NaCl脅迫下寧夏枸杞ABA代謝相關基因差異表達分析

梁旺利 于雯靜 胡進紅 宋繁 王玲霞 梁文裕

摘 要 為解析寧夏枸杞響應NaCl脅迫的ABA代謝分子調控機制，檢測NaCl脅迫下寧夏枸杞葉片脫落酸（ABA）含量變化，并利用RNA-seq和qRT-PCR技術研究NaCl脅迫下ABA代謝相關基因的差異表達規律。結果表明，不同濃度NaCl脅迫下，寧夏枸杞葉片中ABA含量隨NaCl濃度的增加呈現增加趨勢；通過轉錄組測序篩選得到21個ABA代謝相關的差異表達基因，從100 mmol/L、200 mmol/L、300 mmol/L NaCl處理下的寧夏枸杞葉片中檢測到ABA代謝相關的差異表達基因分別有17、11、9個，qRT-PCR檢測結果與轉錄組測序結果基本一致。寧夏枸杞通過相關基因的差異表達調控ABA代謝和信號通路，從而參與調控其響應NaCl脅迫。

關鍵詞 寧夏枸杞；NaCl脅迫；ABA；代謝；差異基因表達

土地鹽堿化是全球面臨的日益嚴重的環境問題。鹽脅迫引起土壤鹽漬化和離子穩態失衡，導致植物代謝紊亂、營養缺乏和氧化損傷等，對光合作用、呼吸作用和能量代謝等一系列生理過程產生抑制作用[1]。植物內源激素是植物自身合成并對其生長發育起重要調控作用的物質，激素水平是調控植物響應鹽脅迫的重要因素，如脫落酸（ABA）和水楊酸（SA）可正調控苦豆子對鹽脅迫的反應，而乙烯（ETH）和茉莉酸（JA）可負調控苦豆子響應鹽脅迫[2]。ABA作為植物逆境響應的核心激素，其代謝和信號轉導是近年來研究的熱點[3-4]，尤其對ABA調控植物響應鹽脅迫的分子機制有了一定的認識，如植物遭遇到鹽脅迫時ABA迅速合成，先后與PYR/PYL和PP2C相結合而增強SnRK2活性，激活下游ABA應答基因，同時分解代謝途徑使ABA含量達到動態平衡[5]；ABA生物合成關鍵基因NCED2和NCED6的表達量在鹽脅迫下強烈增加，影響了番茄的抗鹽能力[6]；PYR/PYL/RCAR基因和SnRK2基因上調表達、PP2C基因下調表達共同增強了結縷草的耐鹽能力[7]；富士蘋果栽培的早期階段 CYP707A1和 CYP707A2表達減少有助于弱化ABA分解代謝而防御鹽脅迫[8]。雖然ABA可調控植物耐鹽性已被人們熟知，但木本灌木在鹽脅迫下基因差異表達調控ABA代謝的分子機制還有許多未知之處。

寧夏枸杞（Lycium barbarum L.）是茄科枸杞屬多年生落葉灌木，具有耐鹽堿、耐瘠薄的特點和極高的經濟及藥用價值。目前寧夏枸杞激素相關研究主要集中在果實內源激素與果實發育[9]、外源激素對枸杞生長和繁殖的影響[10]、激素處理對寧夏枸杞扦插生根效果評價[11]等方面，而關于鹽脅迫下寧夏枸杞基因差異表達調控ABA代謝的分子機制方面缺少相應的研究報道。因此，本研究對NaCl脅迫下寧夏枸杞葉片ABA含量的變化進行檢測，采用RNA-seq技術對ABA代謝相關差異表達基因進行篩選，并通過qRT-PCR技術驗證了關鍵基因差異表達情況，進而解析鹽脅迫下寧夏枸杞ABA代謝相關基因差異表達規律，為深入認識寧夏枸杞耐鹽堿的激素代謝分子機理奠定基礎，為寧夏枸杞耐鹽新品種的培育提供理論和試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

寧夏枸杞‘寧杞1號由寧夏農林科學院枸杞工程技術研究所惠贈。寧夏枸杞幼苗培養及處理在人工溫室[溫度（25±2） ℃、濕度42%、光周期16 h/8 h、光照強度60 μmol/（m 2·s）]內完成。幼苗在草木灰、珍珠巖與蛭石1∶1∶1（體積比）混合后的基質中，加入Hoagland營養液培養1個月后，除去基質進行水培至8～12葉期，選擇健康且長勢一致的幼苗進行NaCl（分析純，購自天津市永大化學試劑有限公司）脅迫處理。脅迫處理設定0 mmol/L NaCl（A）、100 mmol/L NaCl（B）、200 mmol/L NaCl（C）、300 mmol/L NaCl（D）4個濃度，處理7 d后選取植株同一部位葉片取樣，-80 ℃保存，備用。每組處理3次生物學重復。

1.2 方法

1.2.1 NaCl脅迫下寧夏枸杞葉片ABA含量測定 ABA的提取參考Fu等[12]的方法并加以改進。稱取0.2 g寧夏枸杞葉片于液氮中研磨至干粉狀，加入1 mL 90%甲醇（色譜純，購自天根生化科技有限公司），4 ℃ 12 h后10 000 r/min離心5 min，上清液倒入MCX-WAX串聯柱，用1.2 mL 90%甲醇洗提后分離MCX-WAX 串聯柱，WAX柱先用2 mL 5%富里酸淋洗，再用1.5 mL甲醇洗脫，氮氣吹干洗脫液，用100 μL 40%甲醇溶液復溶（所有步驟于4 ℃進行）。

ABA含量使用Agilent 1290高效液相色譜儀串聯AB Sciex QTRAP 6500+質譜儀測定。液相條件：采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18（100×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱；流動相：? 甲∶乙=（0.1%甲酸甲醇）∶（0.1%甲酸水）；柱溫40 ℃；洗脫梯度：0～1 min，甲=20%；1～3 min，甲遞增至50%；3～9 min，甲遞增至90%；? 9～10.5 min，甲=90%；10.5～10.6 min，甲遞減至20%；10.6～13.5 min，甲=20%；進樣量? 2 μL。質譜條件：電噴霧電離源 ESI；霧化溫度：500 ℃；氣簾氣（CUR）：35 psi；噴霧電壓（IS）：? 4 500 V；霧化氣壓力（Gas1）：60 psi；輔助氣壓力（Gas2）：60 psi；監測模式：MRM。ABA標準品選用Sigma公司產品。每個處理進行3個生物學重復測定。

1.2.2 RNA提取、文庫構建及測序 利用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（購自天根生化科技有限公司）提取NaCl脅迫處理的寧夏枸杞葉片總RNA，樣品總RNA質量檢測合格后，構建cDNA測序文庫，對文庫插入片段長度和有效濃度進行檢測。使用高通量Illumina HiSeq PE150測序平臺對文庫進行測序獲得原始數據，對raw reads進行過濾處理得到clean reads。采用Trinity軟件對clean reads進行拼接以獲取后續分析參考序列。

1.2.3 基因功能注釋及差異基因篩選 將Unigene序列與Nr、Pfam、Swiss-prot、KEGG、GO數據庫進行比對，獲得基因功能注釋。采用DESeq 2進行基因的差異表達分析，以P<0.05且|log2（Fold Change）|>1為差異顯著性標準，篩選ABA代謝相關的差異表達基因（DEG）。

1.2.4 ABA相關基因的qRT-PCR分析 對轉錄組測序獲得的數據進行分析，挑選ABA代謝關鍵基因進行qRT-PCR分析（試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司）。根據轉錄本序列，用Primer Premier 5.0設計目的基因擴增引物（表1）。PCR擴增條件為95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，共41個循環，每個反應3次重復。采用2-ΔΔCt法[13-14]計算相對表達量。

1.3 數據處理

使用SPSS 26、Origin 2018和Excel等軟件進行數據處理、方差分析與圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 NaCl脅迫下寧夏枸杞葉片ABA含量變化

寧夏枸杞葉片中ABA含量隨著NaCl脅迫濃度的增加呈增加趨勢。ABA含量在NaCl脅迫濃度為0 mmol/L時與200 mmol/L、300 mmol/L處理組相比呈現顯著差異（P<0.05），與100 mmol/L處理組相比無顯著性差異（P>0.05）（圖1）。

2.2 NaCl脅迫下寧夏枸杞ABA代謝相關基因的差異表達

對NaCl脅迫下寧夏枸杞所有差異表達基因進行KEGG pathway顯著性富集分析，篩選21個富集到ABA代謝途徑的差異表達基因（P

2.3 NaCl脅迫下寧夏枸杞葉片ABA代謝相關差異基因的qRT-PCR分析

挑選與NaCl脅迫下寧夏枸杞ABA代謝密切相關的黃質醛脫氫酶2（ ABA2）、醛氧化酶4（ ?AAO4）、脫落酸8′-羥化酶（ CYP707A）、9-順式環氧類胡蘿卜素雙加氧酶3（ ?NCED3 ）、脫落酸受體4（ PYL4）、SNF1相關蛋白激酶2A? （ SnRK2A）、蛋白磷酸酯酶2C 5（ PP2C5）、轉錄因子MYB1R1（ MYB1R1）等基因進行qRT-PCR表達驗證分析。結果顯示：隨著NaCl濃度的增加，寧夏枸杞葉片中 ABA2的表達量呈上升趨勢， ?AAO4的表達量呈先上升后下降的趨勢， CYP707A和 ?NCED3 的表達量呈先上升后下降再上升的趨勢， PP2C5和 MYB1R1的表達量呈下降趨勢， PYL4和 SnRK2A 的表達量呈先下降后上升再下降的趨勢（圖4）。qRT-PCR的驗證結果與RNA-Seq結果基本吻合。

3 討? 論

植物激素是調節植物生長發育和應對各種脅迫耐受性或敏感性的內源分子，可通過誘導復雜的生理生化反應，激活自身免疫系統以應對生物或非生物脅迫。ABA作為植物中最重要的應激反應激素之一，在植物調控生物與非生物應激反應以及在植物不同生長和發育進程中發揮重要? 作用。

ABA的生物合成是植物應對非生物脅迫最快的反應之一。真核生物ABA的早期生物合成主要為甲基赤蘚糖磷酸（MEP）途徑合成類胡蘿卜素，繼而促進ABA生物合成。類胡蘿卜素氧化衍生物玉米黃質和紫黃質是ABA合成過程中重要前體物質，二者可在玉米黃質環氧化酶（ZEP）與紫黃質脫環氧化酶（VDE）的作用下相互轉化。紫黃質可異構化為9-順式-紫黃質和9-順式-新黃質，在9-順式環氧類胡蘿卜素雙加氧酶（NCED）的作用下生成黃質醛；黃質醛經黃質醛脫氫酶2（ABA2）作用產生脫落醛，最終經ABA醛氧化酶（AAO）催化生成ABA。ABA生物合成相關基因之間互相影響，共同調控著植物響應鹽脅迫。Wang等[15]研究表明葉綠體中類脂蛋白基因OsVDE可負調控水稻幼苗 ?OsNECD2/4/5的表達及ABA的生物合成和耐鹽性。NCED是ABA合成中的關鍵限速酶，也是關鍵調控酶，過表達At ?NCED3 基因可明顯提高內源ABA水平，同時上調ABA合成酶基因ZEP、 ?AAO3等的表達水平[16]；而利用CRISPR/Cas9敲除 OsNCED5后，水稻的耐鹽性顯著降低[17]。而且PEG6000脅迫煙草試驗也發現了干旱脅迫誘導 ?NCED3 基因上調表達以及內源ABA的積累[18]。此外，絨毛白蠟體內 ?FvNCED3 基因在脫水、鹽脅迫和外源ABA的作用下的表達量升高，且 ?FvNCED3 可以通過響應外界刺激增強植物下游基因的表達和抗逆性[19]。還有研究發現， ABA2可以正反饋調節ABA的積累，例如水稻中ABA2利用NAD做輔因子，催化黃質醛轉化為脫落醛，在ABA生物合成過程中發揮重要作用[20]。而且外源ABA也能上調擬南芥中ZEP、AAO3和MCSU基因表達水平[21-22]。轉基因水稻相較于野生型與非轉基因水稻中的AAO基因顯著上調表達，且具有較高的耐鹽性[23]。本研究發現寧夏枸杞葉片中 VDE1基因在300?? mmol/L NaCl處理下顯著下調表達，表明玉米黃質向紫黃質的轉化可能促進了ABA的生物合成。 ?NCED3 在100 mmol/L NaCl處理下顯著上調，而在300?? mmol/L NaCl處理下變化不顯著； ABA2在300?? mmol/L NaCl處理下顯著上調； ?AAO4在100、200? mmol/L NaCl處理下顯著上調，而在300 mmol/L NaCl處理下變化不顯著，推測200 mmol/L、300 mmol/L NaCl處理下寧夏枸杞中ABA含量升高的原因可能與以上基因的表達有關，提示了寧夏枸杞在NaCl脅迫下通過誘導ABA合成關鍵基因差異表達進而增加ABA含量，以此參與應對鹽脅迫環境。

現有研究認為ABA響應鹽脅迫的信號轉導途徑主要有依賴ABA和不依賴ABA途徑[24]。不依賴ABA途徑中，植物將識別到的鹽脅迫信號以Ca2+和干旱應答元件為中心進行信號轉導，誘導植物產生相應的生理生化反應以緩解鹽害帶來的負面影響[25]。依賴ABA的信號轉導途徑主要以PYR/PYL/RCAR-PP2C-SnRK2復合物作為主要框架，通過ABA受體PYR/PYL/RCAR、A類蛋白磷酸酶PP2C及第Ⅲ亞類SNF1相關蛋白激酶2（SnRK2s）及下游響應因子發揮作用[26]。在鹽脅迫下，植物內源ABA水平迅速升高被ABA受體PYL/PYR感知，后與蛋白磷酸酶PP2C結合，減少PP2C對SnRK2的抑制，從而激活SnRK2的表達，啟動下游ABA反應元件（ABRE）結合蛋白（AREBs）/ABRE結合因子ABFs，引起氣孔關閉、種子休眠[2，27]。PP2C與PYR/PYL/RCAR受體的選擇性相互作用取決于組織中現存ABA的含量，擬南芥中已鑒定的14個PYL受體，在ABA存在的情況下，只有 PYL1、 PYL3、 PYL6、 PYL8、 PYL9、 PYL10、 PYL11受體與植物激素分子結合后，使 ?PP2C失活啟動信號轉導通路的正調控因子[28]。在鹽脅迫和滲透脅迫下，ABA信號增強激活 ?SnRK2，引起下游轉錄因子磷酸化，從而提高植物抗逆性[29]。擬南芥 ?ABF4基因參與了ABA信號轉導通路，且在馬鈴薯中的表達增強了其耐鹽和耐旱性[30]。本研究發現 ?PLY4基因在200 mmol/L NaCl處理下表達量顯著增加； ?PP2C5基因在100 mmol/L和200 mmol/L NaCl處理下表達量顯著減少； ?SnRK2A基因在200 mmol/L NaCl處理下表達量顯著增加（表2，圖4），說明 ?PP2C5與ABA受體結合后 ?SnRK2A被釋放發揮作用，這暗示了NaCl脅迫下寧夏枸杞葉片中ABA信號轉導通路被激活。另外， ?ABF2、 ?ABF3、 ?ABF4基因均在100 mmol/L NaCl脅迫下表達顯著上調，在200 mmol/L處理下變化不顯著，可能意味著ABA信號轉導通路的下游響應因子被啟動進而對鹽脅迫信號做出了反應。此外，植物最大的轉錄因子家族之一MYB也可以參與ABA信號傳導通路及調節植物耐鹽性[31-32]。 ?AtMYB20可通過抑制擬南芥中 ?PP2C的表達來增強抗鹽性[33]，而玉米可通過增強 ?ZmMYB3R的表達調節氣孔開度賦予玉米耐鹽性[34]，另外過表達 ?GmMYB3a可負調控大豆耐鹽性[35]。本研究發現 ?MYB1R1在鹽脅迫下表達量顯著下降，而 MYB44在鹽脅迫下表達量顯著增加，推測寧夏枸杞在響應鹽脅迫過程中不同的MYB轉錄因子可能具有不同的調控ABA代謝作用，其具體機制還有待于進一步研究。因此，寧夏枸杞在NaCl脅迫下可能通過激活ABA信號轉導通路中相關調控基因，進而參與應答寧夏枸杞對鹽脅迫的? 響應。

為有效調節植物體內ABA水平以響應應激反應，除加強ABA生物合成途徑外，抑制ABA代謝也是增強植物ABA水平的一個有價值且非常重要的舉措[36]。ABA的分解代謝主要包括與葡萄糖結合和羥基化作用。當植物體內ABA含量過高時，葡萄糖基轉移酶（UGT）催化其與葡萄糖反應生成脫落酸葡萄糖酯（ABA-GE）；當植物體內ABA過低時，ABA-GE又可將ABA釋放出來[37]。羥基化作用中，ABA分解代謝通過氧化失活方式產生紅花菜豆酸（PA），其關鍵限速酶是脫落酸8′-羥化酶[38]。Liu等[39]通過RNAi對水稻 ?OsABA8ox1（ ?CYP707A5）基因進行抑制，提高了水稻植株內源ABA水平，顯著提高了水稻對堿脅迫的耐受性。在對水稻冷脅迫研究[40]中發現過表達 ?OsABA8ox1的轉基因水稻品系ABA含量降低，同時其對干旱和寒冷耐受性降低，這意味著隨著 ?OsABA8ox1表達的升高，ABA水平受到負反饋調控。另有研究表明， ?CYP707A基因的轉錄本可增加植物對鹽、滲透、脫水壓力以及ABA的響應[41]。本研究發現寧夏枸杞葉片在100 mmol/L NaCl脅迫下 ?CYP707A基因顯著上調表達，可能加速了ABA降解使得ABA含量下降，而200 mmol/L NaCl脅迫下 ?CYP707A基因表達量顯著下調，減緩了ABA羥基化分解代謝。因此，寧夏枸杞在NaCl脅迫過程中可能通過抑制其降解相關基因表達，從而提高植物體內ABA的含量，達到對鹽脅迫防御的調控作用。

綜上所述，寧夏枸杞通過相關基因的差異表達調控ABA代謝和信號通路，從而調控其響應NaCl脅迫。研究結果為深入解析寧夏枸杞耐鹽的ABA代謝調控和信號轉導機理奠定了基礎，并為寧夏枸杞耐鹽新品種的培育提供了理論和試驗依據。

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Differential Expression of? ABA Metabolism-Related Genes in Lycium barbarum under NaCl Stress

Abstract To analyze the molecular regulation mechanism of ABA metabolism of Lycium barbarum in response to NaCl-induced stress，we detected ABA contents of L.barbarum leaves under NaCl stress，and used RNA-seq and qRT-PCR techniques to analyze the differential expression of ABA metabolism related genes.The results showed that ABA content in leaves of L.barbarum increased by NaCl stress.21 ABA metabolism-related genes were differentially expressed in L.barbarum，and 17，11 and 9 ABA metabolism-related genes were differentially expressed in 100 mmol/L，200 mmol/L and 300 mmol/L NaCl，respectively.Meanwhile，the results of qRT-PCR were consistent with the results of transcriptome sequencing.L.barbarum responded to NaCl stress through regulating ABA metabolism and signal pathway by differential expression of related genes.

Key words Lycium barbarum; NaCl stress; ABA; Metabolism; Differential expression of genes