凋落物真菌Neocucurbitaria salicis-albae及其代謝產物的抗細菌活性

劉瑤，趙吳超，楊驍，寇雨心，都婷婷，陳秀青，秦夢飛，徐利劍

（黑龍江大學現代農業與生態環境學院，哈爾濱 150080）

0 引言

真菌作為自然界重要的自然資源，分布范圍極其廣泛，其物種的多樣性十分豐富，而且在生態系統中也扮演了分解者等重要作用。隨著自然條件的變化和生物種群的繁衍，真菌作為自然界不可缺少的一部分，真菌的多樣性及組成也在不斷變化，從而使得真菌物種豐富，功能多樣。真菌物種數量非常龐大，目前估計有220 萬至380 萬種真菌，而已經命名的真菌僅20 萬種左右，其中多數真菌的活性與用途未被深入研究，所以真菌被認為是重要的未被深入開發的自然資源[1]。

真菌的次生代謝物作為天然產物，已經在工業、醫藥、食品等諸多方面表現了很好的應用潛力，因此，森林凋落物真菌資源逐漸受到重視[2-4]。2019—2022年，在大興安嶺森林凋落物中共報道真菌334 株，其中91株為尚未被描述的真菌[5-7]，張哲棟等[4]在2株凋落物真菌中分離出4個單體化合物，其中有3個單體化合物具有抗菌活性，有2 個化合物為首次從真菌的提取物中分離得到。SI等[8]在1株真菌中得到5個單體化合物，且都具有抗菌活性，其中3 個單體化合物為新結構化合物。甄錦程等[9]在3株凋落物真菌中，共分離8個化合物，其中2個表現了抗菌活性，并且含有2個新化合物。以上研究表明大興安嶺真菌資源豐富，可以產生具有抗菌活性的化合物，但研究不夠廣泛與深入，目前尚有大量真菌資源未被嘗試開發利用。

為了獲得大興安嶺森林凋落物中未開發的真菌及其抗菌化合物，為防治植物病害提供備選菌株及其抗菌化合物，本研究從大興安嶺森林凋落物中分離鑒定了一株Neocucurbitaria屬真菌SGSF801，并從其發酵物中分離、純化并鑒定了一個具有抗植物病原菌活性的抗菌化合物，為大興安嶺森林凋落物真菌資源的利用，提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 樣品采集本研究的凋落物樣品采自于大興安嶺地區[2]。該地區主要的植物為樟子松(Pinussylvestris)，興安落葉松(Larixgmelinii)，水曲柳(Fraxinus mandshurica)白樺(Betulaplatyphylla)等。以每層4 cm至8 cm 的深度采集凋落物的樣品，共采集A、B、C 三層。將所采集的樣品分別裝入已經滅菌過的信封袋里，對其進行自然風干，然后放入箱中保存。

1.1.2 供試微生物植物病原細菌：水稻黃單胞菌水稻致病變種(Xanthomonasoryzaepv.oryzae)，丁香假單胞桿菌(Pseudomonassyringae)，青枯勞爾氏菌(Ralstonia solanacearum)，植物病原真菌：細交鏈格孢菌(Alternariatenuis)，立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)，用于抗菌活性測試。供試培養基MEA、OA、PD、PDA、SM、SMAY、YMA 與大米培養基等，培養基配方參考邱天藝等[10]的研究。

1.2 試驗方法

1.2.1 凋落物真菌的分離運用顆粒涂布平板法[11]對凋落物真菌進行分離。將所采集到的森林凋落物樣品充分研磨至小顆粒狀，隨后將其配置成懸浮液，按照一定梯度稀釋涂布在1/4 PDA培養基上，放置在25℃培養箱中進行培養，隔12 h觀察一次，在無菌操作臺中挑出剛萌發的菌落至PDA培養基上，進行真菌的培養純化。

1.2.2 凋落物真菌的鑒定運用CTAB法[12]獲取真菌的DNA，采用引物ITS1 及ITS4 擴增其內部轉錄間隔區序列(Internal Transcribed Spacer,ITS)，選用引物LR0R和LR5 擴增其核糖體大亞基基因序列(nuclear large subunit rDNA, LSU)，選用引物Bt2a 和Bt2b 擴增其β-微管蛋白基因序列(β-tubulin,TUB2)。其中PCR 擴增的體系和及引物序列等信息參見GAO 等[13]的方法。經過測序，運用BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行真菌基因序列比對分析，確定該凋落物真菌的分類學地位。在形態學觀察方面，通過觀察在不同培養基上菌落顏色、質地和分泌物，以及觀察產孢結構和孢子的形狀、大小等特征，和相近真菌文獻進行比較，進行形態學鑒定。

1.2.3 菌株發酵及提取物制備 首先把菌碟接種在SMAY培養基中，放置于搖床里在180 r/min，25℃條件下振蕩培養3 d，然后分別吸取200μL菌液，接種到20 mL體系的SM、PD、PDA 及大米培養基中進行菌株發酵。SM、PD發酵置于搖床180 r/min，25℃條件下培養14 d，PDA及大米培養基發酵置于25℃靜置培養21 d。真菌發酵結束后，加入20 mL 的乙酸乙酯，充分混勻，然后靜置24 h，通過減壓濃縮得到發酵提取物，使用1 mL的10%的二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)作為溶劑，得到真菌發酵物的提取物溶液。

1.2.4 粗提物的抗菌活性測定運用打孔藥劑擴散法[14]測定真菌的抗菌活性?？怪参锊≡毦簩u好的菌液加入到溫度在50℃的LBA培養基中，倒平板后靜置4 h，待其凝固后用打孔器均勻打6 個孔。取10μL 發酵提取物溶液，加入孔中?？怪参锊≡婢河么蚩灼髟赑DA平板上均勻的打6個孔，中間接種植物病原真菌菌碟，其余同上。

1.2.5 化合物的分離與鑒定利用大米培養基進行擴大發酵，利用乙酸乙酯進行提取。將濃縮粗提物與等量的100～200 目硅膠混合均勻。風干上樣進行柱層析，使用二氯甲烷與甲醇溶液梯度洗脫，每個梯度洗脫2 L溶液，得到洗脫樣品S1～S30。利用薄層層析(TLC)法合并相似組分[15]，采用葡聚糖凝膠Sephadex LH20 層析柱，二氯甲烷與甲醇1:1比例配置洗脫溶液，洗脫流速約為8 s一滴。利用半制備液相(C18反向硅膠柱)甲醇-水系統進行制備，HPLC 進行化合物純度檢測，獲得高純度的單體化合物。隨后進行核磁共振氫譜(1HNMR)分析與碳譜(13C-NMR)分析，查閱文獻，鑒定其結構。

1.2.6 單體化合物測定最低抑菌濃度參照張哲棟等[4]研究方法。使用96 孔板對化合物最低抑菌濃度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC)進行測定，首先將單體化合物溶于5%的DMSO 溶液中溶解，然后倍半稀釋至不同濃度，添加至96孔板，3次重復，5%的DMSO 與金霉素分別作為對照。密封于25℃的培養箱中，進行黑暗培養，24 h后開始觀察結果。

2 結果與分析

2.1 凋落物真菌的分離與鑒定

從森林凋落物中分離出真菌SGSF801，經多序列相似性分析，其最相近菌種為Neocucurbitariasalicisalbae（表1）。真菌SGSF801 在PDA 培養基上呈現橄欖綠色，YMA上呈白棕色，可產生厚垣孢子，與報道的形態學特征[16]存在一定的差異。真菌形態學觀察結果如圖1 所示，結合分子鑒定結果，初步將其鑒定為N.salicis-albae的新株系。

圖1 形態學觀察

表1 多序列相似性分析結果

2.2 凋落物真菌的生長速率分析

通過比較4 種培養基不同溫度下的生長速率，發現SGSF801 在OA 培養基上菌落生長速度最快，其最適生長溫度為20℃至25℃。不同培養基及不同溫度的生長直徑如表2所示。

表2 不同培養基及不同溫度的生長直徑 mm

2.3 粗提物的抗菌活性測定

SGSF801菌株粗提物的抗菌活性測定結果如表3所示。在抗植物病原細菌活性方面，4 種培養基發酵的粗提物都表現了不同程度的抗丁香假單胞菌和青枯勞爾氏菌的活性，在抗真菌方面，大米培養基粗提物表現了抗立枯絲核菌的活性，綜合比較選擇大米培養基作為擴大發酵培養基。

表3 抗菌活性測定

2.4 單體化合物的結構

對SGSF801菌株進行大米培養基發酵，得到16.8 g粗提物。通過對粗提物抗菌活性追蹤分離得到1個單體化合物。該化合物的13C-NMR(101 MHz，CDCl3)共有16 個峰，化學位移值為δ 201.68、197.57、191.61、178.15、169.38、166.05、158.07、154.99、105.46、103.77、101.50、99.21、93.81、58.73、31.91、27.69。經文獻查詢，該化合物的13C-NMR與1H-NMR波譜數據與化合物尾孢酰胺(Cercosporamide)的數據一致[17]，其分子式為C16H13NO7，其結構式如圖2所示。

圖2 單體化合物化學結構

2.5 單體化合物的MIC值測定結果

利用植物病原細菌青枯勞爾氏菌和丁香假單胞菌，對單體化合物進行了MIC的測定，結果顯示該單體化合物對青枯勞爾氏菌的MIC值為31.25～62.5 μg/mL，對丁香假單胞菌的MIC值為125～250 μg/mL。

3 結論與討論

大興安嶺森林凋落物中具有大量未開發利用的真菌資源[5-7]，本研究在大興安嶺森林凋落物中，分離鑒定了 一 株 真 菌N.salicis-albaeSGSF801。Neocucurbitaria菌屬隸屬于Cucurbitariaceae 菌科，該屬由WANASINGHE 等[18]建立于2017年，目前包括22個物種，可以腐生在灌木與喬木上。N.salicis-albae是由CROUS 等[16]基于其ITS、LSU 及TUB2 等序列分析結果，建立于2019 年，最初該物種發現于烏克蘭的白柳(Salixalba)樹枝上，形態學觀察發現該菌可以產生棕色球形分生孢子器，分生孢子為近圓柱形至梭形。菌株SGSF801雖然未見產生分生孢子器與分生孢子，但經ITS、LSU 及TUB2 多序列分析發現SGSF801 的最相近菌種為N.salicis-albae，ITS與LSU的相似性都超過了99%，但是TUB2 其相似的相似性為97.54%與已知株系存在差異，由此將其鑒定為N.salicis-albae的新株系。關于Neocucurbitaria菌屬的天然產物化學方面，HU 等[19-20]在N.unguis-hominis提取物中分離到15個二萜類新化合物，但未見這些化合物具有明顯的抗菌活性，尚未見關于N.salicis-albae天然產物的報道。本研究首次嘗試分離N.salicis-albae的天然產物，在其大米發酵提取物中鑒定了一個抗菌化合物尾孢酰胺，該研究豐富了Neocucurbitaria菌屬的次生代謝物數據。尾孢酰胺最初分離于Cercosporidium henningsii[21]，后來也發現于真菌Verruculinaenalia中[17]，尾孢酰胺曾被發現可以選擇性地作用于Pkc1激酶，具有開發成廣譜型抗真菌藥物的潛力[22]，但尚未見尾孢酰胺抗植物病原細菌丁香假單胞菌與青枯勞爾氏菌的報道，本研究為首次在Cucurbitariaceae 菌科真菌中發現尾孢酰胺，并且還證明了尾孢酰胺在離體情況下具有抗植物病原細菌的活性，但是否能在活體植株上表現出相同活性還有待進一步驗證。在對SGSF801的次生代謝物分離過程中，還發現了兩個類似萜類的化合物，且在預試驗中表現出了抗菌活性和抗線蟲活性，由于條件有限未能純化出單體化合物，關于凋落物真菌SGSF801 的次生代謝產物的研究還有待深入。

綜上所述，本研究在森林凋落物上分離、培養、鑒定了N.salicis-albae的一個新株系，在它的大米發酵物中分離鑒定了1 個抗菌化合物——尾孢酰胺，并首次發現該化合物具有抗丁香假單胞菌與青枯勞爾氏菌的活性，其MIC為31.25～250 μg/mL。本研究結果，豐富了關于Cucurbitariaceae菌科尤其是Neocucurbitaria屬真菌抗菌次生代謝物的研究，為進一步開發利用大興安嶺凋落物真菌資源奠定了基礎。