甘藍型油菜高亞麻酸CMS的快速選育方法及效果研究

張耀文，董育紅，關周博，韋世豪，李殿榮，李少欽，梁峰志

（陜西省雜交油菜研究中心，陜西楊凌 712100）

0 引言

亞麻酸攝入不足已成為中國人群亞健康、慢性疾?。ㄐ哪X血管疾?。┌l病率上升的一個重要原因[1-2]。由于缺乏ω3/Δ15脂肪酸脫氫酶(FAD)人體無法將亞油酸轉換成亞麻酸，因而必須依賴膳食中的亞麻酸來滿足人體的需求[3-5]。近年來亞麻酸的消費量迅速增加，但生物資源較少、亞麻酸的產出量受限，已成為制約亞麻酸產品廣泛應用的障礙因素[6-7]，亟需尋找、開發新的亞麻酸資源來滿足市場對亞麻酸產品的需求。因具有不含膽固醇、抗氧化性較好、提取加工成本低等優勢，植物源亞麻酸的應用前景非常廣闊[6]。人體攝入50%以上的脂肪酸來自于食用油[5,8]，改善食用油的脂肪酸組成是提高人體亞麻酸攝入量的一條重要途徑[9-11]。菜籽油是中國居民的重要食用油源也是富含亞麻酸的常用植物油[8,11-14]，開展油菜高亞麻酸育種可有效緩解亞麻酸產品供給緊缺的現狀。然而，雙低育種（低芥酸、低硫苷）在從遺傳上除去菜籽（油）中占50%左右的芥酸的同時使亞麻酸含量降低23.81%、亞油酸含量增加92.31%，導致亞油酸與亞麻酸的比例從1.24:1 提高到3.13:1[9-11,14]；而營養學要求二者的比例為1:1。因而，基于營養健康的要求也需要提高菜籽（油）中的亞麻酸含量、改變亞油酸與亞麻酸的比例。2016年李殿榮提出在油菜育種中應適當提高亞麻酸含量的建議[15]，隨后逐步形成了油菜高亞麻酸育種的概念和策略[11,16]。張耀文等[11]、LI 等[17]、于澄宇等[18]、余順波等[19]、陳俊坤等[20]均已篩選出亞麻酸含量高于15%的甘藍型油菜種質。柴友榮等[21]、杜卓霖[22]分別在T3 代（導入紫蘇PfFAD3基因）、‘中雙11’（過表達亞麻薺FAD2和FAD3基因）中獲得亞麻酸含量高于30%的甘藍型油菜種質。張耀文等[7]構建了甘藍型油菜高亞麻酸種質的篩選方法，育成高亞麻酸雜交種‘秦雜油7號’[11]。余順波等[19]、陳俊坤等[20]分別育成高亞麻酸油菜新品系‘908’、‘油研712號’。徐勁松等[23]、于澄宇等[24]分別提出了油菜高油酸與高亞麻酸聚合育種，抗草甘膦高亞麻酸油菜的選育方法。

雜種優勢利用是提高油菜產量和品質的重要途徑，細胞質雄性不育(CMS)是油菜雜種優勢利用重要的授粉控制系統之一[25]。由于CMS 提供了雜交種全部的細胞質和1/2 的細胞核基因，因此CMS 的性狀對雜交種會有較大影響；對CMS性狀的改良已成為油菜雜種優勢利用研究的重要內容[26-28]?？偹苤?，油菜CMS 是原CMS 和保持系的雜交后代，每次測交的結果需要到下一個生殖生長季節才能獲知。CMS 的育性穩定、基因純合都需要5～6代的轉育，因冬油菜屬于跨年度作物為“2年1熟”、春油菜為“1年1熟”，所以在常規條件下需要5～6年甚至更長時間才能獲得遺傳穩定的CMS。CMS的品質和農藝性狀受原CMS的細胞質和新（保持系）細胞核基因共同作用的影響，因細胞核中來源于保持系的基因比例不同、生長環境條件差異都會造成不同世代的CMS 的品質和農藝性狀發生較大變化，需要對其品質農藝性狀進行定向篩選才能獲得具有目標性狀的CMS。近紅外分析法、氣象色譜分析法均要求1 g以上的種子量才能進行亞麻酸含量的化驗分析，而常規轉育CMS獲得的種子量難以滿足化驗分析要求，因而對其進行定向篩選的工作較難開展。來自不同部位（主花序、分枝）種子的含油量、亞麻酸含量的差異會影響對CMS 單株進行篩選的準確性。CMS的育性會影響雜交種雜種優勢的發揮，異交結實率會影響制種產量[29-31]，因此需要通過對不育性、異交結實性等進行綜合篩選才能獲得具有育種利用價值的CMS。同時，因傳統的選育方法對保持系進行了5～6代的連續自交會造成品質、農藝性狀發生退化，降低CMS、保持系在育種中的利用價值。綜上所述，亟需建立一種即能對含油量、亞麻酸含量進行定向篩選也能對育性和結實率的進行協調和平衡的快速、高效育種方法，篩選出可滿足油菜高亞麻酸育種實際需求的CMS。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

甘藍型油菜CMS陜6A（陜2A不育胞質），高亞麻酸種質（亞麻酸含量為17.6%）。

1.2 試驗方法

1.2.1 CMS 的轉育基于對育性、農藝性狀比較，在盛花期從陜6A、測恢材料(17gh168)中分別選擇出優異單株，去除主花序和倒1、2 分枝基部已開放的花蕾和上部的較小花蕾。在對將在2～3 d內可開放的花蕾數進行統計后，用自交袋將不育株和對應父本套在一起。從套袋后第2天開始，每天上午9:00—10:00、下午3:0—4:00 進行人工搖擺自交袋進行授粉，重復3～5 d。授粉結束3 d后拆除自交袋，讓F1代自然成熟。收獲前統計成角數。按單株收獲、化驗；依據表1的篩選指標對F1代進行篩選。在冬油菜、春油菜、溫室重復以上操作流程，最終獲得F5代、F6代CMS。

表1 不同世代CMS的篩選指標

1.2.2 保持系的選育利用高亞麻酸種質(17gh168)與陜6A 進行測恢，根據F1代、F2代CMS 的育性、品質和對該種質的產量、品質性狀遺傳穩定性的分析結果，篩選出3個優異單株進行混繁。

1.2.3 花器官的形態測量 在盛花期分別取不育系(YM-1A)、保持系(YM-1B)50朵完全開放的花朵，用游標卡尺測量花瓣長度、寬度、雄蕊長、雌蕊長；取平均值進行統計分析。

1.2.4 不育度與不育率調查在盛花期分別取不育系(YM-1A)、保持系(YM-1B)100 朵完全開放的花朵，按照侯國佐(1991)的方法與標準[31]進行不育度、不育率的調查和不育性級別的劃分。

1.2.5 結實系數測定將‘YM-1A’的分枝分成2 份；1份套袋自交，另1 份與‘YM-1B’進行人工授粉。分別記錄下處理的花蕾數，待成熟后統計有效結角數。按照“結實系數=有效角果數/處理的花蕾數”分別計算自交、異交結實系數。

1.2.6 產量和品質測定對每個世代的不育系與保持系按單株收獲。用稱重法計算單株株產量。用近紅外分析法測定種子的含油量、亞麻酸含量。按照“亞麻酸產量=單株株產量×含油量×亞麻酸含量”計算單株亞麻酸產出量。

1.2.7 遺傳穩定性分析用SPSS 13.0 統計軟件分別對‘YM-1B’和F5代、F6代CMS進行亞麻酸含量、含油量、單株產量、單株亞麻酸產量的遺傳穩定性分析。

2 高亞麻酸保持系(YM-1B)和CMS(YM-1A)的篩選過程與效果

2.1 ‘YM-1B’的篩選過程與效果

如圖1 所示，2017 年7 月利用高亞麻酸種質(17gh168)的8個株系與陜6A進行測恢，2017年9月按單株收獲、化驗分析。依據2018 年4 月對8 個F2代的育性鑒定結果和2017年9月、2018年6月的農藝性狀、產量、品質分析結果，篩選出亞麻酸含量＞17.5%、含油量＞49%、單株產量＞20 g、單株亞麻酸產出量＞1.71 g 的3 個優異單株17GH120（17gh69-3 自交）、122（17gh69-4 自交）、128（17gh69-7 自交）進行混繁（代號18GH220），收獲的種子用于后續轉育CMS。

圖1 甘藍型油菜高亞麻酸CMS和保持系的篩選過程

從表2 可知，該種質的亞麻酸含量、含油量、單株產量、單株亞麻酸產量的表型變異在1.78%～4.19%之間，表明遺傳穩定；確定其為保持系并命名為‘YM-1B’。

表2 高亞麻酸CMS和保持系的遺傳穩定性分析結果

2.2 ‘YM-1A’的篩選過程

2.2.1 在春油菜區通過測恢獲得F1代2017年7月按照1.2.1的方法用17gh69的8個株系與陜6A進行測恢獲得F1代（圖1）。

2.2.2 在冬油菜區篩選、轉育出F2代2017 年9 月將8個F1代和對應父本隔行種植，田間編號為17GH115-140。2018 年4 月選擇選擇不育度＞98%、不育率為100%；自交結實系數＜0.25、異交結實系數＞17.4；亞麻酸含量＞11.8%、含油量＞45.0%的4 個F1代[17GH119（陜6A×17gh69-3 自交）、17GH121（陜6A×17gh69-4 自交）、17GH125（陜6A×17gh69-5 自交）、17GH127（陜6A×17gh69-7 自交）]與對應的父本[17GH120(17gh69-3 自交)、17GH122(17gh69-4 自交)、17GH125(17gh69-5自交)、17GH128(17gh69-7自交)]按照1.2.1的方法進行套袋雜交獲得F2代（圖1）。

2.2.3 在溫室進行篩選、轉育出F3代2018 年9 月選擇亞麻酸含量＞13.4%、含油量＞45.5%的4 個F2代與對應父本隔行種植，田間代號為18GH388～395。2018年11 月將為4 個F2代(18GH388、18GH390、18GH392、18GH394) 及父本(18GH389、18GH391、18GH393、18GH395)移入溫室，編號為18GW1～8。2019年1月在選擇選擇不育度＞98%、不育率為100%的3 個F2代18GW3(GH390)、18GW5(GH392)、18GW7(GH394)與對應父本18GW4(GH391)、18GW6(GH393)、18GW8(GH395)按照1.2.1的方法進行雜交獲得F3代（圖1）。

2.2.4 春油菜區篩選、轉育出F4代2019 年4 月選擇自交結實系數＜0.25、異交結實系數＞18.4；亞麻酸含量＞14.5%；含油量＞46.5%的3 個F3代單株(18GW3、GW5、GW7)與保持系(18GH220)隔行種植，田間代號為19gh65～70。2019年7月選擇不育度＞98%、不育率100%的2 個F3代19gh65(18GW5)、19gh69(18GW7)與保持系(19gh66、19gh70)按照1.2.1 的方法進行雜交獲得F4代（圖1）。

2.2.5 在溫室轉育、篩選出F5代2019 年9 月選擇亞麻酸含量＞15.39%；含油量＞47.3%的2 個F4代單株(19gh65、gh67)與保持系(18GH220)隔行種植在冬油菜區，田間代號為19GH283～286。2019年11月將為2個F4代(19GH283、285)及保持系(19GH284、GH286)移入溫室，編號為19GW1～4；2020 年1 月選擇選擇不育度＞98%、不育率為100%的2個F4代19GW3(19GH283)、19GW5(19GH285)與保持系19GW4(GH284)、19GW4(GH286)按照1.2.1的方法進行雜交獲得F5代（圖1）。

2.2.6 在冬、春油菜區分別轉育、篩選出F6代2020年4月、9 月選擇自交結實系數＜0.25、異交結實系數＞18.4；亞麻酸含量＞16.36%；含油量＞48.2%的F5代(19GW3)與保持系(18GH220)隔行種植于春、冬油菜區；在2020 年7 月、2021 年4 月分別按照1.2.1 的方法進行轉育獲得F6代（圖1）。

2.2.7 ‘YM-1A’的確立從表2可知，該CMS亞麻酸含量、含油量、單株產量、單株亞麻酸產出量的表型變異在2.98%～4.22%之間，說明遺傳穩定。確定其為油菜高亞麻酸CMS并命名為“YM-1A”。

2.3 ‘YM-1A’的選育效果

2.3.1 花器官形態的測定結果表明‘YM-1A’屬于CMS不育系花器官形態是鑒別油菜雄性不育性的重要指標[27]。從表3可看出，較‘YM-1B’，‘YM-1A’的花朵直徑、花瓣長度、花瓣寬度分別降低12.74%、26.97%、31.44%，表明其花朵大小、花瓣長、寬均明顯變??；雄蕊長度短57.98%而雌蕊長度無明顯差異則表明其雄蕊明顯退化而雌蕊發育正常?！甕M-1A’雄蕊長度與雌蕊長度之比為0.46即小于1/2，按侯國佐等[31]的育性分級標準可定為1級。

表3 ‘YM-1A’與‘YM-1B’的花器官形態比較

2.3.2 在選育過程中CMS 的品質性狀明顯提高從F1代到F6代亞麻酸含量由11.85%提升至16.96%提高了43.12%，年平均增量為1.006 個百分點；不同世代間（年）的增長量逐步降低即F2-F1（1.60個百分點）＞F3-F2（1.11個百分點）＞F4-F3（0.93個百分點）＞F5-F4（0.87個百分點）＞F6-F5（0.6個百分點）。從F1代到F6代含油量由45.0%提升至48.8%提高了8.44%，年平均增量為0.759個百分點；不同世代間（年）含油量的增長量之間為F4-F3（0.98 個百分點）＞F3-F2（0.78 個百分點）、F5-F4（0.77個百分點）＞F6-F5（0.6個百分點）＞F2-F1（0.47個百分點）。從F1代到F6代單株亞麻酸產量由0.98 g提升至1.53 g提高了56.12%，年平均增量為0.112 g；不同世代間（年）增長量逐步降低即F2-F1(0.16g)＞F3-F2(0.14 g)＞F4-F3(0.12g)＞F5-F4(0.09g)＞F6-F5(0.04 g)（圖2）。

圖2 甘藍型油菜高亞麻酸CMS的篩選效果

2.3.3 ‘YM-1A’的品質、結實性顯著提高如表4所示，‘YM-1A’的不育度為99.6%、不育率為100%，含油量為48.8%、亞麻酸含量為16.66%，說明‘YM-1A’符合高油、高亞麻酸CMS的標準。與陜6A相比，‘YM-1A’的含油量、單株產量分別提高8.45%、4.49%；亞麻酸含量、異交結實系數、單株亞麻酸產量分別提高59.43%、12.8%、80.65%；而自交結實系數則降低56.86%。

表4 ‘YM-1A’與陜6A的比較結果

3 討論與結論

3.1 本研究的方法可有效提高CMS 及保持系的選育效率

傳統轉育CMS的方法需要進行剝蕾、取粉、授粉、套袋、固定、松袋、拆袋等繁瑣的操作程序且需要5～6年甚至更長時間才能育成穩定的CMS[27-28,30,32]，而本研究采用對父母本間的單株套袋雜交的方法造作較簡便，選育周期縮短為4 年。利用自交袋代替雜交袋有效提高了不育株的成角率、角粒數，使收獲的種子量可滿足化驗分析對種子量的要求，有利于對不同世代CMS進行含油量、亞麻酸含量的定向篩選。依據篩選目標，制定出不同環境、不同世代育性、結實性、品質的篩選，對不同世代的CMS 進行單株間比較篩選，即可保證獲得具有目標性狀（育性、結實性、高亞麻酸）CMS 也可通過定向選擇逐步提高CMS 的含油量、亞麻酸含量及結實性。采用不同世代的CMS 的品質指標（含油量、亞麻酸含量）與保持系的比值進行單株間的比較篩選，成功解決了因受不同世代、不同環境影響不同世代CMS 的品質性狀難以比較的問題。通過對不同世代的CMS進行固定部位（種子）的結實率、品質（含油量、亞麻酸含量）的定量比較，有效降低了測定結果間的差異，提高了篩選的準確性。采用對CMS進行自交結實系數、異交結實系數篩選的方法解決了需要對CMS 的育性和結實率進行的協調和平衡的問題。對保持系采用混合繁殖不僅可有效解決因連續5～6代自交造成的品質、農藝性狀發生退化的問題而且明顯減少了工作量。

3.2 ‘YM-1A’的不育性、結實性、品質等性狀得到顯著提高

與陜6A（原CMS）相比，‘YM-1A’的不育度、不育率無顯著差異而異交結實系數提高12.88%、自交結實系數降低56.86%；亞麻酸含量、含油量、單株產量、單株亞麻酸產出量分別提高59.43%、8.45%、4.49%、80.65%，表明‘YM-1A’的不育性、品質、結實性等性狀顯著提高。較F1代，F6代CMS的亞麻酸含量、含油量、單株亞麻酸產出量分別提高43.12%、8.44%、56.12%，其原因在于選用的保持系(YM-1B)在亞麻酸含量、含油量、單株產量、單株亞麻酸產量等性狀方面具有明顯的優勢，印證了前人的利用優良的保持系可顯著是改良CMS 性狀的結論[28-31]。在選育過程中，世代間（年）的亞麻酸量的增長量、單株亞麻酸產量均呈現出逐步降低的趨勢即F2-F1＞F3-F2＞F4-F3＞F5-F4＞F6-F5，其原因可能在于保持系(YM-1B)的亞麻酸含量、單株產量(17.52%、22.57 g)較陜6A(10.45%、17.82 g)分別高67.66%、26.66%即二者之間具有顯著差異；隨保持系基因導入量的增加，逐步縮小。至于世代間（年）含油量的增長量表現出F4-F3＞F3-F2、F5-F4＞F6-F5＞F2-F1的原因可能在于不同的選擇環境對CMS 的含油量產生了一定影響。

3.3 ‘YM-1A’具有較高的育種利用價值

亞麻酸含量、含油量、單株產量、單株亞麻酸產出量的表型變異在2.98%～4.22%之間說明‘YM-1A’的表型性狀遺傳穩定。CMS的育性、異交結實使判斷其育種利用價值高低的重要指標[29-32]。本研究對花器官形態的研究結果表明‘YM-1A’屬于CMS；不育度、不育率分別為99.6%、100%及自交結實系數為0.22 表明‘YM-1A’的不育性徹底；含油量、亞麻酸含量分別為48.8%、16.96%表明“‘YM-1A’的品質較優；亞麻酸單株產量為1.51 g、異交結實系數為18.5 表明‘YM-1A’的結實性較好。與陜6A相比，‘YM-1A’的含油量、單株產量、亞麻酸含量、異交結實系數、單株亞麻酸產量顯著或極顯著提高，自交結實系數極顯著降低則表明其的育種價值優于陜6A。同時，由于在不同環境（冬油菜區、春油菜區、溫室）在的交互選擇，‘YM-1A’可同時適于冬、春油菜區的甘藍型油菜高亞麻酸雜交育種。隨后將利用‘YM-1A’進行優勢組合的測配工作，以期盡快選育出甘藍型油菜高亞麻酸雜交種。

本研究的快速轉育方法明顯縮短了育種年限、提高了育種選擇效率。選育出的高油、高亞麻酸CMS‘YM-1A’具有較高的育種利用價值。