基于SCoT分子標記的61份加工型黃瓜種質資源遺傳多樣性分析及DNA指紋圖譜構建

王宏利 趙久成 賴淼 盧家仕 凌啟昌 肖錦華 張華 付鑫鋒

DOI：10.16861/j.cnki.zggc.202423.0760

摘 ???要：為探明加工型黃瓜種質資源的親緣關系及遺傳多樣性，為新品種選育提供理論依據，采用目標起始密碼子多態性標記（SCoT）技術，以61份加工型黃瓜種質資源為試驗材料，進行遺傳多樣性分析并構建DNA指紋圖譜。結果表明，從100條SCoT引物中篩選出8條擴增條帶清晰、多態性高且重復性好的引物；利用篩選出的引物對61份黃瓜種質基因組DNA進行PCR擴增，共擴增出238個位點信息，其中多態性位點227個，平均多態性位點百分比為95.38%；采用NTSYS-pc 2.1軟件計算得出供試的61份材料間的遺傳相似系數分布在0.588～0.920之間，遺傳相似系數最小的材料分別是34號與55號，二者在瓜色、葉片形狀及果實形狀方面存在較大差異，說明兩者親緣關系最遠?；谶z傳相似系數對其進行UPGMA聚類分析和樹狀圖繪制，在相似系數0.735處，可將其劃分為7個類群，說明61份黃瓜種質材料背景存在差異，但多數地域來源相近、生境相似地區的種質被聚在同一類群。利用2對特異性較大的引物SCoT 12和SCoT 83構建的DNA指紋圖譜可單獨鑒別出61份黃瓜種質資源，該圖譜可為黃瓜分類與鑒定提供科學依據。

關鍵詞：黃瓜；SCoT分子標記；親緣關系；遺傳多樣性；DNA指紋圖譜

中圖分類號：S642.2?????????? 文獻標志碼：A??????????? ???????? 文章編號：1673-2871（2024）04-036-10

Genetic diversity analysis and DNA fingerprinting construction of 61 processed cucumber germplasm resources based on SCoT markers

WANG Hongli1， ZHAO Jiucheng1， LAI Miao1， LU Jiashi2， LING Qichang1， XIAO Jinhua3， ZHANG Hua4， FU Xinfeng1

（1.Qinzhou Branch of Guangxi Academy of Agricultural Sciences/Qinzhou Institute of Agricultural Sciences， Qinzhou 535000， Guangxi， China; 2. Institute of Flowers， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning? 530007， Guangxi， China; 3. Agricultural and Rural Service Center of Napeng Town， Qinnan District， Qinzhou 535015， Guangxi， China; 4. Agriculture and Rural Service Center of Beitong Town， Pubei County， Pubei 535321， Guangxi， China）

Abstract： In order to find out the genetic diversity of germplasm resources of processed cucumber and provide theoretical basis for the breeding of new varieties. the genetic diversity of 61 processed cucumber germplasm resources was analyzed and DNA fingerprinting was constructed using SCoT technique. The results showed that 8 primers with clear amplification bands， high polymorphism and good repeatability were selected from 100 SCoT primers. A total of 238 loci of 61 cucumber germplasm genomic DNA were amplified by PCR using the selected primers， of which 227 were polymorphic loci， and the average percentage of polymorphic loci was 95.38%. NTSYS-pc 2.1 software was used to calculate the distribution of genetic similarity coefficients among the 61 tested materials between 0.588 and 0.920， and the material with the smallest genetic similarity coefficients was 34 and 55， respectively. There were great differences in melon color， leaf shape and fruit shape， indicating that the two were most loosely related. Based on the genetic similarity coefficient， UPGMA cluster analysis and tree diagram were performed. At the similarity coefficient 0.735， they could be divided into 7 groups. The results indicated that 61 cucumber germplasm material backgrounds were different， but most of the germplasm sources were similar， and germplasm from similar habitats were grouped together in the same group. Sixty-one cucumber germplasm resources could be identified by DNA fingerprinting of SCoT 12 and SCoT 83， which could provide scientific basis for classification and identification of cucumber.

Key words： Cucumber; SCoT molecular marker; Genetic relationship; Genetic diversity; DNA fingerprinting

收稿日期：2023-12-07；修回日期：2023-12-22

基金項目：廣西壯族自治區科技先鋒隊“強農富民”“六個一”專項行動項目（桂農科盟 20230505）

作者簡介：王宏利，男，農藝師，研究方向為黃瓜、百香果栽培及育種。E-mail：whl@gxaas.net

通信作者：付鑫鋒，男，高級農藝師，主要從事黃瓜、百香果栽培與育種研究工作。E-mail：xfengf@gxaas.net

黃瓜（Cucumis sativus L.）是世界上主要蔬菜之一，也是我國保護地栽培面積最大的蔬菜作物，含有豐富的礦質營養和維生素，具有較高的食用價值、營養價值和藥用價值，深受消費者的喜愛[1]。加工型黃瓜指主要用于腌制加工的黃瓜，以白皮或黃皮黃瓜為主，特點是瓜條順直油亮、大小中等、色澤好。廣西北部灣地區種植加工型黃瓜歷史悠久，桂南地區的欽州市、北海市以得天獨厚的自然條件，加工黃瓜種植面積常年維持在1萬 hm2以上，其中尤以欽州市最具規模，種植面積占比可達70%。由于用于腌制加工的黃瓜沒有專用品種，生產上主栽品種以農家自留種為主，造成多數種質資源的遺傳背景不明確，品種同質化嚴重。且隨著復種指數的提高，傳統種植區域連作障礙凸顯，退化變異嚴重，導致雌花率低、產量低、品相差、抗病性弱等問題突出，嚴重制約了加工型黃瓜產業的健康可持續發展。因此，建立快速有效的加工型黃瓜種質資源創新評價體系，發掘優異基因，是亟待解決的關鍵問題。

黃瓜新品種培育一般通過形態學鑒定，從大量種質資源中選擇具有優良性狀的親本，通過雜交的方式培育新品種。黃瓜屬于雌雄同株異花授粉植物，雜交后代中存在著較多的遺傳變異，因此，只采用形態學、細胞學等傳統方法分析黃瓜的遺傳結構及親緣關系具有一定的局限性，也無法直接全面解釋其所具有的遺傳多樣性。隨著分子標記技術的出現和發展，極大地加速了植物科學分子層面的研究，多種標記已被廣泛用于作物種質遺傳多樣性研究[2]，為更好地研究黃瓜分子作用機制提供了新方法、新思路。目前，已有多種分子標記在黃瓜上得到了應用。Sahoo等[3]以11對ISSR引物對14個黃瓜基因型進行分子鑒定和遺傳多樣性分析，結果表明，14個黃瓜基因型間遺傳相似性介于0.36～0.83之間，種間差異較大；Manohar等[4]使用23條RAPD引物和18條ISSR引物對印度卡納塔克邦39份黃瓜種質資源的遺傳多樣性進行分析，篩選出CSC 83和CSC 71兩份優質材料；Innark等[5]使用20個ISSR標記對40份黃瓜種質資源進行分析，系統發育樹和主成分分析揭示黃瓜霜霉病與種質來源存在相關性；Mliki等[6]使用RAPD標記對來自阿爾及利亞、埃及、埃塞俄比亞、肯尼亞和利比亞等5個非洲國家的26份黃瓜種質資源的遺傳多樣性進行分析，認為類群一中的埃及種質具有獨特的遺傳變異；劉亞婷等[7]以48份黃瓜種質資源為材料，利用SRAP分子標記對其進行鑒定，得出了形態學標記和SRAP分子標記的聚類結果存在較大差異的結論。姚丹青等[8]利用SNP標記對市場上銷售的71份黃瓜品種進行遺傳多樣性分析，證明30個SNP位點的基因分型數據信息可以將71份黃瓜品種區分開來；史建磊等[9]以48份黃瓜自交系為試材，利用37對SSR引物對其進行聚類分析和指紋圖譜構建，以探究華南型黃瓜種質的遺傳多樣性及親緣關系。目標起始密碼子多態性標記（start codon targeted polymorphism，SCoT）由Collard等于2009年首次提出，是近年來廣泛用于種質鑒定和親緣關系分析的新型分子標記，具有穩定性強、多態性高、成本低廉及引物通用性高等優勢，在葡萄、核桃、鐵皮石斛、檸檬等多種經濟作物中得到了應用[10-14]，但在加工型黃瓜中尚未見到此類報道。筆者以加工型黃瓜主產區廣西欽州市及從山東省青島市、福建省福州市和廈門市等地收集來的61份優質種質資源作為研究對象，首次在加工型黃瓜上使用SCoT分子標記進行種質資源遺傳多樣性分析和親緣關系鑒定，旨在從分子生物學水平揭示加工型黃瓜種質資源遺傳多樣性信息，以期為加工型黃瓜種質資源分類、鑒定、保護和開發利用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

筆者從廣西欽州市、山東青島市及福建福州市和廈門市等黃瓜種植基地收集了61份加工型黃瓜種質材料，于2023年2月10日在廣西欽州市農業科學研究所久隆試驗基地種質資源圃內進行穴盤（72孔，53 cm×27 cm）育苗，后移植于溫室大棚內，每份材料各定植20株，定植間距50 cm，壟臺高度15 cm，定植后，澆足定植水后3 d內禁止澆水，3 d后澆1次緩苗水，溫室大棚內白天溫度控制在24～28 ℃，晚上溫度控制在13～15 ℃。在黃瓜結瓜期，每份材料采集植株嫩葉，液氮速凍后-80 ℃保存。黃瓜種質來源地及田間表型性狀特征見表1。

1.2 黃瓜材料DNA基因組提取

使用天根多糖多酚植物基因組DNA提取試劑盒（QIAGEN，Germany）從上述凍存的61份黃瓜葉片樣本中分別提取10 μg總DNA，以DNA濃度、純度及完整性為主要參考指標，使用Agilent2100 bioanalyzer對其進行質檢，質檢合格后，于-20 ℃冰箱保存備用。

1.3 引物篩選及SCOT-PCR擴增

試驗采用由北京擎科生物科技有限公司合成的100對SCoT通用引物序列，選用表型性狀差異較大的黃瓜種質DNA對其進行篩選，以擴增條帶清晰、多態性高、穩定性強為標準，篩選出特異性好質量高的引物對所有供試樣品進行PCR擴增。PCR擴增體系為上下游引物（10 μmol·L?1）各0.4 μL，cDNA模板1.0 μL，2×SG Green qPCR Mix 10.0 μL，ROX 0.4 μL，ddH2O 7.8 μL。擴增程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性20 s，55 ℃退火15 s，60 ℃復性30 s，72 ℃延伸5 min，共35個循環。擴增產物放置于4 ℃冰箱中保存。取10 μL PCR擴增產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，使用Bio-Rad全自動免染凝膠成像分析系統進行掃描拍照。

1.4 數據處理

對擴增后的SCoT條帶的有無進行標注統計，在同一遷移水平下，有DNA擴增條帶或弱帶的賦值為1，沒有條帶的賦值為0，構建二進制數據矩陣。將數據矩陣導入分子生物學統計軟件NTSYS-pc 2.1進行遺傳相似系數計算、UPGMA聚類分析及繪制樹狀圖。根據聚類結果，篩選出可鑒別供試材料的引物，使用該引物組合的二進制數據矩陣，手動構建DNA指紋圖譜。

2 結果與分析

2.1 DNA提取

Agilent2100 bioanalyzer平臺質檢結果顯示，提取的黃瓜DNA質量濃度在55～90 ng·μL-1之間，純度較高，無蛋白質和RNA污染，無拖尾現象，質量符合SCoT分子標記試驗要求（圖1）。

2.2 引物篩選與PCR擴增

采用表型性狀差異較大的34號和55號2份黃瓜基因組DNA對100對SCoT通用引物進行初步篩選，最終得到8對擴增效果較理想的引物（表2），利用該引物分別對所有黃瓜供試材料進行PCR擴增，擴增條帶分子質量范圍為100～5000 bp。共統計到清晰條帶238條，其中多態性條帶227條，多態性比率為95.38%；每對SCoT引物擴增條帶變化范圍在21～39條，平均為29.75條，多態性條帶變化范圍18～39條，平均為28.375條，每對SCoT引物擴增多態性百分率變幅為85.71%～100.00%。擴增條帶數最多的引物為SCoT 12，共擴增出39條條帶，最少的為SCoT 28，僅擴增出21條條帶。以上結果說明篩選出的SCoT引物多態性檢測效率較高且供試材料間的異質性較高，遺傳多樣性豐富，可用于對供試的黃瓜種質材料進行遺傳多樣性分析。圖2為SCoT12引物對所有供試材料DNA的PCR擴增結果。

2.3 黃瓜遺傳多樣性分析

利用8條引物擴增的條帶建立61份黃瓜種質資源的遺傳相似系數矩陣，計算獲得不同黃瓜種質材料的遺傳相似系數在0.588～0.920之間，平均為0.754，其中，34號與55號種質材料的遺傳相似系數最小，為0.588，他們在瓜色、葉片形狀及果實形狀方面存在較大差異，說明其親緣關系最遠。而46號與47號種質的相似系數最大，為0.920，他們在形態上較相似，說明其親緣關系相近。

2.4 61份黃瓜材料親緣關系分析

為了更直觀地展示不同品種的親緣關系，在獲得遺傳相似系數矩陣后，利用SHAN模塊中的UPGMA對61份供試材料進行聚類分析，并通過Tree plot模塊生成聚類樹狀圖。由圖3可知，8對SCoT引物的擴增結果在遺傳相似系數為0.735處將61份黃瓜種質聚為7個類群，A類群為34號；B類群為16號；C類群為29號；D類群為6號和7號；E類群為2、3和10號；F類群為13和49號；G類群為其他材料。A類群只有一份34號黃瓜材料，單獨聚為一類，該材料為從廣東省深圳市引進的優質栽培種，在田間農藝性狀表現為果實長圓筒形，果皮黃白色，葉緣呈全緣狀且具有強雌性，與其余種質材料表現出明顯的差異。2、3和10號聚為一類，其親緣關系可能較近。2號為從山東省青島市城陽區收集的材料，與3和10號材料中長棒果形和白綠色果色的外觀保持一致。16、29和34號單獨聚為一類，與其余58份黃瓜種質親緣關系較遠。在遺傳相似系數為0.765處將G類群51份種質聚為3個亞類，a亞類包括6份種質，為1、4、5、15、17和37號，b亞類僅有1份種質，編號為18，c亞類包括44份黃瓜種質。其中，46號和47號材料遺傳相似系數最大，可合理推斷在廣西靈山縣佛子鎮龍淵村種植的黃瓜品種為市場購買商品種而非廣西欽州市本地自留種，且可能與陽江市農村農資店售賣的種子為同一品種。從總體聚類結果來看，地域來源相近、生境相似地區的廣西原產黃瓜種質資源遺傳關系較近，它們大部分被聚在同一類群內，具有一定的地域分布規律。

2.5 61份黃瓜種質構建DNA指紋圖譜

通過篩選出的8對SCoT引物對61份黃瓜種質的擴增，結果表明，結合特異性引物的條帶分辨率及重復性高低，比對發現引物SCoT 12和SCoT 83均可單獨鑒別出61份加工黃瓜種質資源。以黑色表示該位點有條帶，無色表示該位點無條帶，使用引物SCoT 12和SCoT 83繪制該供試材料的DNA指紋圖譜（圖4和圖5）。其指紋圖譜反映了供試的每份種質都有唯一的擴增譜帶，通過其指紋圖譜可快速地區分黃瓜種質類型并將其準確鑒定出來。

3 討論與結論

廣西欽州市是全國加工型黃瓜的發源地，也是全國主要種植集中地，種質資源地方特征明顯，品種混雜，如何對當地主栽優質品種進行分類、鑒定且有效利用所蘊藏的優異基因，開展分子設計育種，從而快速定向對其進行品種改良及創新，是當前黃瓜育種工作的方向。

DNA分子標記技術能有效地結合作物的表型和基因型對物種間的遺傳多樣性進行鑒定，且比傳統的表型性狀更科學準確，是檢測種質資源遺傳多樣性的有效工具，可顯著提高育種效率。目前用于輔助育種和種質資源遺傳多樣性評價較為廣泛的分子標記有RFLP、RAPD、SSR、ISSR、SCAR、IPBS、AFLP和SCoT等[15-18]。SCoT是一種基于翻譯起始點位的新型目的基因分子標記，他不僅能獲得與性狀聯系緊密的目的基因，而且能對性狀進行跟蹤。同其他類型的遺傳標記相比，SCoT標記具有操作簡單、成本低廉、多態性高、引物通用性強等優點，能有助于更好地從分子水平上揭示不同種質資源的遺傳背景及種間的親緣關系[19]。在筆者的研究中，使用SCoT分子標記分析了61份黃瓜種質資源，結果表明，8對SCoT引物共擴增出238條清晰的條帶，其中227個具有多態性，多態性條帶比率值為95.38%，高于前人利用其他分子標記對黃瓜相關種質進行遺傳多樣性評價的結果。張桂華等[20]以23份不同來源的黃瓜材料進行AFLP分析，多態性條帶比率值為19.5%；王惠哲等[21]對4種不同類型28份黃瓜種質材料利用49對SRAP引物進行遺傳差異分析，多態性條帶比率值為46.5%；金慶敏等[22]以50份來自全國各地的黃瓜核心種質資源為試驗材料，利用32對SSR引物進行遺傳多樣性分析，多態性條帶比率值為77.1%。以上結果說明與其他類型分子標記相比，SCoT分子標記應用在黃瓜種質上具有豐富的多態性，檢測出多態性位點較豐富，能為黃瓜種質的初步鑒定、遺傳多樣性分析及DNA指紋圖譜構建等研究奠定基礎。

種質資源是種業原始創新的物質基礎，突破性新品種的育成多來自于特異優良遺傳資源的發現和利用。有研究認為生態環境的差異會導致作物種質在長期進化過程中逐步演化出不同的種群和變異種[23]。筆者研究的種質資源采集于自然氣候條件差異較大的不同省份，氣候的多樣化和地形的錯綜復雜可能促使黃瓜種質具有更高的遺傳多樣性。聚類結果表明，從國內不同區域收集來的61份黃瓜種質材料可劃分為七大類群，種質資源間的遺傳相似系數分布在0.588～0.920之間。王蕾等[24]對來源不同的32份黃瓜栽培品種使用17對多態性高、條帶清晰的SSR引物進行遺傳多樣性分析，遺傳相似系數分布在0.560～0.947之間；姚丹青等[8]基于SNP標記對71份黃瓜品種進行遺傳多樣性分析，遺傳相似系數分布在0.403 2～0.983 9之間；盧霞等[25]利用InDel標記對48份黃瓜自交系進行遺傳多樣性分析，遺傳相似系數分布在0.44～1.00之間。筆者的研究結果與以上SSR、SNP及InDel 3種分子標記分析結果大體一致，都表明黃瓜種質資源間遺傳多樣性較為豐富。因此，在進行黃瓜種質資源創新利用時，為拓寬遺傳基礎的范圍，應從華南和華北黃瓜主栽區氣候條件差異較大的區域內開展優異種質的引進，充分挖掘和利用多樣化地方品種和引進的外來優異種質，從而為黃瓜優良種質的篩選和改良提供種源支撐。

DNA指紋圖譜集精確、簡單快速和受時空條件限制小等優點，是鑒別作物品種、品系的有力工具，已廣泛應用于多種作物的品種資源多樣性和純度鑒定研究。目前植物DNA指紋圖譜的構建有引物組合法、單引物法和特征譜帶法3種方式[26]。由于黃瓜種質資源具有較為復雜多樣的遺傳背景，基于黃瓜瓜色、瓜型和雌性強弱的傳統形態學鑒定方法往往難以區分不同種質之間的遺傳差異。筆者從8對擴增引物中篩選出SCoT 12和SCoT 83兩對遺傳多態性較高的SCoT引物，使用特征譜帶法構建了61份黃瓜種質的DNA指紋圖譜，每份種質都有其唯一對應的DNA指紋圖譜。指紋圖譜能有效地對黃瓜種質資源進行精準鑒定和評價，有助于發掘和利用黃瓜種質資源的遺傳多樣性，從而提高其品種選育的效率和成功率。

綜上所述，筆者的研究明確了61份加工型黃瓜種質資源的遺傳變異相近程度，使用的8對SCoT引物，共擴增出238個位點信息，其中多態性位點227個，具有較多的遺傳信息，構建的指紋圖譜能快速準確地鑒定不同黃瓜品種材料。研究結果為加工型黃瓜種質資源評價、鑒定和新品種選育奠定了重要基礎。

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