缺氧誘導因子通過Notch信號通路對上皮間質轉化調控作用的研究進展*

陳 曉,李坤平 綜述,方永平△ 審校

(1.廣東醫科大學第一臨床醫學院,廣東 湛江 524023;2.廣東醫科大學惠州第一臨床醫學院,廣東 惠州 516000)

缺氧誘導因子(HIFs)家族是參與調節細胞代謝的細胞因子,在腫瘤的發生發展過程中起重要作用。HIFs的主要功能包括促進腫瘤發生、血管生成、生長、轉移、調節腫瘤細胞增殖、抑制細胞凋亡、調控能量代謝密切相關[1]。HIFs高表達于腫瘤組織,分布于腫瘤微環境,與多種腫瘤細胞的上皮-間質轉化(EMT)過程相關[2]。Notch信號通路通過與EMT相關的轉錄和生長因子發生串擾,參與多種腫瘤細胞的 EMT過程[3]。HIFs可能直接或間接通過Notch信號通路在包括肝細胞癌(HCC)在內的腫瘤細胞 EMT 過程中發揮效應?，F對HIFs促進腫瘤細胞 EMT,特別是對HCC EMT的調控作用及Notch信號通路在該過程的可能作用進行簡要綜述,為探索腫瘤新的治療靶點提供依據。

1 HIF生物學特性及其與腫瘤進展的關系

1.1HIF 的生物學特性 1991年,SEMENZA和WANG在實驗研究過程中發現一種缺氧誘導性核因子,其能與促紅細胞生成素基因的啟動子結合并增加其表達[4],在1995年確定這種核因子為HIFs,此后學者們開始廣泛對HIFs進行更為深入的研究。HIFs是一種異源二聚體轉錄因子,其包含3個主要的氧不穩定HIF-α亞單位(HIF-1α、HIF-2α和HIF - 3α)和1個組成型HIF-β亞單位(也稱為“ARNT”,包括ARNT1/2/3)[5]。α亞基的分子量是120×103～130×103;β亞基的分子量為91×103～94×103,α和β亞單位都屬于轉錄因子的基本家族,包括螺旋-環-螺旋和PAS結構域,介導異二聚化和DNA結合。HIF-1α和HIF-2α的羧基末端結構域由調節其穩定性(氧依賴性降解結構域)和轉錄活性(2個反式激活結構域,N-TAD和C-TAD)的結構域組成。此外,α亞單位的C-和N-末端都有核定位信號,將它們導向細胞核[6-7]。HIF-1α和HIF-2α具有48%的氨基酸序列同一性和相似的蛋白質結構,它們主要在N-TAD結構域內不同,而HIF-3α在螺旋-環-螺旋和PAS結構域與HIF-1α和HIF-2α相似,但缺少C端反式激活結構域[8]。HIFs與其受體結合后產生生物學效應,3個HIF-α亞單位都表現出氧調節蛋白的穩定性,在正常氧濃度下,羥化酶、脯氨酸羥化酶和抑制HIF-1對α亞單位進行多泛素化和降解并保持低HIF蛋白水平和轉錄活性[9]。而在缺氧情況下,HIF-α亞單位被穩定并轉運到細胞核,與HIF-β形成異二聚體,并結合靶基因調節元件內的缺氧反應元件,激活數百個對低氧耐受的基因并驅動低氧反應元件基因轉錄,以促進腫瘤的發生發展[10]。

1.2HIFs在腫瘤組織中的表達及其作用 近年來越來越多的實驗表明,HIFs與促進腫瘤發生、血管生成、生長、轉移、調節腫瘤細胞增殖、抑制細胞凋亡、調控能量代謝密切相關[11-12]。腫瘤為了在缺氧條件下存活,主要通過與缺氧轉錄因子的協同作用重新編程其新陳代謝、蛋白質合成和細胞周期進程,從HIFs的機制上講,其主要通過調節編碼水解糖酶的基因,血管生成信號基因和細胞凋亡/應激反應基因來調節癌細胞生長。在肺癌中,學者BECKER等[13]在研究中發現HIF-1α介導缺氧誘導的內皮細胞miR-186表達下調,進而通過上調蛋白激酶Cα促進非小細胞肺癌血管生成。而在XIONG等[14]研究中證實,HIF-1α和HIF-2α在缺氧條件下通過Sox2和Oct4調節非小細胞肺癌去分化,增加腫瘤的惡性增殖。缺氧信號與細胞信號通路相互作用以改變癌細胞惡性行為,腎透明細胞癌變體是最常見的腎上皮惡性腫瘤,攜帶Von Hippel-Lindau基因失活突變的患者使Von Hippel-Lindau基因功能喪失,進而導致HIF-2α通過激活缺氧敏感信號通路和HIF-2α靶基因的過表達來驅動腫瘤進展和轉移,從而促進致癌潛力[15]。HIF-2α信號在2種人類結腸癌衍生細胞系中在氧氣充足時被明顯抑制,降低了集落形成、遷移和侵襲的活性。當以HIF-2依賴性方式補充外源乙酸鹽時,人類結腸癌衍生細胞系的側腹腫瘤在小鼠體內表現出增強生長[16]。而在乳腺癌的研究中,HIFs高表達,HIF-1α通過上調靶基因PLXNB3,進而誘導MET/SRC/FAK和 MET/SRC/STAT3/NANOG 信號傳導,增強乳腺癌細胞遷移、侵襲和癌癥干細胞增殖[17]。在Natalie的研究中,缺氧條件下使用甲苯咪唑在蛋白質水平上阻止HIF-1α、HIF-2α和HIF-1β的誘導作用,起到了抑制乳腺癌細胞系和乳腺癌臨床前模型中HIFs轉錄活性的效果,進而降低了腫瘤的侵襲性,進一步體現了HIFs的促癌作用[18]。而在胃癌中,與其他幾種腫瘤相似,HIF-1α的高表達與胃癌的惡性表型和生存率下降高度相關[19]。

1.3HIFs在HCC中的表達及作用 HIFs和HCC之間的關系極其復雜,兩者涉及腫瘤代謝、免疫逃逸、血管生成、轉移、細胞外基質重塑和癌癥干細胞的活性。其中,HIFs調節HCC的代謝及腫瘤免疫逃逸的機制,HIFs主要通過以下3種機制調節腫瘤細胞的代謝以促進腫瘤發展:(1)通常與Warburg效應有關,HIF-1α增加葡萄糖代謝和糖酵解中關鍵酶的活化,進而促進代謝[20];(2) HIF-1α誘導幾種糖酵解蛋白亞型的過度表達和活性增加,包括GLUT1和GLUT3[21];(3)HIF-1的轉錄活性增加了線粒體相關酶的表達,因此降低線粒體的氧化磷酸化水平和氧消耗[22]。而在腫瘤免疫逃逸中,HIFs誘導腫瘤細胞對CD8細胞毒性T淋巴細胞和自然殺傷細胞產生的抗性,其中涉及的機制包括抑制凋亡和激活自噬[23-25]。此外,缺氧可以上調產生腺苷的胞外酶CD39和CD73的表達,結合其A2A受體強烈抑制活化的CD8細胞毒性T淋巴細胞和自然殺傷細胞的抗腫瘤功能[26]。HIFs還可以通過作用于巨噬細胞滲透腫瘤微環境來抑制針對腫瘤的免疫反應[27]?？傊?HIFs在不同惡性程度的HCC組織中過度表達,通過包括上述的多種途徑綜合影響腫瘤細胞進展,腫瘤分級越高,其表達水平越高,疾病預后越差。

2 HIFs與EMT的關系

2.1EMT在腫瘤侵襲轉移中的作用 EMT是指上皮細胞中發生的形態學變化,固定的細胞脫離基膜變得可遷移,如細胞頂端-基底極性的喪失及緊密連接、黏附連接和橋粒的解體、細胞黏附分子,特別是對上皮細胞連接和根尖基底極化有重要作用的E-鈣黏蛋白被下調等[28]。相反,波形蛋白、纖連蛋白和N-鈣黏蛋白上調,促進向運動狀態的轉變,進而打破了上皮細胞之間及細胞和細胞外基質之間的內聚性結構完整性的特征,使這些細胞獲得運動能力,同時這也是惡性腫瘤發生侵襲和轉移的重要細胞學基礎[29]。腫瘤細胞EMT對于獲得腫瘤干細胞樣特性至關重要,包括自我更新、抗凋亡、腫瘤進展和轉移[30]。腫瘤細胞受到多種EMT誘導因子(如鋅指轉錄因子、Twist轉錄因子、生長因子)及涉及多種信號通路(如Annexin1/Vimentin/S100A9、Wnt/β-catenin、CXCL8/FAK、TGF-β1/Smad2/MMP-9、Notch1、JAK2信號轉導與STAT3信號通路等)調節EMT,進而促進惡性腫瘤的轉移及侵襲[31-36]。上述這些通路并非處于絕對獨立的狀態,而是彼此產生相互促進或抑制的疊加作用,進而影響腫瘤特性作用。

2.2HCC細胞EMT的特性 EMT的作用特性給予了腫瘤細胞極強的遷移和侵襲能力,這也決定了EMT在惡性上皮性腫瘤的侵襲和轉移中起關鍵作用。HCC源于肝臟細胞上皮性腫瘤,具有典型的上皮細胞特征,HCC中的EMT過程在決定腫瘤惡性程度上有著舉足輕重的地位。HU等[37]研究發現,MAP4和GSK3β相互作用誘導的β-連環蛋白活性的上調可能是加速HCC細胞EMT效應的原因,MAP4通過調節GSK3β/β-連環蛋白途徑促進HCC細胞EMT的過程,進而促進HCC的遷移及侵襲。有研究表明,癌癥相關成纖維細胞在誘導化學耐藥性中起重要作用,癌癥相關成纖維細胞衍生的SPP1通過整合素-蛋白激酶Cα信號通路,激活致癌信號和EMT,促進增強HCC的耐藥性[38]。我國學者發現,FBXO43在HCC患者組織中上調,并與不良臨床病理特征呈正相關,同時,FBXO43高表達的HCC患者總生存期和無病生存期較短,研究者敲除FBXO43抑制了HCC細胞的EMT過程,證明FBXO43與細胞周期蛋白D1相互作用,通過多泛素化促進其穩定性,加速其EMT,促使HCC細胞增殖遷移[39]。以上證據表明,HCC細胞的EMT中涉及多種信號通路傳導及轉錄因子,多種因素可以通過介導EMT過程來影響HCC的遷移、侵襲、耐藥等,這進一步證明了EMT是HCC調控的關鍵步驟,同時也間接提示了這些信號通路及轉錄因子可能作為肝癌轉移的預測性分子標志物及肝腫瘤治療的分子靶標,為腫瘤治療的精準性、靶向性提供新思路。

2.3HIFs與EMT的關系 EMT中關鍵信號通路的表達是代謝異常類型的主要調控因子,HIF-α就是其中之一,異常的腫瘤代謝促進EMT和轉移能力,EMT也能夠反向調節癌癥代謝,通常情況下,HIF-α作為調節2個生物學過程的連接分子,同時賦予癌細胞惡性表型[2]。缺氧條件誘導EMT的發生,HIF與多種基因啟動子上的缺氧反應元件結合,開始調節蛋白質的表達并啟動EMT過程,其控制細胞骨架蛋白的表達并改變細胞的動態能力[40]。如在前列腺癌的研究中[41],HIFs下調上皮細胞標志物E-鈣黏蛋白的表達,并上調N-鈣黏蛋白,改變細胞骨架蛋白結構,增加癌細胞上雄激素受體的表達,促進腫瘤細胞EMT,維持前列腺癌的生長和存活,以及其去勢抵抗性的發展,這種轉化發生在癌細胞失去細胞間黏附并開始侵襲和轉移時刻,激活不同的信號通路取決于缺氧的不同程度,促進腫瘤進展的同時保持前列腺癌細胞的自我更新、潛能和抗凋亡功能。

另一方面,缺氧條件是腫瘤干細胞保持干細胞干性的重要機制,通過TGF-β、Notch和Wnt-β-連環蛋白信號通路等刺激癌細胞中EMT轉錄因子Snail、Twist、Zeb1、Slug和Sip1的表達,在缺氧條件下積累這些因子與增強子盒結合進而增強EMT,與此同時這些EMT轉錄因子反過來誘導干細胞標記物的轉錄[42-43],進而促進腫瘤的侵襲和轉移。

3 Notch信號通路與EMT、HIF的關系

3.1Notch 信號通路及其生物學作用 Notch 信號通路是一種生物進化中高度保守的信號轉導通路,參與多種疾病的發生發展,在多種細胞的增殖、分化和凋亡,以及腫瘤發生、侵襲和轉移中發揮重要作用[44]。在哺乳動物中,有4種Notch受體(Notch1/2/3/4)和5種配體(DLL1、DLL3、DLL4、Jagged1、Jagged2)。典型的Notch信號傳導是由g-分泌酶介導的Notch受體裂解啟動的,導致Notch細胞內活性結構域的釋放,其遷移到細胞核并與CSL相互作用,導致下游靶基因的激活,不同的配體可以在信號接收細胞中產生不同的Notch活性動力學,通過激活不同的靶基因程序誘導不同的細胞命運[45]。有研究顯示,在HCC患者中,Notch1的表達與預后不良呈正相關,激活的Notch信號通路促進HCC細胞的干性,再次證明Notch信號通路的促癌作用[46]。此外,Notch信號通路已被證實參與多種人類惡性腫瘤生長遷移及侵襲過程,包括腎癌、乳腺癌、膀胱癌、肺癌及結直腸癌等。

3.2Notch 信號通路與EMT的關系 Notch可以通過與EMT相關的非編碼RNA發生串擾,協調腫瘤細胞的EMT過程,進而干預腫瘤進展過程。YAN等[47]在實驗研究中證明,長鏈非編碼RNA ILF3-AS1通過miR-628-5p/meis 2軸激活Notch通路促進HCC細胞遷移、侵襲和EMT過程。LI等[48]研究發現,miRNA-139-5p可以在體內外通過Notch1信號靶點對膠質瘤的腫瘤活性起到抑制作用,作用機制包括:(1)miRNA-139-5p通過抑制Notch1,導致Snail的下降,從而抑制腫瘤EMT、侵襲和轉移;(2)miRNA-139-5p降低N-鈣黏蛋白、波形蛋白和纖連蛋白的活性及表達,而上調E-鈣黏蛋白。類似地,CHEN等[49]使用miRNA-424-3p對垂體腺瘤細胞的作用進行了另一項研究,其證明過表達的miRNA-424-3p對靶點Jagged1的負性作用,并隨后降低MMP-2和波形蛋白進而抑制腫瘤細胞EMT、增殖和轉移。

此外,Notch信號通路也可以通過與EMT相關的轉錄和生長因子(如Snail、Slug、Twist1、TGF-β1等)調控腫瘤細胞的EMT過程。TGF-β1是一種參與細胞分化、增殖和凋亡的多功能細胞生長因子,YAZAKI等[50]研究證明了ROS-Nrf2通路通過激活Notch信號通路介導TGF-β1誘導的上皮間質轉化,揭示了Notch信號在TGF-β1誘導的EMT發展中的關鍵作用。在膽管癌研究[51]中,膽綠素還原酶B耗竭加速膽管癌的EMT,膽綠素還原酶B受抑制激活了Notch信號傳導,并通過上調Snail表達水平進一步增強Notch信號通路促進EMT,從而增加膽管癌中的細胞遷移和侵襲。Notch1信號靶點可以通過調控EMT轉錄因子Twist下調E-鈣黏蛋白的表達,上調波形蛋白和N-鈣黏蛋白的表達,進而促進EMT[52]。而Slug可以通過調節血管內皮細胞中的Dll4-Notch-VEGFR2軸,進而控制內皮細胞活化和血管生成,調節EMT[53]。

3.3Notch信號通路與HIF的關系 Notch信號通路在控制細胞命運起著關鍵作用,HIF信號通路是對缺氧的生理和病理反應中的主要調節器,Notch信號傳導和缺氧之間的聯系首次被提及是在J?GI等[54]的實驗研究中,該實驗發現Notch靶基因Hes1在缺氧的神經母細胞瘤細胞系中被上調。此外,IRSHAD等[55]在對膠質母細胞瘤中Notch和缺氧激活基因的研究中也證實了這2種途徑的聯合基因特征及其在影響腫瘤不良預后中的作用。

HIFs作為細胞缺氧反應的全局調節因子,可以與Notch相互作用,直接調節Notch信號通路,Notch信號與細胞缺氧反應之間的交叉協同作用會促進不同癌癥的進展,作用機制主要是HIF-α被招募到Notch反應性啟動子,并與Notch胞內結構域相互作用,導致Notch胞內結構域的穩定和Notch下游基因的激活[56]。另外有研究發現,低氧誘導的Notch配體(如Jagged2和DLL4)的上調導致Notch信號的激活,也是兩者產生直接協同作用的關鍵機制[57-58]。值得注意的是,HIFs除了能夠直接調節Notch信號通路,也可以對Notch信號起到間接調控作用,如在關于肺癌的研究中,HIF介導的miR-1275上調發揮了致癌作用,通過共同激活Notch和Wnt/β-catenin信號傳導途徑,進而促進肺癌的發生發展。另一方面,Notch信號也可以調節缺氧反應,Notch可以通過HIF-1α到HIF-2α的轉換在某些腫瘤細胞中轉錄上調HIF-2α的表達[59]?？偠灾?Notch信號和細胞缺氧反應之間的串擾是廣泛的,兩者相互作用的機制復雜,Notch-hypoxia串聯已經參與了各種生理和病理過程。

4 小結與展望

在HIFs家族里,雖然不同的α亞基在機體不同器官部位表達的作用有所差異,但在HCC等腫瘤細胞EMT過程中發揮重要作用。Notch信號通路參與機體代謝,不僅在細胞增殖、分化和凋亡過程發揮重要作用,以及在參與調控癌癥相關通路具有極強的復雜性,并與 EMT和HIFs有密切關聯,在HIFs促進HCC等腫瘤細胞EMT過程中起重要作用。因此,研究HIFs對HCC等腫瘤EMT的調控作用及其相關可能的機制,探討Notch信號通路在此過程中的作用,對抑制HCC等腫瘤的進展,改善患者預后具有良好應用前景,有望為優化HCC等腫瘤的治療和制訂新的治療策略提供依據。