichiacoil)，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)等。

指示真菌包括禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)，小麥赤霉菌(Gibberellazeae)，瓜果腐霉菌(Pythiummelonii)，辣椒根腐菌(Phytophthorapepper)等。

1.2 各菌株所用培養基及培養方式

各指示細菌以1%接種量接入Beef extract Peptone(BP)培養基(g/L)后，37℃，160 r/min振蕩培養24～48 h，獲得對數生長期菌體；各指示真菌點植于PDA培養基(g/L)中，30℃靜止培養后獲得菌絲體。將斜面保藏的放線菌4-1 菌株接種到ISP 2 培養基(g/L)（葡萄糖4 g，麥芽浸粉10 g，酵母提取物4 g，pH 7.2～7.4），28℃，140 r/min 下搖床振蕩培養7 d，活化4-1 菌株。將過夜培養的4-1 菌株采用三區劃線的方法將菌株4-1 轉接到ISP 2 固體培養基中，28℃培養箱倒置培養3 d。連續傳代培養3～5 代，分別挑取長勢良好的單菌落作為出發菌株，進行后續試驗。

以瓊脂擴散法進行抑菌試驗，其中下層為2%的水瓊脂培養基，上層為半固體BP培養基。

淀粉水解試驗、明膠液化試驗、脲酶試驗、纖維素水解試驗、硝酸鹽還原檢測、碳源利用試驗所需培養基參考文獻[22]和[23]，在進行碳源利用試驗時，在培養基中加入0.5%(g/L)的葡萄糖、半乳糖、乳糖、麥芽糖、肌醇、甘露醇、甘露糖、鼠李糖。

1.3 試驗方法

1.3.1 土壤放線菌4-1的鑒定

（1）菌株4-1菌落形態及菌絲形態觀察

在ISP 2 液體培養基中接入菌株4-1 的單菌落，180 r/min 振蕩培養7 d，在顯微鏡下觀察細胞形態；采用插片法制片，將菌絲完全覆蓋在載玻片上，置于顯微鏡下觀察其菌絲形態。

（2）菌株4-1分子生物學測定

采用細菌基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司，目錄號DP307-02）提取菌株4-1 基因組DNA。以27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3’)和1492R(5’-CGGCTACCTTGTTACGACTT-3’)為擴增引物，以細菌基因組為模板進行PCR 擴增，片段全長分別為1509 bp。

向PCR產物中加入0.25μLTaq DNA聚合酶(5 U/μL)，在72℃恒溫水浴下反應10 min。用DNA 瓊脂糖凝膠回收試劑盒（天根生化科技有限公司，目錄號DP209）回收目的片段。以DL 2000 為Marker，擴增結果通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

將pMDTM18-T 載體與回收純化的PCR 產物16℃過夜連接，利用熱激法向E.coliDH5α 感受態細胞中轉入連接產物，復蘇后梯度稀釋涂布于LB 瓊脂平板（200 mg/mL IPTG、100 μg/mL Amp 和20 mg/mL X-gal）上，37℃過夜培養進行藍白斑篩選。

在上海生工生物工程股份有限公司進行菌液測序并上傳至NCBI進行比對。選擇同源性相近種屬的序列信息下載，并利用MEGA4.0 軟件構建系統發育樹，確定放線菌4-1的種屬地位。

（3）生理生化特性測定

參照《放線菌的分類和鑒定》[24]對菌株4-1 進行淀粉水解試驗、明膠液化試驗、過氧化氫酶試驗、脲酶試驗、纖維素水解試驗、硝酸鹽還原試驗、碳源利用試驗，初步推測菌株4-1所在的種屬分類。

1.3.2 菌株4-1 生長曲線的繪制菌株4-1 活化后，按1%接種量接入ISP 2 培養基中，并每隔24 h 測定菌體干重，菌體干重(DCW)的計算見公式(1)。以時間為橫坐標，DCW為縱坐標繪制菌株的生長曲線。

1.3.3 4-1 發酵液抑菌活性測定將菌株4-1 以1%接種量接入ISP 2 培養基中，28℃，180 r/min 搖瓶發酵培養7 d，取1 mL發酵，4000 r/min，室溫離心10 min，取上清液備用。以添加ISP 2培養基作為對照組。

采用瓊脂擴散法檢測病原性細菌抑菌活性，下層培養基為2%的水瓊脂，上層培養基為半固體BP。指示菌濃度為107cfu/mL，測量抑菌圈直徑，重復3 次。

采用菌絲生長速率抑制法檢測植物病原真菌抑菌活性。在加入發酵上清液的PDA 固體培養基中心點植直徑為4～5 mm 的供試真菌菌餅，培養7 d。以培養基作為對照，每個處理重復3 次。采用十字交叉法測定菌落直徑。菌絲生長抑制率見公式(2)：

1.3.4 4-1發酵液穩定性的測定

（1）發酵液酸堿穩定性測定。分別用l mol/L HCl溶液和1 mol/L NaOH溶液將菌株4-1的發酵液調節至pH 2.0～12.0。在室溫下放置1 h 后，將各處理組的pH值調節到與原始菌株發酵液pH值相同(pH 7)，以金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)為指示菌，參照1.3.3 測定抑菌活性，以原始發酵液為對照，重復3 次。以相對抑菌活性評價抑菌能力。相對抑菌活性見公式(3)。

（2）發酵液熱穩定性測定。將菌株4-1 發酵液于50、60、70、80、90、100℃下分別處理10 min 和30 min后，放置至室溫后測定其抑菌活性，以金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)為指示菌，參照1.3.3 測定抑菌活性，以原始發酵液為對照，重復3次。以相對抑菌活性評價抑菌能力。

（3）發酵液紫外線穩定性測定。將菌株4-1 菌株發酵液靜置在波長254 nm，功率20 W的紫外燈下，高度為30 cm左右，放置時間為5、15、30、60、120 min，以金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)為指示菌，參照1.3.3 測定抑菌活性，以原始發酵液為對照，重復3次。以相對抑菌活性評價抑菌能力。

2 結果與分析

2.1 土壤放線菌4-1的鑒定

放線菌4-1 的革蘭氏染色結果為陽性（圖1A），菌絲粗細介于4.5±0.1～5.8±0.1 μm。菌落中間呈紫紅色，表面隆起且光滑，邊緣白色，菌落質地柔軟。利用插片法觀察可見基內菌絲纖細，易斷裂，氣生菌絲較粗，分化形成孢子鏈，孢子呈鏈狀且彎曲，有分支，孢子橢圓狀或長圓狀，表面光滑。單菌落形態及菌絲形態如圖1B所示。

圖1 4-1菌體形態A(1600×)以及單菌落B形態(640×)

2.2 分子生物學鑒定結果

提取放線菌4-1 基因組及PCR 擴增并測序后（圖2A），得到1329 bp 片段，選取30 條同源性高于99%的16S rDNA 構建系統發育樹，由圖2B 可知，與菌株4-1分支最近且相似度最高的是紫赤鏈霉菌(Streptomycespuniceus)。

圖2 16S rDNA擴增產物電泳圖A以及系統發育樹B

2.3 菌株4-1生理生化特性

生理生化特性表明，菌株4-1 可以水解淀粉并液化明膠，不能產生過氧化氫酶、尿酶和硫化氫、不能還原硝酸鹽和分解纖維素?？梢岳冒肴樘?、葡萄糖、肌醇、乳糖、甘露糖、麥芽糖、鼠李糖。NaCl 耐受范圍是0%～7%。

綜合形態、生理生化結果和16S rDNA測序結果，菌株4-1 初步鑒定為紫赤鏈霉菌(Streptomyces puniceus)。

2.4 紫赤鏈霉菌(Streptomyces puniceus)4-1對病原性細菌的抑制作用

采用瓊脂擴散法測定了紫赤鏈霉菌(Streptomyces.puniceus)4-1 菌株發酵液對供試病原性細菌的抑制作用。由表1 可知，紫赤鏈霉菌(Streptomycespuniceus)4-1 發酵液對革蘭氏陽性細菌有較強的抑制作用，對革蘭氏陰性菌的抑制作用較弱。其中金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)抑菌圈直徑最大，而且抑菌圈非常透明；對其余革蘭氏陽性菌的抑菌活性次之。在選取的供試革蘭氏陰性細菌中，僅對銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)有較強活性，但抑菌圈并不完全透明，僅為清晰。

2.5 紫赤鏈霉菌(Streptomyces puniceus)4-1對植物病原真菌的抑制作用

采用菌絲生長速率抑制法測定紫赤鏈霉菌(Streptomycespuniceus)4-1 發酵液對供試植物病原真菌的抑制作用。紫赤鏈霉菌(Streptomycespuniceus)4-1 對5 種供試真菌的抑制作用相對較弱（表2），有3 種供試菌株生長抑制率在50%以下，其中禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)的生長抑制率最高，達到了70%。

表2 紫赤鏈霉菌(Streptomyces puniceus)4-1發酵液對植物病原真菌菌絲生長的抑制作用

2.6 紫赤鏈霉菌(Streptomyces puniceus)4-1發酵液穩定性測定

（1）酸堿對發酵液穩定性的影響

紫赤鏈霉菌(Streptomycespuniceus)4-1 菌株的發酵液對酸堿穩定性的測定結果如圖3 所示。發酵液pH在5～12之間時相對抑菌活性波動小，在1 h后指示菌的相對抑菌活性約在94%～100%之間，與對照組的原始發酵液相差不大，差異不顯著(P>0.05)。在pH為2 時，相對抑菌活性為86.7%，與對照組差異顯著(P<0.05)。由此可見，紫赤鏈霉菌(Streptomycespuniceus)4-1菌株的發酵液在中性和堿性條件下穩定，在較強酸性條件下(pH 2～4)穩定性較差。

圖3 紫赤鏈霉菌(Streptomyces puniceus)4-1發酵液的酸堿穩定性

（2）熱對發酵液穩定性的影響

紫赤鏈霉菌(Streptomycespuniceus)4-1 菌株的發酵液對熱穩定性的測定結果如圖4所示。當溫度處于50℃～90℃之間時，發酵液的抑菌成分有極強的熱穩定性，在80℃下仍有87.1%的相對抑菌活性。當溫度大于90℃時，發酵液的相對抑菌活性低至75.1%，已有明顯下降，與對照組的原始發酵液差異顯著(P<0.05)，且隨著高溫時間的延長，相對抑菌活性也逐漸降低。由此可以看出，紫赤鏈霉菌(Streptomyces puniceus)4-1菌株發酵液的抑菌成分對溫度較耐受，但在高溫條件下(T>90℃)不穩定。

（3）紫外線對發酵液穩定性的影響

紫赤鏈霉菌(Streptomycespuniceus)4-1 菌株的發酵液對紫外線穩定性的測定結果如圖5所示。在紫外線照射處理120 min 內，與0 h 的原始發酵液相比，發酵液的相對抑菌活性均沒有太大的變化，差異均不顯著(P>0.05)。說明菌株發酵液的抑菌成分對紫外線有良好的穩定性。

圖4 紫赤鏈霉菌(Streptomyces puniceus)4-1發酵液的熱穩定性

3 討論

本研究中所分離獲得的土壤放線菌4-1來自鹽堿地帶，通過形態、生理生化結果和16S rDNA基因序列分析結果發現[25]，該菌株與紫赤鏈霉菌(Streptomyces puniceus)同源性最高。鏈霉菌屬(Streptomycessp.)是放線菌中分布最廣且產生抗生素種類最多的種屬之一[26]，具有重要的應用價值[27]，因此也使本研究中獲得的4-1 具有更好地潛在應用性。紫赤鏈霉菌(Streptomycespuniceus)4-1 發酵液對大部分革蘭氏陽性細菌和部分革蘭氏陰性細菌有較強的抑制作用，然而這些作用在一定程度上受到環境變化的影響，這也是很多鏈霉菌發酵液的特點，同時與其他來源菌株相比，4-1發酵液的抑菌及穩定性也具有較大優勢。例如枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)WL2 菌株分離自馬鈴薯晚疫病病葉，具有抑制致病疫霉菌絲體生長的功能[28]，與紫赤鏈霉菌(Streptomycespuniceus)4-1 相比較，4-1發酵液在強堿性、高溫和紫外條件下有更好的穩定性；而陳超等[29]分離出的葡萄座腔菌(Botryosp haeriadothidea)的發酵液熱穩定性比紫赤鏈霉菌(Streptomycespuniceus)4-1要更加穩定，但酸堿和紫外穩定性卻較差。趙雅等[30]分離出的貝萊斯芽胞桿菌(Bacillusvelezensis)HN-Q-8菌株的發酵液具有遠超紫赤鏈霉菌(Streptomycespuniceus)4-1 發酵液的熱穩定性，但在強酸強堿和紫外條件下的穩定性卻難以與之相比。由此可以看出，紫赤鏈霉菌(Streptomyces puniceus)4-1的抑菌活性以及穩定性受環境影響較大，其發酵液在酸堿和紫外條件下的生物活性遠高于正常環境下的部分放線菌，且穩定性也更強。但是相對而言，其熱穩定性與正常環境下的放線菌相比卻略有不足，尤其當溫度高于90℃以上時，發酵液抑菌活性明顯下降。紫赤鏈霉菌(Streptomycespuniceus)4-1 是生存于鹽堿地帶的放線菌，對于鹽堿脅迫有較高的耐受性。但可能長期馴化于北方寒冷氣候環境下，其代謝產物穩定性在高溫時會有所下降。

圖5 紫赤鏈霉菌(Streptomyces puniceus)4-1發酵液的紫外穩定性

4 結論

研究表明本課題組從鹽堿環境中分離得到的菌株4- 1 經綜合鑒定為紫赤鏈霉菌(Streptomyces puniceus)。菌株4-1對6株病原性細菌和5株病原性真菌有抑制作用，其發酵液對酸堿、熱、紫外線都有較好的穩定性，但在強酸性條件(pH<4)以及高溫條件(T>90℃)下，發酵液抑菌活性下降。以上實驗說明紫赤鏈霉菌(Streptomycespuniceus)4-1 在抑菌作用與穩定性上有較大的開發價值，可為其抑菌作用的次生代謝產物的挖掘利用提供理論基礎和參考。