豬瘟疫苗的研究現狀與發展趨勢

賈華強

（中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所，黑龍江 哈爾濱 150069）

豬瘟是由豬瘟病毒感染引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，主要特征是發病急、高熱稽留和細小血管壁變性，從而引起泛發性小點狀出血、梗死和壞死。該病傳染性強，病死率高，對養豬業危害巨大。OIE 將其列為法定報告疾病，我國將其列為一類動物疫病。豬瘟病毒是其病原體，盡管豬瘟病毒各個毒株的毒力不同，但是它們都使養豬業產生了巨大損失，威脅著全世界的豬肉生產和國家人口的糧食安全。它在亞洲、中美洲和南美洲的一些地區以及許多東歐國家流行，在西歐偶有發現。目前沒有藥物可以有效治療豬瘟，疫苗接種和生物安全措施是預防和控制豬瘟的主要方法。

1 豬瘟疫苗的發展現狀與面臨的挑戰

1.1 弱毒疫苗 20 世紀40 年代，世界多個國家進行豬瘟病毒的弱化研究，其中日本使用低溫適應性豚鼠腎細胞獲得GPE-弱毒株，法國使用低溫適應性細胞獲得Thiverval 毒株。中國獸藥監察所與中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所聯合使用豬瘟病毒石門系強毒在家兔連續傳代獲得具有更好穩定性、安全性和免疫原性的豬瘟兔化弱毒株C 株（Chinese strain）。該毒株生產的疫苗已成為國內外預防豬瘟最常用的疫苗，但使用血清學方法不能區分感染動物和接種疫苗的動物（Differentiating infected from vaccinated animals,DIVA），因而阻礙豬瘟病毒的根除。由于這一限制，歐盟國家不允許給豬接種高保護效力的弱毒株“C”株或類似的減毒活疫苗。在生產過程中家兔脾淋苗、全乳兔苗對動物福利不友好，由于細胞源弱毒疫苗使用胎牛血清會出現外源病毒感染（牛病毒性腹瀉病毒，BVDV 等）的情況，導致豬瘟疫苗免疫效價降低，增加疾病傳播風險。

1.2 亞單位疫苗 重組DNA 技術的出現意味著外源基因可以被插入表達載體，由細胞表達基因編碼的外源蛋白。研究人員可以根據需求選擇使用酵母、細菌、昆蟲細胞、哺乳動物細胞以及植物細胞表達蛋白。豬瘟亞單位疫苗在區分感染動物和疫苗接種動物以及安全性方面具有優勢，是控制和根除豬瘟的有前途的疫苗。

與原核系統相比，重組桿狀病毒表達系統表達出的目的蛋白質具有正確的空間結構和翻譯后修飾（如蛋白質糖基化和二硫鍵形成），因此疫苗具有有效的免疫原性。2018 年研究人員發現通過桿狀病毒系統表達的豬瘟E2 蛋白和豬IFN-γ 蛋白可以顯著增強斷奶仔豬特異性免疫應答。密碼子的優化、啟動子的選擇（如多角體蛋白、p10、Hsp70）、信號肽的選擇（如蜜蜂蜂毒肽信號肽、免疫球蛋白K信號肽）都對E2 蛋白的表達效率有影響。到目前為止，尚未報道來自天然可溶性E2 蛋白的信號肽的精確序列。E2 蛋白的分泌效率和免疫原性尚未得到很好的優化，并且疫苗生產成本較高。2020 年研究人員發現SPZJ 信號肽在可以增加至少50%E2 蛋白的生產率，并且顯著提高其免疫原性。為了進一步降低疫苗成本，孫賀群等人使用蛹蟲草表達豬瘟E2蛋白，Park 等人使用煙草組織表達豬瘟E2 蛋白。李天增等人探究水佐劑、雙相佐劑、油包水佐劑增強亞單位疫苗免疫的效果，發現油包水佐劑（ISA 植物油佐劑）表現優異。Ze 等人利用自組裝肽（mi3）開發出基于CSFV E2 的自組裝納米疫苗SP-E2-mi3 NPs，研究結果表明E2-mi3 NPs 可以顯著改善體液免疫和細胞免疫。Yanmin 等人采用生物信息學方法設計優化了連接子（linker）連接E2、IFN-γ 基因，在HEK293T 細胞中表達融合蛋白E2-R2-PIFN，以提高CSFV E2 亞單位疫苗的免疫原性。

基于桿狀病毒表達E2 的兩種疫苗（拜耳公司的BAYOVAC CSF E2 和默沙東公司的Porcelis Pesti）已在歐洲實現商業化。2017 年，國內天康生物成功注冊重組桿狀病毒滅活疫苗（Rb-03 株），將CSFV E2 蛋白基因插入桿狀病毒，使用重組桿狀病毒感染昆蟲細胞表達豬瘟E2 蛋白，2018 年投入使用。華中農業大學與各企業合作開發出重組桿狀病毒亞單位疫苗（WH-09 株），該疫苗安全性好，穩定性強，于2020 年成功注冊。

盡管已經開發了亞單位疫苗，但它們的免疫原性和保護作用不如傳統的減毒活疫苗（如免疫起效晚，免疫效力低，不能阻斷垂直傳播），后續還需繼續探究免疫一次就能達到很好免疫效果的方案。

1.3 核酸疫苗 核酸疫苗的研究需要找到病原微生物引發機體產生抗體的特定抗原，再將其抗原的基因克隆到質粒上制成疫苗，或將信使RNA 直接制成疫苗導入動物體內。核酸疫苗的生產經濟且高效，它們可以引發MHC I 類、MHC II 類T 細胞免疫應答反應。

研究專家基于甲病毒開發了新一代動物細胞表達載體系統，該系統可廣泛選擇動物細胞宿主，效率高，使用方便，近年來有關甲病毒載體的研究在國內外都非?；钴S。該系統可以消除使用裸DNA疫苗產生染色體整合等潛在威脅，提高了常規DNA疫苗的生物安全性，其中基于塞姆利基森林病毒（SemLiki forest virus,SFV）開發的載體pSCA1 已被用于HPV DNA 疫苗的開發。這表明SFV 復制子衍生的DNA 疫苗可以成為針對CSFV 感染的潛在標志疫苗，然而接種多種疫苗產生高保護效果的成本較高，因此核酸疫苗在實際應用中并不廣泛。

一些研究人員發現，PCV2 會干擾CSFV 疫苗的免疫作用，CSFV 疫苗的保護效果會受PCV2 感染的影響，CSFV 和PCV 的合并感染明顯增加了養豬業疾病防控的難度，因此Fuyu 等人選擇甲病毒質粒pSCA1 作為CSFV E2、Erns 基因以及PCV2 Cap 和Rep 基因的載體，結果表明，重組質粒疫苗可以在體外表達E2、Erns、Cap 和Rep 蛋白，并在體內促進CSFV 和PCV2 抗體的產生。

核酸疫苗還需投入大量的人力進一步評估可行性、安全性和有效性，并提升核酸疫苗在大動物體內的免疫原性和抗體效價。同時我們還需要注意持續高水平表達外源抗原會對機體產生傷害（如自動免疫、超敏反應、過敏反應、產生免疫耐受）。

1.4 嵌合病毒活疫苗 減毒活疫苗具有幾個明顯的優勢。它可以通過在宿主中復制，更準確地模擬自然感染狀態、易于給藥、提供機體更長久的免疫力、全面刺激機體的免疫反應（體液免疫、細胞免疫）。出于這些原因，科學家們開發了嵌合病毒活疫苗。大多數病毒載體研究都集中在較大DNA 病毒上，特別是痘病毒、皰疹病毒和腺病毒。皰疹病毒（如傳染性牛鼻氣管炎病毒、貓皰疹病毒和偽狂犬病病毒）和腺病毒（如犬、馬、禽和黑猩猩腺病毒）也正在開發為載體。

李譜華等人將CSFV 的E2 基因插入雞痘病毒(Fowlpox virus,FPV) 構建重組病毒FV282-CSFV-E2，通過免疫保護實驗證明其保護率為75%。孫永科等人通過293 細胞包裝攜帶豬瘟Erns 基因的腺病毒。2023 年，Dong 等人將CSFV LOM 株的E2 基因插入BVDV KD26 株的骨架中，制備了嵌合病毒活疫苗KD26-E2LOM。2015 年Suvaxyn CSF Marker，一種嵌合體病毒活疫苗修飾BVDV 使其表達CSFV E2 基因，獲得歐盟批準。然而，Suvaxyn CSF Marker 僅被批準用于緊急疫苗接種。

BVDV/CSFV 嵌合體病毒活疫苗CP7-E2alf，使用CSFV 毒株Alfort/187 的E2 基因取代BVDV 毒株CP7 的E2 基因，并于2014 年在歐洲獲得上市許可。韓國政府通過將BVDV 的Erns 基因插入CSFV毒株Flc-LOM 中開發了具有DIVA 功能的疫苗Flc-LOM-BErns，于2017 年在韓國獲得上市許可，并于2020 年將使用Flc-LOM-BErns 作為政策實行。這兩種疫苗經過多方面的檢驗，如毒株的遺傳穩定性、安全性以及療效，證明其與傳統減毒活疫苗一樣安全有效，但它們不能預防強毒株的垂直傳播。

CSFV 與其他病毒如PRV（偽狂犬病病毒）、PCV2（豬圓環病毒2 型）和PRRSV（豬繁殖與呼吸綜合征病毒）的合并感染在東歐和亞洲的大多數豬肉生產國（包括中國）非常普遍。針對這種情況，Selvaraj 等人構建了三基因缺失（糖蛋白E、糖蛋白G 以及胸苷激酶基因）疫苗載體PRVtmv，在三個基因刪除的位點分別插入CSFV E2 基因、CSFV Erns與粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子融合基因、PCV2b Cap 基因。Yang 等人將經過氨基酸突變的全長E2 基因插入PRV 中，首次實現使用PRV 表達全長E2 基因，結果顯示表達E2 全長基因的疫苗免疫效果要比表達截斷E2 基因的疫苗免疫效果好。

由于CSFV 和BVDV 的抗原關系密切，交叉反應性抗體可能導致假陽性反應和DIVA 鑒別失敗。為了開發更好的具有DIVA 特性的候選標記疫苗，有研究專家通過使用遠緣瘟病毒的同源基因取代豬瘟病毒Erns 基因，構建嵌合病毒。

1.5 合成肽疫苗 1963 年，使用化學方法分離出的煙草花葉病毒的六肽片段與牛血清白蛋白（BSA）偶聯可以引發兔產生抗體，科學家們發現肽具有成為疫苗潛力。1982 年，Bittle 等人使用動物口蹄疫病毒（FMDV）首次證明肽除了在體外具有中和活性外，還可在體內引發保護性免疫。合成肽疫苗是根據病原微生物基因序列合成含有抗原決定簇的肽段制成的疫苗，其安全性和穩定性高且經濟，可分為單肽疫苗和多肽疫苗，具有良好的開發前景。

Qianru 等人發現了E2 蛋白表面結構域C 和結構域D 的邊界處的新型線性表位（256CLIGNTTVKV HASDER271），200 μg/mL 的線性肽與抗豬瘟血清孵育可使其中和能力降低63%，為豬瘟新疫苗的設計和鑒別診斷提供了理想的候選肽。Xiaotian 等人發現331ATDRHSDYF339 肽段可顯著抑制豬瘟感染，這個發現可用于設計能產生快速保護的新疫苗。

1.6 基因缺失疫苗 這種疫苗是將病毒基因組中與病毒毒力相關的基因敲除或突變從而獲得弱毒株制成的基因缺失疫苗。這使疫苗有更全面的免疫原性，且弱毒株不易恢復毒力。

Lauren 等人驗證他們實驗室研發的雙抗原標記減毒CSFV 活疫苗，該毒株FlagT4v 插入了合成表位Flag，并使單克隆抗體表位WH 303 發生突變。結果顯示，FlagT4v 疫苗可在使用后第3 天產生免疫反應，但是該疫苗難以大規模推廣。Nicolas 等人選擇兩個強毒株Alfort/187 和Eystrup，使用鼠的泛素基因替換二者的Npro 基因,成功構建穩定的弱毒株,并且兩種弱毒株都可以保護機體免受致死劑量的豬瘟強毒攻擊。豬瘟基因缺失疫苗還需引進PRV 疫苗的技術手段，為后續豬瘟基因缺失疫苗的研發提供幫助。

1.7 全長感染性cDNA 標記疫苗 全長感染性cDNA 標記疫苗是使用反向遺傳學技術在分子水平上,將具有標記的基因替換到致弱病毒全長cDNA中,獲得的重組病毒為DIVA 疫苗。Gil 等人經RT-PCR 得到可以代表CSFV LOM 基因組的8 個DNA 片段,構建具有8 個堿基突變的全長cDNA 克隆Flc-LOM。免疫動物14 d 后機體產生特異性中和抗體。該種類疫苗可以將標記性基因克隆到CSFV 弱毒cDNA 中，為建立快速、準確的CSFV 檢測試劑盒奠定基礎。

2 未來發展趨勢

幾十年以來，人們一直在使用安全有效的減毒活疫苗來控制豬瘟，為根除豬瘟鋪平道路，雖然這些疫苗在免疫效果和免疫持續時間上具有突出的優勢，但是它們不能區分感染動物和接種疫苗的動物。作為豬瘟第一代DIVA 疫苗，商業化的E2 亞單位疫苗具有高度的安全性，但是缺乏一定的功效，因此很多研究專家致力于開發下一代具有良好安全性、有效性和適銷性的DIVA 疫苗。雖然目前很多新型疫苗的研發都處于實驗室階段，但隨著人們不斷地深入研究，將新型疫苗的優勢最大化，DIVA 疫苗將在凈化豬瘟上發揮巨大作用。