藜麥CqAMSlike基因的克隆與功能分析

張玉敏 林春 劉正杰 林彤 董玉梅 毛自朝

摘 要 為探究藜麥（Chenopodium quinoa，Willd.）花粉發育的分子機制，基于基因組和轉錄組數據，經同源比對及RT-qPCR表達分析等，預測藜麥中AMS候選基因并克隆其編碼序列，隨后經病毒介導的基因沉默（VIGS）及雙分子熒光互補（BiFC）法進行候選基因的功能驗證。結果顯示，藜麥中有 ?CqAMSlike1和 ?CqAMSlike2 兩個基因，其中 ?CqAMSlike1的CDS長1 929 bp，而 ?CqAMSlike2的CDS長1 920 bp，兩基因均在不同發育時期的圓錐花序中表達。與 ?CqAMSlike2相比， ?CqAMSlike1的表達更與AMS的表達模式相一致，而被進一步用于基因的功能驗證。與對照相比，基于煙草脆裂病毒（TRV）沉默 ?CqAMSlike1的藜麥兩性花出現部分花絲縮短、花藥不裂，花粉敗育，單株種子少，種子空癟率增加的表型。BIFC結果顯示CqAMSlike1自身，與 CqTDF1和CqMYB80均有互作，預示CqAMSlike1可形成同源或異源聚體調控藜麥絨氈層發育基因的表達。

關鍵詞 藜麥；AMS；病毒介導的基因沉默；花粉發育；蛋白互作

藜麥（Chenopodium quinoa Willd.，2n=? 4x=36）是莧科藜屬1 a生雙子葉植物，具有較高的營養價值[1]，并對多種非生物逆境脅迫具有較強的抗性，近年來備受關注[2-5]。然而藜麥花器官結構復雜、尺寸小，同一植株的花由大小不同的雌花和兩性花組成，比例受到遺傳和環境的影響，導致人工去雄難，雜交育種困難[6]。目前在自然界中很難找到藜麥的自然突變的雄性不育材料，因而研究其花粉發育相關基因是創制人工雄性不育材料的基礎。

花粉的敗育與絨氈層的發育密切相關，絨氈層的缺陷會直接影響植物花粉的育性[7]。目前，花藥發育的分子機制已在擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）等模式植物中開展了大量的研究[8]。在擬南芥中AMS（aborted microspores）基因一個編碼特殊bHLH家族的MYC2型的轉錄因子[9]，其表達異常會造成絨氈層異?？张莼?、小孢子退化[10]。AMS的表達受上游基因TDF1（defective in tapetal development and function 1）的調控[11-12]。TDF1基因編碼一個R2R3 YMB轉錄因子[13]，TDF1通過結合AACCT順式元件調控AMS的表達，并與AMS發生互作形成復合物調節下游基因的表達[14]；而AMS則可通過結合Ebox調節下游MYB80基因[15]。MYB80與TDF1均編碼一個R2R3 YMB轉錄因子[16]，YMB80也可以與AMS形成復合物而最終促進孢子發育[17]。在擬南芥中已闡明絨氈層發育后期的轉錄調控途徑[DYT1-TDF1（MYB35）-AMS-MS188（MYB80）-MS1][18]。

2017公布了高質量參藜麥考基因組[19]，為其基因發掘和利用創造了良好的基礎，但由于藜麥中較難建立遺傳轉化體系，基因功能驗證工作難以推進。目前病毒誘導基因沉默（Virusinduced gene silencing VIGS） 的方法已在茄科[20]和禾本科[21]的基因功能研究中得到廣泛應用，但在藜麥的研究中應用甚少。本研究為挖掘藜麥中AMS基因及其表達作用來闡明CqAMSlike基因在藜麥花藥發育過程中的作用，為藜麥雄性不育種質創制等提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料、質粒、菌種

以白藜麥（BW25）為材料，種植于22 ℃，光照時間16 h/8 h（光照/黑暗）的溫室環境。大腸桿菌 DH5α及農桿菌 GV3101宿主菌系均為云南農業大學特色小宗作物研究所保存；VIGS構建所用到的載體pTRV1、pTRV2 由云南農業大學植物保護學院李凡老師惠贈；蛋白質互作的雙分子熒光表達載體pBRVC、pAgVN由云南農業大學特色小宗作物研究中心提供。

1.2 方法

1.2.1 藜麥RNA提取及cDNA第一鏈合成 參閱試劑盒說明書，利用京艾德萊生物科技有限公司的EASYspin Plus試劑盒提取RNA，然后用全式金公司的TransScript Onestep gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒完成cDNA第一鏈的合成。

1.2.2 CqAMSlike1/2、CqTDF1和CqMYB80like1/2的生物信息分析 從NCBI下載藜麥及其二倍體（Chenopodium pallidicaule、Chenopodium suecium）的全基因組、蛋白質序列（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/datahub/assembly/GCF_001683475.1），以擬南芥bHLH和MYB家族為參照[22-23]構建藜麥以及藜麥二倍體的bHLH和MYB的系統進化樹。擬南芥bHLH和MYB家族的信息來自于Tair（https：//www.arabidopsis.org/），通過比對擬南芥AtAMS基因（AT2G16910.1）、 AtTDF1基因（AT3G28470.1）和AtMYB80基因（AT5G56110.1），預測藜麥AMS、TDF1和MYB80的同源基因。然后將藜麥以及二倍體藜麥同源基因與菠菜（Spinacia oleracea）、甜菜（Beta vulgaris）等物種已知確定功能的AMS、TDF1與MYB80用MEGA 10（https：//www.megasoftware.net/）構建系統進化樹。用ExPASy Proteomics ServerProtparam（http：//www.expasy.ch/tools/ protparam.htm1） 預測候選蛋白的理化性質，SignalP（http：// http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）進行蛋白質的信號肽和跨膜結構預測，CellPLoc 2.0（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/CellPLoc2/）進行蛋白亞細胞定位部位預測。

1.2.3 CqAMSlike、CqTDF1like和CqMYB80like基因的克隆 用SnapGene（https：//www.snapgene.cn/）軟件設計預測 ?CqAMSlike1/2、CqTDF1和CqMYB80like1/2的克隆引物（表1，用藜麥花序總RNA 反轉錄cDNA作為模板進行擴增，擴增片段與pUC57T Vector連接，轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞，進行陽性克隆篩選后送測序公司進行鑒定，分別將所獲質粒命名為pC57CqAMSlike1、pUC57CqAMSlike2、pUC57CqTDF1、pUC57CqMYB80like1 和 pUC57 CqMYB80like2。

1.2.4 CqAMSlike的表達模式分析 提取藜麥（顯序期、開花初期、盛花期、開花末期）花序和不同藜麥器官部位（根、葉、花）的RNA并反轉錄為cDNA作為模板，以藜麥的actin基因作為內參基因[24]進行qRTPCR擴增后，采用2-△△Ct的方法[24]分析 ?CqAMSlike1和 ?CqAMSlike2基因在藜麥不同發育期和不同器官部位的表達情況。

1.2.5 pTRV2CqPDS和pTRV2CqAMSlike1載體的構建 以藜麥葉片RNA 反轉錄的cDNA為模板擴增，上下游引物分別添加BamHI和EcoRI酶切位點（表2），擴增長度為461 bp的CqPDS；以質粒pC57CqAMSlike1為模板擴增長度為498 bp的 ?CqAMSlike1的片段。將純化的CqPDS、 ?CqAMSlike1片段與pTRV2載體同時用BamHI和EcoRI雙酶切，連接后，轉入大腸桿菌DH5α，提取陽性菌株質粒進行酶切驗證后獲得重組質粒TRV2CqPDS和TRV2CqAMS。采用電穿孔法（2 500 V）分別將重組質粒pTRV2CqPDS和TRV2CqAMS轉染到農桿菌GV3101中進行選擇培養，挑選單菌落進行PCR，挑選陽性菌株。

1.2.6 CqPDS和CqAMSlike1的VIGS沉默與表達量檢測 將目的片段載體（pTRV2CqPDS和pTRV2CqAMSlike1）、空載體pTRV2和農桿菌接種至含50 mg·L-1卡納霉素（Kan）和 50?? mg·L-1 利福平霉素（Rif）的 YEB 液體培養基中，28 ℃振蕩5 h，后用侵染液（1 mol·L-1 MgCl2、? 1 mol·L-1 MES貯存液、50 mmol·L-1AS貯存液、pH 5.6）進行重新懸浮。將含有目的片段農桿菌與含pTRV1的農桿菌（pTRV1/GV3101）按照1∶1進行混合，分別注射到藜麥葉片作為試驗組和陰性對照組；將沒有注射任何菌株的藜麥作為正常對照組。黑暗條件下放置48 h，轉至? 22 ℃，光照時間16 h/8 h（光照/黑暗）條件下培養。設計CqPDS和CqAMSlike1的TR-qPCR檢測引物（表1），用TR-qPCR檢測目的基因在不同處理中的相對表達量。

1.2.7 花粉活力的鑒定 采用0.5% TTC（2，3，5三苯基氯化四氮唑）染色法測定藜麥花粉生活力。將同一時期正常、陽性分別置于2 mL 的離心管中，滴加 TTC搖晃均勻后，置于37 ℃恒溫箱反應15 min后制片，在顯微鏡下觀察并統計花粉活力，每組試驗重復3 次，每次試驗選取3 個視野。

花粉活力= 著紅色花粉數 / 總花粉數×100%

1.2.8 BiFC載體構建與互作檢測 分別設計引物下游引入不同酶切位的引物（表2）， 以質粒pUC57 ?CqAMSlike1/2、pUC57 CqMS80like1/2和pUC57 CqTDF1為模板擴增相應目的全長CDS片段。將擴增的 ?CqAMSlike1/2片段分別用BamHI和SphI雙酶切，分別回收連入pAgVN載體，獲得表達CqAMSlike1、CqAMSlike2與venus蛋白N末端的融合蛋白；用SphI和EagI將需要連入的目的片段雙酶切，然后分別回收連入pBRVC載體，獲得CqAMSlike1、CqAMSlike2、CqMYB80like1和CqTDF1like與venus蛋白C末端融合表達載體?；瘜W合成的IAAL蛋白中互作的結構域 E3和K3編碼序列，分別插入pBRVC和pAgVN載體，獲得融合表達載體pBRE3VC和pAgK3VN，用于BiFC陽性對照[25]，以pAGVNvenus、pBRVCvenus的空白載體作為陰性對照。將構建的BiFC載體按照濃度? 1∶1混合共同轉入大腸桿菌DH5α感受態細胞中，均勻涂布于含有慶大霉素（Gen）? 50?? mg·L-1和卡那霉素（Kan）? 50 mg·L-1的LB固體培養基上37? ℃過夜篩選培養。用菌落PCR檢測單菌落，挑取陽性共轉化菌株。共轉化菌株于37? ℃， 200 r·min-1振蕩培養12 h后，? 換30? ℃，200?? r·min-1振蕩培養4～8 h。在載玻片上滴加少量甘油和菌液，混合后使用激光共焦聚顯微鏡（OLYMP FV 1000）觀察黃色熒光? 信號。

2 結果與分析

2.1 CqAMS、CqTDF1和CqMYB80基因的篩選、克隆及其生物信息分析

以擬南芥的bHLH和MYB家族的蛋白質序列為參照，篩選并構建藜麥及藜麥二倍體的相應基因家族系統進化樹。藜麥的bHLH基因家族分為14個亞家族（圖1-Ⅰa），而MYB基因家族分為13個亞家族（圖1-Ⅰb）。其中與擬南芥AtAMS相近的基因有11個序列，包含6個藜麥基因（AUR62013022RA、AUR62013021RA、AUR62010033RA、AUR62010034RA、AUR620-05378RA、AUR62014049RA ）；與擬南芥AtTDF1相近藜麥基因有4個序列（AUR62-026937RA、AUR62030563RA、AUR62026949RA、AUR62018324RA）；與擬南芥AtMYB80基因相近的藜麥基因有2個（AUR62017171RA和AUR62035635RA）。用Hisat2[26]對藜麥（BW25）不同發育時期花序的轉錄組數據與基因組序列進行比對，用IGV（Integrative Genomics Viewer）[27]可視化展示后發現， AUR62013022RA和AUR62013021RA、 AUR62010033RA和AUR62010034RA之間存在分離比對，確定AUR62013022RA、AUR62013021RA在一條CDS上（圖1-Ⅲa），命名為 ?CqAMSlike1，全長CDS為1 929 bp；同理，AUR62010033RA和AUR62010034RA在另一條CDS上（圖1-Ⅲb），命名為 ?CqAMSlike2，長度為1 920 bp。進一步將矯正的基因（CqAMSlike1/2）與菠菜和甜菜的AMS、TDF1和MYB80基因進行同源性比對，結果表明： ?CqAMSlike1和 ?CqAMSlike2與菠菜和甜菜的AMS基因有較高的同源性，并且兩條基因編碼的氨基酸序列具有93.77%的相似性，將其作為候選基因進行后續試驗，其中 ?CqAMSlike1與 ?CP022004、 CqAMSlike2和Csue 04968RA具有較高同源性（圖1-Ⅱa）。CqMYB 80like 1（AUR62017171RA）、CqMYB 80like 2（AUR62035635RA）與菠菜和甜菜的MYB80基因也具有較高的同源性，并且兩條基因編碼的氨基酸序列具有98.73%的相似性（圖1-Ⅱb）；進一步分析確定藜麥中僅有一條CqTDF1（AUR62008324RA）與甜菜和菠菜的TDF1具有相似的同源性（圖1-Ⅱb）。

藜麥 ?CqAMSlike1基因位于17號染色體，包含有8個外顯子 （圖1-Ⅳa），編碼642個氨基酸，蛋白質分子質量73.432 ku，等電點5.60； ?CqAMSlike2基因位于15號染色體，也包含有8個外顯子，（圖1-Ⅳb），編碼639個氨基酸，其蛋白質分子質量73.139? ku，等電點5.72。CqMYB80like1、CqMYBlike2基因的CDS全長951 bp（圖1-Ⅳc、d），CqMYB80like1位于2號染色體，CqMYB80like2位于1號染色，都含有3個外顯子，編碼316個氨基酸，其蛋白質分子質量35.160 ku，等電點6.76。CqTDF1基因位于16號染色體上，含有3個外顯子，CDS全長1086bp（圖1Ⅳ5），編碼361個氨基酸，蛋白之分子質量為40.000 ku，等電點5.94。預測分析發現，這些基因都含有核定位信號，用CellPLoc 2.0預測，都定位在細胞核內。信號肽預測顯示，這些蛋白沒有信號肽，這些特征與他們作為轉錄因子的功能相一致。

2.2 ?CqAMSlike基因在藜麥植株不同生育時期及不同組織的表達特性

如圖2所示，藜麥植株從顯序期（花序剛出現）到末花期 ?CqAMSlike1/2基因的表達明顯不同。其中 ?CqAMSlike1隨著花發育進程的推進，基因的表達呈先升高后降低的趨勢，在初花期階段達到最高，末花期最低（圖2-Ⅰ）； ?CqAMSlike2基因的表達未發生變化，總體表達低于 ?CqAMSlike1。不同組織的表達分析表明， ?CqAMSlike1基因在藜麥花序中表達較高，在葉片和根中的表達較低，與擬南芥AMS表達模式相似，從而推測， ?CqAMSlike1可能在藜麥花粉發育中起主要調控作用，而 ?CqAMSlike2 可能作為冗余或功能或表達模式改變的重復基因，為此 ?CqAMSlike1被優選進行后續的功能分析。

2.3 藜麥VIGS系統的構建

含質粒pTRV2PDS和TRV1的根癌農桿菌侵染藜麥后，14 d的藜麥葉先從葉脈開始，隨后至葉片出現白化現象，第20天時有明顯葉片漂白現象（圖3-Ⅲa、圖3-Ⅲb），而空白對照（圖3-Ⅲc）和陰性對照（圖3-Ⅲd）葉片顏色表現正常。藜麥植株的外形，除葉片顏色外其他無明顯改變。處理25 d后，觀察50株藜麥葉片表型變化，共發現44株出現白化現象，其余6株葉片顏色無明顯變化，侵染效率達到88%（n=50）。進一步觀測發現空白對照未出現白化表型，僅接種空白TRV2載體的藜麥植株出現葉片輕微發黃現象，這可能與TRV接種后產生病癥相一致，且隨時間延長該病癥逐漸減輕直至消失。

RT-qPCR檢測接種25 d的藜麥葉片基因表達發現，CqPDS表達量在接種pTRV2CqPDS藜麥中明顯下降，而在接種TVR2空載體藜麥中未檢測到變化（圖3-Ⅱ），預示在藜麥中成功構建基于TRV的VIGS體系。

2.4 CqAMSlike1 的VIGS沉默

與空白對照相比，接種TRV2 CqAMSlike1和TRV1農桿菌的藜麥花序中 ?CqAMSlike1基因的表達量明顯下降，而接種TRV2空載的表達量下降不明顯（圖4-Ⅱ、圖4-Ⅳ）。在開花期藜麥頂端兩性花中，接種TRV2CqAMSlike1的藜麥花相比正常植株（圖4-Ⅲa、圖4-Ⅲd）和接種TRV2空載體的藜麥（圖4-Ⅲb、圖4-Ⅲe）相比，出現了花絲縮短（圖4-Ⅲc），花藥不裂，花粉難釋放的表型（圖4-Ⅲf），因VIGS沉默的不穩定性，上述表型并非每一朵頂部兩性花都會出現，特別是花藥不裂，只發現3～4枚花藥出現（圖4-Ⅲe）?；ǚ刍盍z測結果顯示，正常植株和接種TRV2空載體植株的花粉活力較高（圖4-Ⅲg和圖4-? Ⅲh），而VIGS沉默 ?CqAMSlike1的藜麥中部分花粉未能染色（圖4-Ⅲi），呈現花粉活力明顯降低（圖4-Ⅴ），藜麥部分雄性不育，從而降低藜麥的結實率并增加空癟率（圖4-Ⅴ）。

2.5 CqAMSlike1/2與CqTDF1和CqMYB80like1? 蛋白的互作

通過BiFC對CqAMSlike1/2與CqTDF1和CqMYB80like1之間互作進行驗證，結果表明：E3與Venus的C端、K3與Venus的N端的融合表達多肽能夠互作產生明顯黃色熒光（圖5-Ⅱa）; Venus的C端和N端之間不能產生互作，未產生黃色熒光（圖5-Ⅱb）。CqAMSlike1與venues的N端和C端融合表蛋白能夠互作，能產生較弱的黃色熒光（圖5-Ⅱc），而CqAMSlike2與venues的N端和C端融合蛋白不能互作，未產生黃色熒光（圖5-Ⅱd），預示著CqAMSlike1而非CqAMSlike2可形成二聚體或多聚體。進一步互作分析發現CqTDF1like與venues的C端融合表達蛋白能和CqAMSlike1與venues的N端融合表達蛋白形成二聚體產生較弱的熒光（圖5-Ⅱe）但與CqAMSlike2與venues的N端融合表達蛋白未能檢測到熒光（圖5-Ⅱf）。CqMYB80like1與venues的C端融合表達蛋白能與CqAMSlike1的venus N端融合表達蛋白產生較強的熒光信號（圖5-Ⅱg）而與CqAMSlike2的N端融合表達蛋白也能形成二聚體，但產生熒光信號較弱（圖5-Ⅱh）。這些結果與此前報道在擬南芥中MYB80會與AMS互作調控下游基因表達相一致[15]。

3 討? 論

植物雄性不育性狀受到遺傳和環境的綜合影響[28]，目前雄性不育基因應調控功能不同可分為影響減數分裂至敗育的PSS1[29]、AM1[30]等；影響胼胝質代謝的AtGsl5[31]等；影響絨氈層發育的AtAMS、OsTDR[7]、OsUDT[32]等;及影響花粉壁發育的CYP704B2[33]等調控基因。在這些基因中擬南芥AtDYT1、AtAMS和水稻OsTDR、OsUDT歸屬于bHLH超家族中的Ⅲ亞家族[34]。該bHLH亞家族中的成員與花藥發育中絨氈層能發育相關，根據相似性比對，擬南芥AtAMS與水稻OsTDR、擬南芥AtDYT與水稻OsUDT均屬直系同源基因[7]。在模式植物擬南芥中花粉絨氈層調控機制已被闡明，該發育過程涉及DYT1、TDF1、AMS、MYB80、MS等多個轉錄因子的協同調控網絡。這些轉錄因子因功能的重要性其突變體常敗育，在不同植物間高度保守[8]，其中歸屬于bHLH超家族的AMS在絨氈層發育調控中起到關鍵作用[35]。

藜麥基因組的注釋中將位于17、15號染色體的兩個AMS同源基因基，均裂分為兩個預測基因，本研究通過對比轉錄組數據將拆分的基因合并后重新分別命名為 ?CqAMSlike1和 ?CqAMSlike2，新預測基因的編碼區長度，蛋白序列及在染色體上內含子數量與結構均與擬南芥AtAMS有較高的相似性[9]。AtAMS及其直系同源基因有著明顯的時空表達特型，在花藥發育的5～8期表達量最高，之后降低，該結論在番茄和辣椒中也獲得了驗證[9，21]?；虮磉_分析表明，藜麥 ?CqAMSlike1的表達模式與AtAMS 更相似，預示 CqAMSlike1比 CqAMSlike2更可能是主要發揮調控藜麥花粉絨氈層發育的AMS同源體。藜麥屬于異源四倍體，由A和B亞基因組融合[19，36]，藜麥基因組中染色體共線性分析表明定位于藜麥17號、15號染色體的分別與B基因組和A基因組二倍體物種有更多的共線性模塊[27]，推測， ?CqAMSlike1和 ?CqAMSlike2的冗余可能是在該物種形成中分別獲于2倍祖先物種的AMS同源基因，但本研究中發現 ?CqAMSlike1和 ?CqAMSlike2表達模式和基因結構的變異，特別是功能上與CqTDFlike、CqMYB80like1互作的變化，可能源于A、B亞基因組中祖先基因的差異及進化中 ?CqAMSlike1和 ?CqAMSlike2結構和功能進一步異化，但具體演化機制有待進一步的研究。

VIGS沉默 ?CqAMSlike1的表型呈現與用VIGS降低辣椒CaAMS表達量的表型相似[21]，初步確定了 ?CqAMSlike1是藜麥中有具有功能的AtAMS直系同源基因。AMS與上游的TDF1及與下游的MS188（MYB80）形成互作網絡[7]。AMS基因的表達受上游轉錄因子的調控，并且還可以與上游基因編碼的轉錄因子互作形成異源二聚體，扶艷艷等[25]在蘆筍中驗證AoTDF1與AoAMS之間存在互作，以異源二聚體的形式調節下游基因的表達。同樣的，AMS也可以直接結合下游基因的啟動子中Ebox區調控其表達[37]，并與MYB80互作形成復合物，從而調控絨氈層和小孢子的發育。本研究用雙分子熒光互補方法初步證實CqAMSlike1與CqTDF1和CqMYB80蛋白之間均有互作（圖5-Ⅱe和5-? Ⅱg）。同時CqAMSlike1自身也發生互作反應（圖5-Ⅱc），結果預示CqAMSlike1可能與模式植物有相似的方式調控絨氈層發育[15，16，36]。藜麥中CqAMSlike1的功能發現，進一步預示不同物種的植物間調控絨氈層發育的模式保守的。本研究發現CqAMSlike2與CqAMSlike1，CqAMSlike2與CqTDF1均沒檢測到明顯的互作熒光信號（圖5），但能檢測到CqAMSlike2與CqMYB80like1的互作熒光信號，預示CqAMSlike2可能也參與花粉發育通路的調控，但該假說的驗證及具體的調控機制有待進一步研究。

綜上所述，藜麥 ?CqAMSlike1是藜麥中有功能的AMS同源基因，其調控絨氈層的模式可能與模式植物中AMS相似，受CqTDF1like的調控，同時其編碼產物又調控下游CqMYB80like1等靶基因的表達，且CqAMSlike1與CqTDF1like和CqMYB80like1可能形成復雜的轉錄調控復合物，調控藜麥絨氈層的發育。本研究將為闡明為藜麥花粉發育的分子機制及用于育種應用提供基礎。

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Cloning and Functional Analysis of CqAMSlike? in? Chenopodium quinoa

Abstract To investigate the molecular mechanism of pollen development of quinoa （Chenopodium quinoa，Willd.），CqAMS candidate genes were predicted and their coding sequences were cloned based on genomic and transcriptomic data，which included homologous alignment and RT-qPCR confirmation analysis of expression patter genes，followed by virus-indiated gene silencing （VIGS） and bimolecular fluorescence complementation （BiFC） methods to perform functional validation of the candidate genes.The results showed that quinoa had two copies of AMS homologs ，named as CqAMSlike1 and CqAMSlike2.The CDS of CqAMSlike1 has 1 929 bp，while that of CqAMSlike2 had 1 920 bp.Both genes were expressed in flowers at different developing stages of panicles，however，compared with the expression pattern of CqAMSlike2，the expression pattern of CqAMSlike1 was more consistent with the expression pattern of? AMS? gene in A.thaliana，thus the CqAMSlike1 was chosen for further function verification.Compared with the wild type，CqAMSlike1 is silenced in quinoa plants by VIGS based on tobacco rattle virus （TRV），showed phenotypes such as? partial shortened filaments，shriveled，indehiscent stamens，abortive pollens，fewer seeds and increased seed shriveling rate.Further BiFC results showed that CqAMSlike1 could interact with itself，CqTDF1 and CqMYB80，indicating that CqAMS-like1 could form homo or heteropolymers to regulate the genes expression for controlling the development of quinoa anther tapetum.The study laid a basis for elucidating the molecular mechanism of pollen tapetum development，and? creating male sterile quinoa germplasm.

Key words Chenopodiun quinoa; AMS; Virus-indiated? gene silence（VIGS）; Pollen devolpment; Protein interation