隱匿性乙型肝炎病毒感染的輸血傳播風險及防范

王全慧,潘 彤 綜述,樊 晶審校

天津市血液中心,天津 300110

乙型肝炎表面抗原(HBsAg)是世界衛生組織(WHO)公認的判斷乙型肝炎病毒(HBV)感染的關鍵指標,也是大多數國家用于血液篩查、臨床診斷的重要指標。隨著分子生物學診斷應用于HBV DNA檢測,部分獻血者HBsAg檢測陰性,但體內卻仍然存在較低水平的HBV DNA?；谄潆[匿性的特點,隱匿性乙型肝炎病毒感染(OBI)者不容易被早期發現和治療,導致感染者隱匿性肝損傷。本文就OBI的概念、發生的分子機制、輸血傳播風險及防范等方面逐一進行綜述。

1 OBI概述

OBI定義為排除HBV感染的窗口期,肝臟存在有復制能力的HBV DNA[即游離型共價閉合環狀DNA(cccDNA)]和(或)血液中存在HBV DNA。盡管OBI患者在肝臟中存在活躍的HBV DNA復制,但血液中的HBsAg為陰性,HBV DNA只能間歇性檢測到。根據HBV特異性抗體譜,OBI可分為血清學陽性的OBI即乙型肝炎核心抗體(抗-HBc)和(或)乙型肝炎表面抗體(抗-HBs)陽性,以及血清學陰性的OBI即抗-HBc和抗-HBs陰性。此外,還有一個OBI患者亞組被稱為“假OBI”,這是HBsAg突變的攜帶者,但在一些常規檢測方法中無法識別。這些病例表現出HBV DNA水平升高,類似于在HBsAg陽性的HBV感染中發現的DNA水平[1]。這些患者被S基因突變的變異株感染,被稱為“逃逸變異”。

OBI的診斷是基于HBsAg陰性個體血液標本或肝組織中HBV DNA的檢測。肝臟標本中HBV DNA的檢測結果為金標準。研究發現,HBV DNA一般僅在血清/血漿中間歇性地檢測到,通常小于200 IU/mL(約1 000 copy/mL)。但事實上,在超過90%的OBI受試者中,血清HBV DNA僅為20 IU/mL左右。

2 OBI發生的分子機制

2.1病毒因素 HBV是高度變異的DNA病毒,基因突變頻繁發生。首先HBsAg主要親水區(MHR,aa100～169)尤其是a 抗原決定簇(aa124～147)發生的點突變與OBI形成密切相關,且存在較高的突變頻率。第二,S區的突變與HBV表面蛋白的表達減少有關;在OBI患者中經常觀察到preS1/preS2啟動子突變,使得HBsAg無法被檢測到。第三,在OBI患者中發現剪接步驟對HBV中的基因表達也有關鍵影響。第四,表觀遺傳學修飾可以在不改變其核苷酸序列的情況下改變基因的表達模式[2]。在HBV雙鏈 DNA啟動子區和增強子區含有3個主要的 CpG 島[3],一般呈非甲基化狀態,一旦出現甲基化則導致基因轉錄的沉寂。

2.2宿主因素 HBV cccDNA以微小染色體形式穩定地存在于肝細胞核中。由于肝細胞較長的半衰期,一旦感染HBV即使發揮有效的免疫控制,病毒也可能會攜帶終生。絕大多數OBI患者的肝臟中HBV cccDNA水平較低,但對其HBV病毒株進行體外培養時發現,cccDNA 可完全恢復復制、轉錄和合成蛋白的能力。在宿主控制OBI過程中,除了T細胞免疫,B細胞體液免疫反應也起很重要的作用。在接受B細胞選擇性單克隆治療(例如利妥昔單抗和非腫瘤單抗)的患者中可頻繁地觀察到HBV再激活[4]。

2.3共同感染 研究顯示,在合并其他病毒感染的情況下,HBV 的復制表達可能會被影響。特別是感染丙型肝炎病毒(HCV),核心蛋白通過與HBX蛋白和聚合酶之間的相互作用來抑制HBV基因表達和復制[5],HCV的非結構蛋白2(NS2)及NS5A也會干擾HBV的復制,從而導致OBI感染發生。

3 不同人群中OBI流行率

OBI 在世界上廣泛存在,在 HBV 流行率高的地區,獻血人群中 OBI 的流行率也較高。有研究發現英格蘭獻血者 OBI 流行率極低,小于0.001%[6]。在美國、中歐、北歐和地中海區域等國家獻血者中OBI流行率為0.002%～0.070%[7-9]。西太平洋和亞馬遜地區的HBV流行率要高于歐美地區[10]。據巴西、阿根廷、日本、東南亞國家等報告,獻血者OBI流行率為0.012%～2.6%[11]。撒哈拉以南非洲地區的HBV流行率在非洲最高[12-16]。我國幅員遼闊,人口眾多,是HBV高發區。HBV感染流行率越高的人群往往會有越多的OBI患者。江蘇省、安徽省、河南省及山東青島等省市最近幾年內的報道數據顯示獻血者OBI的流行率為0.017%～0.054%[17-20],低于上海、云南、重慶、 浙江溫州等南方地區的數據[21-24]。

最近,南京醫科大學第一附屬醫院徐華國團隊發表了一項關于全球OBI流行率的薈萃分析,結果顯示:一般人群中OBI總流行率為0.82%,艾滋病患者中為16.26%,其他肝病患者中為13.99%,血液透析患者中為4.25%,有其他風險因素的患者中為5.14%[22]。

4 OBI引發輸血后HBV感染的風險

HBsAg陰性而HBV DNA陽性的血液成分是具有傳染性的,可通過輸血途徑傳播并在臨床得到了確認,但仍是極少報道的事件。在CANDOTTI等[26]的一項研究中,斯洛文尼亞3例HBsAg陰性重復獻血者使用高度敏感核酸檢測(NAT)未發現HBV DNA,31例受血者輸注了其血液及血液成分,其中有9例受血者(29%)被確定為感染了HBV。但如果排除7例抗-HBs陽性的受者,感染比例增加到37.5%。有研究認為OBI是輸血傳播鏈上不可忽視的傳染源,可通過輸血傳播感染[27]。最近開發了一個數學模型來估計與OBI相關的輸血殘余傳播風險,該模型基于隨機選擇的OBI供體中病毒載量的概率分布,給定的病毒載量未被NAT檢測到的概率,以及該病毒載量導致受體感染的概率,該模型估計單人份核酸檢測(ID-NAT)(95%LOD:3.4 IU/mL)檢測陰性的OBI獻血者血液可能使受血者輸注含有20 mL血漿的紅細胞而導致感染的概率為3.3%,輸注200 mL新鮮冰凍血漿而導致感染的概率估計增加到14%[28]。

5 OBI輸血傳播風險防范

5.1檢測HBsAg的超敏方法 HBsAg檢測血清學方法包括酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、化學發光免疫分析(CLIA),這是血液篩查最常用的檢測方法。目前大多數試劑檢測下限為50 mIU/mL。最近開發了具有更高靈敏度的測定HBsAg的檢測方法,結合化學發光酶免疫分析法(CLEIA)和免疫復合物轉移方法的半自動免疫分析系統(ICT-CLEIA),檢測限為0.5 mIU/mL。這種檢測方法可用于自限性HBV患者,識別cccDNA轉錄活性和最小HBV復制,以檢測OBI。SHINKAI等[29]對120例接受全身化療的血液病患者進行的一項研究顯示:通過HBV DNA檢測發現有13例患者存在HBV的再活化。ICT-CLEIA試驗在這13例出現HBV再激活的患者中檢測到12例HBsAg陽性,甚至有2例HBsAg陽性出現在HBV DNA升高之前。因此,ICT-CLEIA檢測方法成為一種新的超靈敏的HBsAg檢測方法,并可能將窗口期(WP)降低至14 d。

HBsAg試劑除了具有高靈敏度外,對檢測S區逃逸變異的能力也不同。為了對這些變異進行最佳檢測,HBsAg檢測必須使用針對HBsAg多個表位的抗-HBs探針的檢測方法,以確保檢測到HBV S變異。此外,HBsAg檢測失敗的另一個原因可能是抗-HBs存在時,HBsAg-HBsAb免疫復合物的形成。在這種情況下,如果使用能夠將HBsAg從免疫復合物中分離出來的方法檢測,一些OBI患者可能會發現HBsAg呈陽性[30]。

5.2抗-HBc篩查 抗-HBc與HBV感染相關,是HBV感染后最早出現的特異性抗體。對獻血者、器官捐獻者、接受免疫抑制劑治療的個體進行流行病學調查時,抗-HBc 檢測可用作診斷OBI的替代血清學標志物。研究發現在HBsAg陰性和抗-HBc陽性的人群中,有0%～4.6%檢測到HBV DNA,中位患病率為1%。在HBV感染低流行國家根據流行病學背景,酌情實施抗-HBc篩查。在加拿大、法國、德國、愛爾蘭、荷蘭和美國等一些中等/低流行國家,普遍的抗-HBc篩查造成的獻血者損失是可以承受的[31]。另外一些國家為了減少獻血源流失,在抗-HBc中引入抗-HBs檢測,但目前對100 mIU/mL這個閾值還沒有達成一致。日本抗-HBs要求大于200 mIU/mL,加拿大為100 mIU/mL。我國是HBV高流行國家,為了防止獻血源的大量流失,未將抗-HBc篩查列入常規檢測項目。但基于我國新生兒乙肝疫苗普遍接種近30年,將來在青年隊伍中開展獻血篩查時可考慮增加抗-HBc檢測。

5.3MP-NAT/ID-NAT篩查模式靈敏度差異 目前,我國采供血機構普遍采用HBsAg和MP-NAT/ID-NAT篩查來防止HBV輸血傳播。美國學者的一項關于獻血者綜合研究表明,在404例確認OBI獻血者中,MP-NAT混樣檢測只檢測出43例(43/404,10.6%),大多數OBI獻血者(361/404,89.4%)只能通過ID-NAT檢測出[32]。MP-NAT為6或8個供體血漿混合標本檢測模式,混樣過程中引入的稀釋因子降低了HBV NAT的靈敏度,所以即使進行NAT篩查后,OBI獻血者仍然對血液安全構成潛在的威脅。另外,YE等[33]研究中還觀察到MP-NAT檢測陽性的42個pool,拆分檢測時未檢出陽性標本,當使用定量PCR(qPCR)和巢式PCR檢測時,17份標本被確定為OBI。在低流行的發達國家,HBsAg、抗-HBc和HBV NAT的實施提供了最佳的血液安全水平,能篩查出急性感染的早期階段,可檢測到潛在的間歇性病毒血癥的隱匿性感染以及病毒變異。此外,在中度和高流行率國家由于抗-HBc還不能實施,ID-NAT應該是首選。

5.4血液制品的病毒滅活 對血液制品進行病毒滅活是保證輸血安全的另一道防線,是輸血領域研究的熱點。OBI通過輸血方式傳播HBV是一項重要的公共衛生問題,即便在發達國家也存在輸血傳播的風險,因為導致人類HBV感染的最低病毒載量低于當前使用的最敏感NAT的檢測下限。在血液制品制備過程中或者臨床輸血前實施病原體滅活程序,既能保障血液成分又能降低感染性疾病傳播的概率,可以最大程度上保證輸血安全性。目前國內采供血機構廣泛使用的有亞甲藍光化學法血漿病毒滅活技術。亞甲藍是一種光敏劑,可以與病毒的核酸以及病毒的脂質包膜相結合,在可見光的作用下發生化學反應,使病毒的核酸斷裂,包膜結構破損,從而達到病毒滅活的效果。病原體滅活技術不僅能有效滅活血漿中常見的重要病毒如HBV、HCV、人類免疫缺陷病毒和人類T細胞白血病病毒(HTLV)等,也被證實可以有效去除包括西尼羅病毒(WNV)、登革病毒(DENV)、寨卡病毒(ZKV)以及新型冠狀病毒(SARS)。在發達國家,病原體滅活技術目前應用于新鮮冰凍血漿和血小板濃縮物,但仍無法用于紅細胞濃縮物。對經過處理后血液成分功能方面的影響,也存在一些爭議。

6 OBI對乙肝消除戰略的挑戰

2016年,WHO通過了《全球衛生部門戰略》,旨在到2030年消除病毒性肝炎。WHO的目標是到2030年將肝炎發病率減少到90萬例,并將每年因肝炎死亡的人數從140萬例減少到50萬例。為此目的,WHO正在幫助不同的國家制定肝炎控制規劃。文件列出了到2030年消除肝炎的5個領域,其中大多數以HBV為目標。重點領域如下:(1)擴大針對HBV的疫苗接種覆蓋率及實行病原體減少程序;(2)預防HBV性傳播;(3)減少靜脈注射傳播;(4)降低OBI傷害和減少合并感染;(5)擴大對HBV和HCV的檢測和治療。除了增加預防性疫苗接種的覆蓋率之外,WHO還建議增加對HBV感染的早期診斷和治療。提高HBsAg檢測診斷的靈敏度也將有助于檢測“假OBI”,檢測HBV DNA最敏感的方法通常用于血液篩查。在與OBI和消除HBV有關的主要挑戰中,有以下幾方面的需求:開發檢測OBI的靈敏度更高、特異度更高和標準化的檢測方法;可以通過篩查抗-HBc、HBV DNA(0.15 IU/mL)或病原體減少法處理血液成分來提高血液安全性;開發出旨在消除cccDNA及其相關表觀遺傳變化的治療方法,以減少臨床進展和OBI傳播。

7 總 結

我國是HBV感染高流行地區,OBI在輸血安全中的隱患不容忽視,在獻血人群中潛在相當數量的OBI患者,對輸血安全造成極大威脅。目前還存在以下3方面問題:(1)國外已經對OBI獻血者造成感染的臨床病例進行了深入研究,但目前我國OBI獻血者造成的輸血傳播風險尚無臨床數據,需要采供血機構聯合臨床用血單位開展輸血后風險評估的研究,監測OBI引發的輸血傳播風險。(2)同時也應該開發更靈敏、標準化和經過驗證的檢測HBsAg的方法,包括檢測 HBV S變異體和存在抗-HBs免疫復合物中的HBsAg。(3)提高核酸檢測靈敏度。防止輸血傳播HBV所需的NAT靈敏度需要從目前的3.4 IU/mL降低到一個新的檢測下限(0.15 IU/mL)。實施有效的血液安全監測體系,包括系統地收集和長期存儲患者的輸血前血漿標本,用于HBV傳播監測和患者的治療管理。OBI感染者情況錯綜復雜,應該綜合各種檢測技術對獻血者的血液質量進行全方位的監測、評估,以保證臨床用血安全。