葫蘆科作物離體雌核發育技術研究進展

張成桃 宋慧娟 孫翔宇 戴思慧 孫小武

摘??? 要：單倍體或雙單倍體對作物改良、遺傳育種具有重要意義，對提高單倍體的誘導頻率、建立高效穩定的離體雌核誘導體系至關重要。而常規育種周期長、工作量大，且遺傳性狀存在不穩定性。在葫蘆科作物中通常通過未授粉子房、胚珠離體培養的途徑產生單倍體或雙單倍體植株，從而獲得純合的自交系，使基因快速純合，極大地縮短育種年限。對葫蘆科作物離體雌核發育技術進行了綜述，影響離體雌核發育結果的主要因素有供體植株的基因型、培養基及添加的外源激素、黑暗熱激與預冷處理方式、播種季節、子房發育時期等。同時也概括了再生植株的倍性與加倍方法，為后續葫蘆科作物離體雌核發育的研究提供參考依據。

關鍵詞：葫蘆科作物；離體雌核發育；離體培養；影響因子

中圖分類號：S642+S65 ??????????? 文獻標志碼：A??????????? 文章編號：1673-2871（2024）04-001-06

Research progress on in vitro gynogenesis technology of Cucurbitaceae crops

ZHANG Chengtao， SONG Huijuan， SUN Xiangyu， DAI Sihui， SUN Xiaowu

（College of Horticulture， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， Hunan， China）

Abstract： Haploid or double haploid plays an important role in crop improvement and genetic breeding. It is very important for increasing the induction frequency of haploid and establishing an efficient and stable in vitro gynogenetic induction system. The conventional breeding cycle is long， the workload is heavy， and the genetic characters are unstable. Haploid or double haploid plants are usually produced by in vitro culture of unpollinated ovary and ovule， so as to obtain homozygous inbred lines， which can make genes homozygous quickly and shorten breeding life greatly. In this paper， the authors reviewed the techniques of in vitro gynogenesis of cucurbit crops， and found that the main factors affecting the results， including the genotypes of the donor plants， the medium and added exogenous hormones， the methods of dark heat shock and pre-cooling， the sowing season， and the stage of ovary development. Besides， the methods of ploidy and doubling of regenerated plants were also summarized， to provide reference for the subsequent research on the development of in vitro female nuclei of cucurbitaceae crops.

Key words： Cucurbit crops; In vitro gynogenesis; In vitro culture; Influencing factors

收稿日期：2023-11-06；修回日期：2024-01-27

基金項目：湖南省科技廳重點研發項目（2022NK2007）

作者簡介：張成桃，女，在讀碩士研究生，研究方向為南瓜分子育種。E-mail：2855184023@qq.com

通信作者：孫小武，男，教授，主要研究方向為瓜類育種。E-mai：sun0070@139.com

戴思慧，女，教授，主要研究方向為瓜果蔬菜學。E-mail：daisihui@126.com

常規的育種手段周期長、變異小，需要一種能快速、準確繁育出攜帶所需性狀的純合植株的方法。利用離體雌核培養誘導技術可以快速得到純合植株，縮短育種周期，加快育種進程。但在葫蘆科離體雌核發育的過程中受到許多因素的影響，導致類胚誘導率、出胚率較低等許多問題。因此，通過改進試驗技術、方法來提高其誘導效率，建立穩定性好、重復性高的未授粉子房離體培養技術，在葫蘆科作物育種中具有重要意義。筆者對影響葫蘆科離體雌核發育技術的幾個因素進行了綜述，為今后離體雌核發育技術研究提供一些參考依據。

1 影響因素

1.1 基因型

大量研究表明，供體材料的基因型是決定離體雌核發育成功的首要因素，不同基因型的雌核在離體培養過程中再生能力存在著明顯差異。在南瓜中發現，不同基因型供體材料在相同誘導條件下，胚狀體的誘導率差異顯著[1-2]。陳玲[3]也有相似的發現，供試的7份材料中有一品種胚珠難以膨大轉綠。在黃瓜的研究中也表明，胚狀體的發生因基因型而異[4]，曹冰東等[5]選用的9個不同基因型的黃瓜在同一條件下進行離體培養，出胚率存在顯著差異，最高的為95.93%，最低的為8.15%。在西瓜中，李迎迎[6]發現，同一誘導培養基上，不同基因型材料的胚珠膨大率有很大的差別，且不同基因型材料胚狀體誘導率之間也存在著差異。榮文娟[7]的研究也表明，基因型對未受精胚珠離體培養的誘導有重要影響。在西葫蘆中也有研究表明，同一誘導條件下，不同基因型之間的出胚率有明顯差異[8-10]。說明在葫蘆科作物中，供體材料的基因型是影響離體雌核發育的關鍵因素，而基因型是不可改變的因素，某些基因型在未授粉子房離體培養過程中難以建立穩定性強和重復性好的體系，因此在未授粉胚珠子房離體培養中基因型的選擇至關緊要。

1.2 培養基與生長調節劑

在葫蘆科作物離體雌核培養研究中，大多選用固體培養基，且以MS作為基礎培養基，通常添加蔗糖和葡萄糖[11-13]。翟慶慧[14]發現，無論是未受精子房，還是未受精胚珠都是在以蔗糖為碳源時的誘導率更高，通常應用3%的蔗糖作為基本碳源[15-17]。而武習習[18]在2018年首次對南瓜未受精胚珠采用培養液振蕩法培養，并且胚珠愈傷組織基本全部轉綠。這說明培養液可能更加適合誘導未受精胚珠。

榮文娟等[19]發現，西瓜未受精胚珠與未受精胚珠誘導出的愈傷組織接種在不加任何外源激素的MS基本培養基上，全部褐化死亡，馮誠誠等[12]在苦瓜上也有類似發現。周霞等[11]也發現，黃瓜未受精子房切片在未添加激素的MS培養基上無明顯變化。在西葫蘆上，未添加激素也不能誘導出再生植株[8]。何婭[20]在南瓜中也有相同發現。前人的研究表明，不添加任何激素的MS培養基對胚珠的誘導作用很小，在培養過程中是需要一定種類及濃度的激素誘導的。在葫蘆科離體雌核發育過程中應用較多的激素有以下幾種。

2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）是誘導多種植物離體細胞轉變為胚性細胞的重要激素。在南瓜中，不少研究表明培養基中未添加一定濃度的2，4-D時，難以誘導胚狀體的形成，添加一定濃度的2，4-D就可以誘導出胚狀體[21-22]。而且2，4-D以較高質量濃度4 mg·L-1與其他生長調節劑組合使用時胚狀體誘導率較高[1，23]。說明2，4-D對南瓜離體雌核發育是重要的。但李玲等[24]在西瓜中發現，在只添加2，4-D的培養基上，愈傷組織不分化，不能獲得芽點。

TDZ（Thidiazuron，苯基噻二唑脲）是離體雌核發育過程中常用的生長調節劑。高寧寧等[25]研究發現，TDZ能夠促進胚狀體的形成，在0.03 mg·L-1時對甜瓜的誘導頻率最高。馮誠誠等[12]在苦瓜上也發現，在誘導培養基中添加TDZ有利于胚狀體的發育分化。而柯思佳[26]發現，在甜瓜中，試驗所選的3個不同基因型的材料以MS為基本培養基，不添加TDZ的雌核發育反應率分別為0、4%、8%，而添加0.02與0.04 mg·L-1的TDZ其雌核發育反應率為70%～98%，且0.04 mg·L-1的效果好于0.02 mg·L-1。李建欣等[27]在黃瓜中有類似的發現，在只含有一種激素TDZ的培養基中胚狀體很難分化為幼苗，應轉接到一定濃度6-BA和NAA的培養基中。唐桃霞等[28]在西葫蘆中也發現TDZ與NAA組合使用時比單獨使用時誘導效果更好，其中以0.05 mg·L-1 TDZ＋0.25 mg·L-1 NAA時效果最好。

AgNO3起到抑制乙烯活性的作用，培養基中加入適量的AgNO3，能起到促進愈傷組織器官發生或體細胞胚胎發生的作用。其對黃瓜未授粉子房培養中的胚狀體發生率起到積極作用[15，17，29]，在南瓜中，孫守如等[21]發現，沒有添加AgNO3的培養基的出胚率最高，顯著高于添加AgNO3的處理，隨著培養基中AgNO3濃度的增加，未受精胚珠的出胚數大幅下降，說明其對南瓜子房離體培養起到抑制作用[21]。唐桃霞等[28]發現，在西葫蘆未授粉子房離體培養過程中，AgNO3對胚狀體誘導不明顯，卻可以顯著減少玻璃化胚的發生，但質量濃度過高會影響胚狀體的發生。出現不同現象的原因可能是供體的種類與基因型不同，對AgNO3的敏感程度不一樣。

NAA、IAA、6-BA等也廣泛應用于葫蘆科作物離體雌核培養過程中，所使用的濃度、種類組合在不同的材料中有所不同[3，8，13-14，22，30]。唐桃霞等[31]發現，甜瓜胚珠膨大率與內源激素IAA含量呈極顯著正相關，說明IAA是參與植物生長發育的重要激素。程慧等[32]發現，在西葫蘆未受精子房的離體培養中，不添加6-BA、NAA或只添加其中任一種激素的處理均不能誘導出胚狀體，在2種激素共同存在時均能誘導出胚狀體。培養基中不同植物生長調節劑的種類和濃度配比對離體雌核發育的誘導有著極其重要的影響，適宜質量濃度的激素組合會比單獨一種激素的效果更佳。但是不同作物甚至不同品種所適用的植物生長調節劑的種類、濃度及組合有所不同，這需要在今后的研究中不斷地完善和更新。

1.3 不同預處理

對未受精子房接種之后進行預處理，不同的處理方法對未受精子房胚珠的誘導效果大不相同。有研究表明，在其他條件相同時，35° C黑暗熱激處理5 d的南瓜和西葫蘆未授粉子房胚珠的反應效果較好，胚珠膨大率和轉綠率較高[33-35]。李禹琪[36]和胡芳芳[37]分別發現，南瓜在38 ℃條件下熱激5 d、西葫蘆35 ℃黑暗熱激6 d時效果最佳。李建欣等[27]在黃瓜中發現，對3個不同基因型的黃瓜35 ℃熱激處理3 d時，胚狀體誘導率均達到最高值，而處理4 d的誘導率開始下降，5 d的為最低。郭曉雨等[38]研究發現，35 ℃熱激4 d時，黃瓜雌核啟動率最高。還有研究發現，黃瓜子房在4 ℃下處理4 d時，植株再生率最高[39]。榮文娟等[19]發現，西瓜以35 °C黑暗熱激3 d為宜，但也有研究發現，35 ℃熱激處理4 d的子房雌核啟動率和芽點率是最高的[24]。閔子楊等[40]研究發現，在35 ℃黑暗條件下熱激5 d時，西瓜胚珠出胚率較高。甜瓜在35 ℃熱激處理3 d時效果最好[25]，也有研究發現，熱激處理4 d時反應最好[26]，以上研究結果都證明，對西瓜、甜瓜胚珠離體培養較好的熱激溫度為35 ℃。牛明明[41]研究發現，在甜瓜中30 ℃暗培養3 d時為最佳熱激處理?？喙衔词诜圩臃繜峒?3 ℃處理3 d的誘導效果最好，有利于苦瓜胚狀體膨大和胚珠轉綠[12]。瓜類作物的最佳熱激處理的溫度和時間各不相同，可能是由于所選用的供體材料品種不同。Malik等[16]對溫度預處理和不同濃度TDZ之間的相互作用進行研究，發現0.04和0.02 mg·L-1的TDZ，都是4 ℃預冷處理比沒有溫度預處理的誘導胚狀體效果較好。

1.4 其他因素

在葫蘆科作物離體雌核培養過程中，還有供體栽培季節、子房發育階段等影響因素。有研究表明，秋季栽培條件下更有利于離體雌核誘導胚狀體的產生，秋播材料誘導頻率最高[42-43]。而魏愛民等[44]研究了黃瓜在不同生長季節離體雌核發育的單倍體胚胎發生率和植株再生率的區別，結果表明，在溫度相對較高的6月下旬、7月上旬以及9月份播種，其單倍體胚胎發生率及植株再生率明顯高于其他月份。韓麗華[45]研究發現，甜瓜離體雌核的誘導效果，春季好于秋季。陳解放[46]分析實質上是季節變化影響了植株的生活環境，進而改變了供體植株的生長狀態，改變了外植體的生理狀態，從而影響了未受精胚珠的誘導頻率。

陳學軍等[47]發現，其他誘導條件相同時，對西葫蘆開花當日、開花前3 d及開花后2 d的未受精胚珠的誘導率進行比較，發現開花當日的未受精胚珠愈傷組織的誘導率最高，達14.2%，開花前3 d的未受精胚珠次之，而開花后2 d的未受精胚珠最低。在南瓜中李禹琪[36]發現開花當天的外植體膨大轉綠率可達到100%，愈傷誘導率達57.5%，高于開花前1 d的膨大轉綠率85%及愈傷誘導率32.5%。閔子楊等[1]和孫守如等[21]也有類似的發現。但也有研究發現，開花前1 d與開花當日的胚珠膨大轉綠率相差不大[3，36]。而誘導子房片厚度為1 mm時，胚珠誘導效果較好[32，36]。

還有研究發現，西瓜未受精子房培養的最佳誘導時間為13 d[48]，找到合適的時間轉接胚狀體，也是提高誘導率的因素之一。

1.5 再生植株的馴化移栽

組培苗從所處的無菌環境到外界環境，光照、溫度、濕度等自然環境條件都發生了巨大的變化，幼苗需要一個適應過程。而再生植株的苗齡、質量、馴化方式、移栽時的溫度和基質對再生植株的成活率都有不同程度的影響。

在南瓜上，李石恒等[49]在其他條件相同的情況下分別在3、5、7片真葉時移栽組培苗，其中以5片真葉時移栽成活率最高。趙曉菲等[50]發現，西葫蘆再生苗長出5～6片真葉的再生植株適應性好，馴化移栽成活率高達90.0%，為再生苗馴化移栽的最佳時期。宋金亮[35]在西葫蘆上的煉苗方式為，先松瓶口煉苗2 d，再完全打開瓶口3 d，試管苗的移栽成活率最高達90%。甜瓜的組培苗生根后移栽到栽培基質中加蓋塑料薄膜保濕，在室溫中馴化1～2周[51]。施先鋒等[52]發現，甜瓜在溫室中煉苗5～7 d，逐漸加強光照，再移栽到大棚或大田中生長，成活率在85%以上。黃瓜再生植株在7 d左右短期馴化后可移栽田間[53]。宣楊等[54]對西瓜再生苗馴化3～5 d就移栽到無菌基質中，當長出2～3片新葉時栽到花盆中，成活率在90%以上。說明葫蘆科中不同作物的馴化移栽方式不盡相同，在今后找到適合各種作物馴化移栽的方法也尤為重要。

2 再生植株的倍性及加倍技術

2.1 再生植株的倍性

離體雌核培養后的再生植株均為單倍體是至關緊要的，再生植株理論上起源于胚囊細胞，所以再生植株應該是單倍體和自然加倍的雙單倍體，但也有可能是由珠心、珠被等體細胞發育而成的二倍體[55]，也存在自發形成多倍體植株的現象。

在西瓜上，李迎迎[6]得到4株完整的再生植株，通過倍性鑒定表明有1株是四倍體，其余3株是單倍體和二倍體的嵌合體植株。龔思等[42]利用染色體計數法與流式細胞儀檢測2種方法對36株再生植株進行了倍性鑒定，結果發現，其中35株為單倍體，只有1株為二倍體，這與Zou等[48]在西瓜單倍體培養試驗中再生植株倍性鑒定結果相似。西瓜離體雌核培養后的再生植株為單倍體的概率很大。

在南瓜上，閔子楊等[1]通過胚狀體發育成完整的幼苗，對其中移栽成活的35株再生植株進行倍性鑒定，結果發現有28株為二倍體或雙單倍體，7株為單倍體。孫守如[22]對5株南瓜進行根尖染色體觀察，結果表明，其中4株染色體處于30～40條之間，推測為混倍體，1株觀察到的最多染色體數為21條，判定此株為單倍體。武習習[18]獲得了胚狀體再生植株36株，其中有28株再生苗由未經秋水仙素處理的胚珠產生，8株由經秋水仙素處理的胚珠產生，這兩種情況下的再生植株都出現單倍體、二倍體或雙單倍體和多倍體或混倍體，其中單倍體數量最少。說明南瓜離體雌核再生植株為單倍體的比率較低。

周霞等[11]選用3份黃瓜供試材料通過離體雌核培養獲得再生植株，經流式細胞儀分析鑒定其倍性分別為單倍體、二倍體和四倍體。曹冰東等[5]獲得的再生植株分別被鑒定為單倍體、二倍體、雙單倍體及三倍體。高寧寧等[25]對3個甜瓜品種的再生植株進行倍性測定，結果顯示同時存在單倍體、二倍體、三倍體及混倍體，其中二倍體占比較大，在50%及以上，單倍體次之，三倍體和嵌合體占比最小。葫蘆科離體雌核發育過程中自發形成多倍體植株的現象很普遍，不同品種之間發生此現象的概率各不相同，其再生植株產生不同倍性的原因還需要進一步深入研究。

2.2 加倍技術

由于單倍體植株是高度不育的，為了在農業生產中發揮單倍體的實際價值，單倍體植株需要進行加倍。單倍體加倍技術主要有自發加倍和人工加倍，而染色體自發加倍的能力取決于物種和基因型[56]。目前，用于單倍體植株加倍的抗有絲分裂化學試劑有秋水仙堿、甲基氨丙磷（AMP）、普羅胺、普萘姆、米扎林和氟樂靈等，其最常見且應用最廣泛的方法就是秋水仙素處理。

在西瓜中，Sari等[57]用0.5%和1.0%秋水仙素處理西瓜單倍體植株1、2、4、6 h，結果表明0.5%秋水仙素處理4 h或1.0%秋水仙素處理2 h均可獲得二倍體植株。施先鋒等[58]也通過秋水仙素對3個不同西瓜品種的幼苗染色體進行加倍處理，結果表明，秋水仙素誘導3個品種均得到了四倍體，0.3%的秋水仙素處理幼苗的變異率較高，但3個品種的變異率不相同，其中以0.3%秋水仙素處理黃小玉母本的變異率最高，說明秋水仙素對不同品種的加倍效果不同。有人用不同濃度的秋水仙素和氟樂靈進行培養基加倍、浸芽加倍、滴生長點加倍3種加倍方法研究單倍體植株誘導二倍體植株的效果，浸芽法加倍效果最佳，其中秋水仙素誘導加倍時植株的存活率均達到100%，氟樂靈誘導加倍時植株的致死率最高達到100%，該結論表明秋水仙素更適用于單倍體植株加倍[59]。

在甜瓜中，賈媛媛等[60]對甜瓜單倍體進行不同方式的誘導處理，秋水仙素溶液離體浸泡和秋水仙素加入培養基離體培養甜瓜單倍體兩種方法誘導雙單倍體，試驗結果表明離體浸泡處理后植株的成活率較高，均在83%以上，其中0.025%秋水仙素溶液浸泡8 h的效果最好，0.1%秋水仙素溶液浸泡處理的效果較差，沒有得到加倍植株。薛皓等[61]研究發現，用秋水仙素對單倍體試管苗加倍時成株率較低，加倍效率僅有16.6%，而對移栽成活的單倍體植株加倍時用0.5%秋水仙素＋2%DMSO浸泡生長點2 h，成株率達100%、加倍效率達37.5%，主要原因可能是秋水仙素對幼嫩試管苗的毒害作用較大，使其生長點枯死，從而導致了整個植株的死亡；還發現1 mg·L-1 6-BA能同時提高單倍體再生率和自然加倍率。陳建偉[62]用不同濃度的秋水仙素對單倍體莖尖進行處理，發現在0.1%～1%的秋水仙素范圍內，秋水仙素處理質量分數越高，莖尖存活率越低，發現0.4%秋水仙素＋4%DMSO處理下部分植株成功實現了染色體加倍，加倍成功率為20%，秋水仙素質量分數在0.5%以上，存活率迅速降低，甚至全部死亡，因此秋水仙素質量分數在0.1%～0.4%之間比較適合單倍體加倍。說明秋水仙素對不同材料、不同單倍體植株部位的染色體加倍效果存在著差異。

章鵬等[63]以南瓜為材料將氟樂靈與秋水仙素進行比較，兩者的誘導率最高分別達到15%和13.3%，與孫守如[22]試驗得到的結果一致，雖然2種試劑差異并不顯著，但是氟樂靈價格相對低廉，且毒性較小，因此可以代替秋水仙素用于南瓜單倍體植株加倍。韓毅科[64]發現，在黃瓜雙單倍體誘導純合四倍體的加倍試驗中，0.2%秋水仙素＋1.5%DMSO滴苗處理，相對于另外添加羊毛脂膏的效果較明顯，加倍頻率達18.2%。

單倍體植株的加倍率因物種、采用的技術及誘導的方式不同而不同，在今后的研究中還需要不斷探究。目前，單倍體植株染色體加倍主要采用秋水仙素處理，但秋水仙素存在毒性較強、危及人體健康、污染環境、用量較大、價格較高等弊端，需要尋找安全、無污染、低價格的一些加倍試劑。對加倍技術進行不斷地完善和更新，使人們在今后的育種工作中更加容易、快速地獲得四倍體和雙單倍體。

3 問題與展望

目前，葫蘆科作物未授粉子房和胚珠離體培養雖取得了大量的研究成果，但大部分研究工作僅限于選擇適應的基因型、合適的培養基配方、預處理、供體栽培季節、子房發育階段等方面。對這些影響因素進行了初步闡述，發現這些影響因子并不是孤立存在的，各影響因素之間相互影響、相互制約，共同對葫蘆科作物雌核離體培養發育產生影響。但由于缺乏對誘導機制的理論研究，方法和效果都存在不穩定性，需要進一步完善。日后應從機制上進行深入的研究，加深對離體雌核誘導機制的認識，建立更完整的體系，為后續葫蘆科作物離體雌核發育的研究提供參考依據。

單倍體植株的馴化和加倍也尤為重要，其馴化結果和加倍效果，根據所采用的方法、技術和選用的材料不同也有所不同。在今后的試驗中還需要不斷的探索與發展。

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DOI：10.16861/j.cnki.zggc.202423.0705