兩種不同氣候類型下釀酒葡萄果實有機酸代謝的比較分析

李帥 馮銘鑫 雷煜璐 白世踐 孟江飛 許騰飛

摘 要 有機酸是葡萄果實中重要的風味化合物。在漿果發育過程中，環境溫度會影響有機酸的積累。以釀酒葡萄‘赤霞珠和‘馬瑟蘭為試材，比較了新疆鄯善為代表的的炎熱氣候與山西鄉寧地區為代表的冷涼氣候兩種栽培條件下葡萄果實中有機酸積累的差異。結果表明，山西鄉寧葡萄果實更大，果粒百粒質量、橫縱徑均高于鄯善產區；鄯善地區葡萄可滴定酸含量顯著低于鄉寧，pH則高于鄉寧。轉色前有機酸持續積累，包括酒石酸、蘋果酸及少量檸檬酸；轉色后鄯善和鄉寧葡萄果實可滴定酸分別降低84.8%和78.5%，其中以蘋果酸的降解尤為顯著。鄯善地區成熟葡萄果實酒石酸含量保持在7.23～8.96 mg/粒，鄉寧葡萄果實酒石酸含量顯著高于鄯善，達到9.06～10.75 mg/粒；在葡萄發育的整個周期，鄉寧葡萄果實中酒石酸、蘋果酸和抗壞血酸含量均高于鄯善，兩個供試品種表現趨勢一致。此外，相較于蘋果酸合成與降解相關基因，液泡膜質子泵基因VvVHP在響應高溫轉運蘋果酸并改變可滴定酸含量中可能發揮了更關鍵的作用。

關鍵詞 釀酒葡萄；有機酸；高溫；基因表達

葡萄（Vitis vinifera L.）是世界上廣泛栽培的水果之一，具有適應性強、味道鮮美、經濟價值高的特點。根據國際葡萄與葡萄酒組織（OIV）的統計報告，2020年全球葡萄園面積為7.33 Mhm2，其中中國的葡萄園表面積為7.85? khm2，占世界面積的10.7%（OIV， 2020）。葡萄漿果含有豐富的化合物，糖、酸和酚類物質的存在會顯著影響葡萄和葡萄酒的感官質量[1]。其中，有機酸調節著“酸堿平衡”，會影響葡萄漿果的口感和葡萄酒的風味。有機酸的積累和調控是葡萄品質控制的一個重要方面。

葡萄中有機酸種類豐富，Kliewer[2]在葡萄漿果中發現了近23種有機酸，其中酒石酸和蘋果酸含量最高，檸檬酸較少，其他有機酸含量都極低[3-4]。L-酒石酸（2，3-二羥基丁二酸）是葡萄屬和天竺屬植物中特有的有機酸，多存在于葉片與果實中[5]。研究認為，酒石酸主要以抗壞血酸為基礎，經過五或六步生化反應形成，目前鑒定到的兩種關鍵合成途徑酶為L-艾杜糖酸脫氫酶（L-IdnDH）和2-酮-L-古洛糖酸還原酶（2-KGR），酒石酸合成中其他相關酶還需進一步發掘[5-7]。L-酒石酸在植物中的生物功能尚不明確，但在葡萄酒風味、微生物穩定性等方面具有重要貢獻[8-9]；Zhao等[10]的研究表明，酒石酸化合物可通過改變蛋白質-多酚配合物之間的氫鍵和疏水鍵，形成三元配合物，使蛋白質結構拉伸，影響葡萄酒的澀味。與酒石酸不同，作為光合作用的早期產物，蘋果酸是許多植物代謝物和化合物的前體，并能夠為不同細胞組織中發生的不同代謝途徑傳遞電子；通過TCA循環和乙醛酸循環，蘋果酸能夠轉化為檸檬酸或其他二羧酸從而改變果實細胞酸度[11]。作為葡萄果實中第二種主要有機酸，蘋果酸參與植物細胞代謝并在控制葉片氣孔孔徑，改善植物營養和增加對重金屬毒性的抵抗力等方面發揮作用[12]。

除了少量關于光照[13]、干旱[14]和嫁接砧木[15]的報道外，人們認為酒石酸的積累不受脅迫和環境或栽培管理措施的影響；然而，在具體實踐中不同地區葡萄中酒石酸含量存在很大差異[16]。蘋果酸和檸檬酸對環境因素很敏感，研究表明，如植物庫源關系[17]、灌溉[18-19]和溫度[20]等均影響蘋果酸和檸檬酸的積累。葡萄果實中的有機酸含量取決于品種特性、外部栽培方式和自然環境的相互作用；溫度是影響葡萄中有機酸積累的重要環境因素[21]。高溫破壞了植物的一些代謝途徑，導致對葡萄品質至關重要的必需化合物的生物合成發生改變。研究表明，積溫每升高100 ℃，有機酸含量降低0.03%～0.08%；平均溫度每升高? 1 ℃，有機酸含量降低0.04%～0.08%[22]。雖然蘋果酸代謝隨溫度升高而增加，但當溫度達到? 40 ℃時，蘋果酸含量急劇下降[23]。高溫改變了葡萄有機酸的積累進而影響了葡萄酒的品質。然而，在冷涼與炎熱兩種氣候類型條件下釀酒葡萄不同有機酸的代謝差異仍不清楚。因此，本研究旨在通過比較以新疆鄯善為代表的炎熱氣候和山西鄉寧為代表的冷涼氣候下葡萄果實有機酸積累變化，闡明高溫對葡萄果實發育過程中有機酸生物合成和降解的影響，為揭示高溫調控葡萄有機酸合成和代謝的分子機制提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與生長條件

供試材料分別為新疆鄯善（42.87°N，?? 90.21°E）和山西鄉寧（35.97°N， 110.85°E）地區（圖1）的釀酒葡萄品種‘赤霞珠（Vitis vinifera cv.Cabernet Sauvignon）與‘馬瑟蘭（Vitis vinifera cv.Marselan）。葡萄樹于2011年種植，南北行向，間距為1.2 m× 3.0 m，‘廠字形樹形，兩地葡萄園管理方式基本一致。

1.2 樣品采集

參考Coombe[24]的改良E-L系統，采集EL29、EL32、EL35、EL36和EL38這5個不同發育階段的漿果。每次取樣從葡萄樹的兩側分別采集4串葡萄；從每串葡萄的不同部位采集3粒葡萄，并立即在液氮中冷凍，于-80 ℃冰箱保存， 待測。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 生長發育指標 隨機選取100粒葡萄果實，采用數顯游標卡尺測定橫縱徑，采用電子天平稱單粒質量，重復3次，結果取平均值。

1.3.2 品質指標 隨機選取100粒葡萄果實揉碎過濾取汁，采用數顯糖度計測定可溶性固形物含量；采用酸度計法測定果實pH；采用斐林試劑熱滴定法測定還原糖含量；采用氫氧化鈉滴定法（參照GB／T 15038-2006）測定可滴定酸含量，每次試驗重復3次，結果取平均值。

1.3.3 有機酸的提取 取部分葡萄樣品在液氮中研磨成粉末。每個樣品精確稱量1 g，加入10 mL 0.02 mol/L的KH2PO4溶液（pH=2.8）?；旌衔镌?5 ℃水浴中以300 W功率超聲處理30 min，然后在 4 ℃下10 000 r/min離心20 min。用0.22 μm的濾膜過濾上清液，用于高效液相色譜 （HPLC）分析。

1.3.4 HPCL色譜條件 采用WATERS系列高效液相色譜儀，Athena C18-WP色譜柱（150 mm × 4.6 mm × 5 mm）。流動相為0.02?? mol/L? KH2PO4（磷酸調節pH至2.8），流速為0.5 mL/min，恒溫40 ℃。施用光電二極管陣列 （PDA）進行檢測，波長為 210 nm。

1.3.5 總RNA分離及定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR） 總RNA的提取使用Pure Plant RNA制備試劑盒（百泰克生物技術有限公司，北京），對提取的總RNA進行瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度檢測。使用Revert Aid first strand cDNA synthesis kit合成試劑盒（諾唯贊生物科技有限公司，南京）進行反轉錄 （1 000 ng總RNA）。qRT-PCR分析采用ABI QuantStudio 6 Flex熒光定量PCR系統（Life Technologies， Carlsbad， 美國）檢測有機酸生物合成相關基因的表達水平。使用引物見表1。采用兩步qRT-PCR試劑盒（諾唯贊生物科技有限公司，南京），按照廠家說明書對每個樣品進行3次分析。數據分析采用2-ΔΔCT法[25]。

1.4 數據統計與分析

采用Microsoft Excel 2016進行數據統計與處理，使用IBM SPSS Statistcs 25 進行單因素方差分析，顯著性分析采用LSD（L）和Duncans（D）進行假定方差齊性檢驗，P<0.05表示差異達到顯著水平。

2 結果與分析

2.1 鄯善和鄉寧地區葡萄果實生長發育變化

新疆鄯善和山西鄉寧地區2021年的日平均溫度（℃）、日降水量（mm）、峰值日照時數（h）等氣象信息如圖1所示，鄯善地區葡萄生長季（4月—10月）月均溫較鄉寧地區高4.76 ℃，最高月均氣溫為33.12 ℃，單日最高氣溫可達44.11 ℃。在葡萄生長季節，鄯善地區共有34 d日最高氣溫超過37 ℃，而鄉寧無單日溫度超過37 ℃。表2為兩個地區‘赤霞珠和‘馬瑟蘭葡萄5個不同發育階段葡萄漿果生長發育指標參數。葡萄果實橫縱徑隨果實生長發育呈現先快速增加后逐漸穩定的趨勢，百粒漿果質量也持續增加。山西鄉寧葡萄果實發育速度更快，且在整個葡萄發育周期中，鄉寧地區葡萄百粒質量、橫縱徑均高于鄯善產區，兩個品種表現趨勢一致。

2.2 鄯善和鄉寧地區葡萄果實品質指標的差異分析

由圖2可知，在葡萄果實發育過程中，果實還原糖含量和可溶性固形物隨果實發育逐漸增加，EL35（轉色開始）階段開始加速積累，山西鄉寧地區葡萄果實還原糖含量積累速度較快，但在采收時，兩地區葡萄還原糖與可溶性固形物含量相差較小，差異并不顯著。轉色后果實可滴定酸含量迅速下降，其中新疆鄯善‘馬瑟蘭葡萄果實可滴定酸含量變化最大，較最大值降低88.3%；鄯善‘赤霞珠可滴定酸含量下降81.6%；山西鄉寧‘赤霞珠下降79.7%；山西鄉寧‘馬瑟蘭下降80.9%；新疆鄯善下降幅度均高于山西鄉寧。鄯善地區葡萄可滴定酸含量顯著低于鄉寧，pH則高于鄉寧；且轉色期之后，鄯善地區葡萄果實pH迅速升高，‘赤霞珠與‘馬瑟蘭葡萄果實pH分別在轉色階段提高32.9%和? 39.8%。結果表明在達到相應技術成熟度時，新疆鄯善地區的有機酸含量更低。

2.3 鄯善和鄉寧地區葡萄果實有機酸含量的差異分析

如圖3所示，總體來看‘赤霞珠與‘馬瑟蘭葡萄在兩個地區的有機酸含量都存在較大差異，對于葡萄主要有機酸，鄉寧葡萄果實酒石酸和蘋果酸的含量高于鄯善，其他酸的含量在兩個地區也有顯著差異。葡萄中有機酸的積累主要發生在轉色前，尤其是酒石酸和蘋果酸，從EL29 （坐果期）至 EL35（轉色前）階段，對于赤霞珠葡萄，果實酒石酸含量在兩個地區增加了0.7～1.2倍，而蘋果酸含量則升高1.4～3.4倍；‘馬瑟蘭葡萄酒石酸含量在此階段兩個地區均增加了1.4倍左右；而蘋果酸含量增加約3.5倍。相較于‘馬瑟蘭，‘赤霞珠葡萄有機酸積累速率在兩個地區出現較大差異；鄯善地區葡萄有機酸含量增加速率快，但含量低，轉色后葡萄果實酒石酸含量保持在7.23～8.96 mg/粒，鄉寧地區葡萄果實酒石酸含量顯著高于鄯善，達到了9.06～10.75 mg/粒。在轉色之后酒石酸含量整體呈穩定趨勢，蘋果酸開始降低，鄉寧葡萄果實蘋果酸含量下降程度更高，‘赤霞珠與‘馬瑟蘭分別較最大值下降了66.6%和74.7%，且在采收階段，鄉寧葡萄果實蘋果酸含量低于鄯善，這在兩個品種中是一致的。轉色前，鄉寧‘赤霞珠葡萄中抗壞血酸含量呈略微下降趨勢，其余樣品中抗壞血酸和檸檬酸含量明顯升高，但整體變化不顯著（小于1 mg/粒）?！嘞贾槠咸褭幟仕岷吭谡麄€發育周期在兩地區沒有表現出顯著差異，而鄯善地區‘馬瑟蘭葡萄檸檬酸含量則顯著高于鄉寧。

2.4 鄯善和鄉寧地區葡萄果實有機酸相關基因表達的差異分析

通過查詢NCBI （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）數據庫，結合已發表的其他物種有機酸相關基因作為參考，篩選出9個基因，其中酒石酸代謝相關基因3個（列出來），蘋果酸代謝相關基因2個（列出來），抗壞血酸代謝相關基因1個（列出來），檸檬酸代謝相關基因1個（列出來），蘋果酸轉運相關基因2個（列出來）。采用NCBI數據庫設計引物進行qRT-PCR分析（表1）。

如圖4所示，以鄉寧地區EL29（坐果期）階段采樣的葡萄果實為對照，在葡萄的各個發育階段觀察赤霞珠與馬瑟蘭在兩個地區有機酸基因表達的變化。其中酒石酸合成基因Vv2KGR和VvIDH3在葡萄果實發育早期表達較高，但在葡萄果實轉色后（酒石酸合成結束）后，其轉錄仍然存在；VvIDH2在果實發育后期表達量顯著升高。VvcyMDH是蘋果酸合成關鍵基因，催化草酰乙酸向蘋果酸的轉化，在果實發育的大部分階段，鄯善地區赤霞珠與馬瑟蘭葡萄VvcyMDH的表達均高于鄉寧；VvNAD-ME催化蘋果酸脫羧形成丙酮酸，結果表明VvNAD-ME在葡萄果實發育過程中表達量逐漸增加。VvVHA-A與VvVHP是植物體內兩種重要的膜轉運蛋白，能夠引起的質子濃度梯度從而為物質的跨膜運輸提供驅動力，兩種質子泵的轉錄變化趨勢不同，葡萄成熟后VvVHP的表達量增加，其中鄉寧地區葡萄的表達量高于鄯善，這在馬瑟蘭品種中尤為顯著；新疆地區葡萄VvVHA-A基因表達量在果實發育過程中逐漸降低。VvGalLDH催化L-半乳糖-1，4-內酯合成抗壞血酸，其表達呈現先升高后降低的趨勢，且鄯善地區葡萄VvGalLDH的表達顯著高于鄉寧?？傮w而言，兩個地區赤霞珠與馬瑟蘭葡萄有機酸基因表達的變化呈現出不同表達模式。

3 討論與結論

中國東西跨度大，新疆鄯善與山西鄉寧地區氣候條件存在顯著差異，根據Xie等[26]的研究模型，新疆鄯善位于溫暖干旱氣候，光熱條件充足，但降水較少；新疆鄯善7-9月日照時數較山西鄉寧地區多出200～300 h[27]。在葡萄成熟階段，鄯善平均溫度較高，溫度的升高促進營養吸收，縮短繁殖周期，從而使漿果的發育階段向生長季節的溫暖月份轉移。本研究中，在達到相同的技術成熟度的條件下，新疆鄯善地區葡萄果粒大小及橫縱徑更小，表明新疆鄯善地區葡萄果實發育階段有向溫暖月份轉移的趨勢。葡萄果粒大小及橫縱徑的影響因素很多，除了光熱因素外，有研究表明水分狀況[28-29]等也可能改變葡萄果實大小。本研究發現新疆鄯善地區和山西鄉寧葡萄果實還原糖和可溶性固形物含量在果實發育的部分階段存在差異，但在EL36（轉色完成）階段后的差異較??；而有機酸的積累存在顯著差異，新疆鄯善葡萄果實可滴定酸含量低，pH更高，這與Xie等[26]在5個不同氣候特征地區檢測到的‘赤霞珠葡萄糖酸含量變化一致。結果表明，氣候因素對葡萄果實發育有顯著影響，鄯善地區炎熱干燥的氣候可顯著降低葡萄果實的酸含量。

葡萄是典型的酒石酸水果。酒石酸和蘋果酸占總酸的90%以上，此外還有少量檸檬酸、抗壞血酸、琥珀酸和其他有機酸[30]。本研究對4種主要的有機酸，包括酒石酸、蘋果酸、抗壞血酸和檸檬酸進行了定量分析。兩個地區的‘赤霞珠和‘馬瑟蘭葡萄果實在有機酸含量上都表現出很大的差異。對于兩種主要有機酸酒石酸和蘋果酸，在鄉寧地區的含量均高于鄯善，這在兩個品種中是一致的。研究表明，在葡萄發育的早期階段，適度升高溫度會加速漿果生長、蘋果酸和酒石酸的積累，然而當受到嚴重熱脅迫時，酒石酸和蘋果酸的合成就會受到抑制[31-32]。此外，兩個地區的其他酸水平也有顯著差異，結果表明在葡萄發育過程中，由于糖的積累和糖酵解作用的抑制，有機酸（主要為蘋果酸與檸檬酸）作為TCA循環和呼吸、糖異生、氨基酸相互轉化等途徑的重要碳源而被消耗；高溫加速葡萄漿果代謝，促進了有機酸的降解，是有機酸積累差異的主要因素。葡萄中有機酸的積累主要在轉色（EL35）前，尤其是酒石酸和蘋果酸水平的增加；轉色期是葡萄酸積累的轉折點，在此之后可滴定酸含量的顯著下降主要是由于蘋果酸含量的下降，而酒石酸在果實成熟后并不參與植物代謝在轉色后含量保持穩定，這與前人的研究結果是一致的[33]。在本研究中，抗壞血酸含量在轉色期間（EL35到EL36）含量突然增加，隨后在采樣前含量下降，由于抗壞血酸為酒石酸合成的前體，推測酒石酸合成在轉色期停止，從而中斷了抗壞血酸向酒石酸的轉化，導致其在轉色完成后大量積累。

2KGR和L-IDH是已知與酒石酸合成有關的酶；L-IDH有3種異構體， VvIDH3與酒石酸生物合成密切相關[5]。? Vv2KGR和 VvIDH3基因在葡萄果實發育早期表達較高，但在葡萄果實轉色完成后，其轉錄仍然存在。Wen等[34]對葡萄發育過程中IDH蛋白水平的變化進行研究，發現IDH水平在幼果期急劇上升，花后4～6周后達到峰值，隨后發育階段逐漸下降。磷酸烯醇丙酮酸（PEP）是糖酵解途徑中的一種中間體，可由磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（PEPC）催化生成草酰乙酸（OAA），再由胞質NAD依賴性蘋果酸脫氫酶（NAD-cyMDH）還原合成蘋果酸，VvNAD-ME在葡萄果實發育過程中表達量逐漸增加，并已被證明參與蘋果酸的降解[12]。在本研究中，鄯善地區‘赤霞珠與‘馬瑟蘭葡萄VvcyMDH的表達均高于鄉寧，但并未觀察到蘋果酸含量相應升高，表明有機酸含量可能與降解及轉運基因更相關。液泡膜質子泵H+-PPase（VHP）和H+-ATPase（VHA）通過調節細胞膜的電位，控制細胞內離子的濃度，從而驅動蘋果酸和其他有機酸在植物液泡中的積累與轉運。鄉寧地區葡萄VvVHA和VvVHP基因表達量顯著高于鄯善，這與有機酸表型結果一致。鄯善地區葡萄VvVHA基因表達量在發育過程中增加，但在成熟過程中迅速降低，而VvVHP基因則在葡萄轉色后期表達量相對升高。研究表明，VvVHP無法酸化pH超過3.7的液泡，成熟過程中液泡pH的增加與有機酸含量（主要為蘋果酸）的降低可能是由于VvVHA被VvVHP所取代，從而導致新疆地區較低的有機酸含量[35]。GalLDH是植物中催化抗壞血酸生物合成最后一步（L-半乳糖途徑）的關鍵酶。在鄯善地區，VvGalLDH表達量較高，抗壞血酸和酒石酸含量較低。

本文研究了中國兩個氣候特征顯著不同的產區——炎熱的新疆鄯善和冷涼的山西鄉寧的‘赤霞珠和‘馬瑟蘭葡萄發育過程中有機酸及其相關基因的表達模式。結果表明，新疆鄯善和山西鄉寧葡萄果實酸的積累存在顯著差異，鄯善地區葡萄果實可滴定酸含量低，pH更高。兩個產區葡萄有機酸含量差異顯著，鄉寧地區葡萄酒石酸、蘋果酸和抗壞血酸含量均高于鄯善，這在兩個葡萄品種之間沒有差異。此外，與果實有機酸的合成和降解的相關基因不同，液泡膜質子泵H+-PPase基因VvVHP在響應高溫轉運蘋果酸并改變鄯善地區葡萄可滴定酸含量中可能發揮了更關鍵的作用。

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Comparative? Analysis of Organic Acid Metabolism in Wine Grape under Two Different Climatic Conditions

Abstract Organic acids，essential flavor compounds in grape berries，are influenced by ambient temperature during berry development.In this study，we compared the difference of organic acid accumulation under two distinct climate types：a hot climate represented by Shanshan in Xinjiang and a cold climate represented by Xiangning in Shanxi.‘Cabernet Sauvignon and ‘Marselan grape varieties were used as materials.The results showed that the grape fruit in Xiangning was larger than that in Shanshan，with significantly lower titratable acid content in grapes from Shanshan and higher pH levesl.Organic acids continued to accumulate before veraison，including tartaric and malic acid，as well as a small amount of citric acid.After veraison，the titratable acid content decreased by 84.8% in Shanshan grapes and 78.5% in Xiangning grapes，with significant degradation of malic acid.Tartaric acid content in ripening grape from Shanshan remained between 7.23-8.96 mg/berry，while that in Xiangning grape was significantly higher，ranging 9.06-10.75 mg/berry; during the grape development，Xiangning grapes exhibited higher levels of tartaric，malic，and ascorbic acids compared to Shanshan grapes，with both varieties showing similar trends.In addition，compared with genes related to malic acid synthesis and degradation，the vacuolar membrane proton pump gene VvVHP may play a more critical role in responding to high temperature to transport malic acid and change the content of titratable acid.

Key words Wine grape; Organic acid; High temperature; Gene expression